Quantification simultanée de kynurenines sélectionnées analysées par chromatographie liquide-spectrométrie de masse dans le milieu recueilli à partir des cultures de cellules cancéreuses

Décrit ici est un protocole pour la détermination de quatre métabolites différents de tryptophane produits dans la voie de kynurenine (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, acide xanthurenic, acide 3-hydroxyanthranilic) dans le milieu recueilli des cultures de cellules cancéreuses analysées par chromatographie liquide couplée à une spectrométrie de masse quadrupole simple.

La voie kynurenine et les catabolites de tryptophane appelées kynurenines ont reçu une attention accrue pour leur participation à la régulation immunitaire et à la biologie du cancer. Un test de culture cellulaire in vitro est souvent utilisé pour en apprendre davantage sur la contribution de différents catabolites tryptophane dans un mécanisme de la maladie et pour tester des stratégies thérapeutiques. Le milieu de culture cellulaire qui est riche en métabolites sécrétés et molécules de signalisation reflète l’état du métabolisme du tryptophane et d’autres événements cellulaires. De nouveaux protocoles pour la quantification fiable de kynurenines multiples dans le milieu complexe de culture cellulaire sont souhaités pour permettre une analyse fiable et rapide de plusieurs échantillons. Ceci peut être accompli avec la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse. Cette technique puissante est utilisée dans de nombreux laboratoires cliniques et de recherche pour la quantification des métabolites et peut être utilisée pour mesurer les kynurenines.

Présente ici est l’utilisation de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse quadrupole unique (LC-SQ) pour la détermination simultanée de quatre kynurenines, c.-à-kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, et acide xanthurnique dans le milieu recueilli à partir de cellules cancéreuses en culture in vitro. Détecteur SQ est simple à utiliser et moins cher par rapport à d’autres spectromètres de masse. Dans l’analyse SQ-MS, plusieurs ions de l’échantillon sont générés et séparés en fonction de leur rapport masse-charge spécifique(m/z),suivi de la détection à l’aide d’un mode de surveillance ion unique (SIM).

Cet article attire l’attention sur les avantages de la méthode signalée et indique certains points faibles. Il est axé sur des éléments critiques de l’analyse LC-SQ, y compris la préparation de l’échantillon ainsi que la chromatographie et l’analyse de spectrométrie de masse. Le contrôle de la qualité, les conditions d’étalonnage des méthodes et les problèmes d’effet matriciel sont également discutés. Nous avons décrit une application simple de 3-nitrotyrosine comme norme analogique pour tous les analytes cibles. Comme le confirment les expériences menées auprès d’ovaires humains et de cellules cancéreuses du sein, la méthode LC-SQ proposée génère des résultats fiables et peut être appliquée à d’autres modèles cellulaires in vitro.

Kynurenine pathway (KP) est la voie principale du catabolisme tryptophane (Trp) dans les cellules humaines. L’indoleamine-2,3-dioxygénase (IDO-1) dans les cellules extrahépatiques est la première enzyme limitative de KP et convertit Trp en N-formylkynurenine¹. D’autres étapes au sein de KP génèrent d’autres métabolites secondaires, à savoir les kynurenines qui présentent diverses propriétés biologiques. Kynurenine (Kyn) est la première catabolite Trp stable montrant des propriétés toxiques et régulant les événements cellulaires après s’être liant au récepteur des hydrocarbures aryl (AhR)². Par la suite, Kyn est transformé en plusieurs molécules spontanément ou dans les processus à base d’enzymes, générant de tels métabolites comme la 3-hydroxykynurenine (3HKyn), l’acide anthranilique (AA), l’acide 3-hydroxyanthranilic (3-HAA), l’acide kynurnique (Kyna), et l’acide xanthurnique (XA). Un autre métabolite en aval, 2-amino-3-carboxymuconic acid-6-semialdehyde (ACMS), subit une cyclisation non enzymatique à l’acide quinolinique (QA) ou à l’acide picolinique (PA)¹. Enfin, qa est encore transformé en nicotinamide-adénone dinucléotide (NAD⁺)³, le métabolite KP point final qui est un cofacteur enzyme important. Certaines kynurenines ont des propriétés neuroprotectrices telles que Kyna et PA, tandis que les autres, c’est-à-dire 3HAA et 3HKyn, sont^{toxiques 4}. L’acide xanthurétique, qui est formé à partir de 3HKyn, présente des propriétés antioxydantes et vasorelaxation⁵. XA s’accumule dans les lentilles vieillissantes et conduit à l’apoptose des cellules épithéliales⁶. KP, décrit au milieu du^{20ème siècle, a} gagné plus d’attention quand son implication dans divers désordres a été démontrée. L’activité accrue de cette voie métabolique et l’accumulation de certaines kynurènes modulent la réponse immunitaire et sont associées à différentes conditions pathologiques telles que la dépression, la schizophrénie, l’encéphalopathie, le VIH, la démence, la sclérose latérale amyotrophique, le paludisme, la maladie d’Alzheimer, la maladie de Huntington et le cancer^4,7. Quelques changements dans le métabolisme de Trp sont observés dans les microenvironnements de tumeur et les cellules^{cancéreuses 2,8.} En outre, les kynurenines sont considérées comme des marqueurs prometteurs^{de la maladie 9}. Dans la recherche sur le cancer, les modèles de culture cellulaire in vitro sont bien établis et largement utilisés pour l’évaluation préclinique des réponses aux médicaments anticancéreux¹⁰. Les métabolites de Trp sont sécrètes par les cellules dans le milieu de culture et peuvent être mesurés pour évaluer l’état de la voie kynurenine. Par conséquent, il est nécessaire de développer des méthodes appropriées pour la détection simultanée du plus grand nombre possible de métabolites KP dans une variété de spécimens biologiques avec un protocole facile, flexible et fiable.

Dans cet article, nous décrivons un protocole pour la détermination simultanée de quatre métabolites de voie de kynurenine : Kyn, 3HKyn, 3HAA, et XA par LC-SQ dans un milieu post-culture rassemblé des cellules cancéreuses. Dans une approche analytique moderne, la chromatographie liquide^13,14,15,16 est préférée pour la détection et la quantification simultanées des catabolites tryptophanes individuels, contrairement aux analyses biochimiques non spécifiques utilisant le reagent Ehrlich^11,12. À l’heure actuelle, il existe de nombreuses méthodes disponibles pour la détermination des kynurenines chez les spécimens humains, principalement à base de chromatographie liquide avec des détecteurs d’ultraviolets ou de fluorescence^13,17,18,19. La chromatographie liquide couplée à un détecteur de spectrométrie de masse (LC-MS) semble plus adaptée à ce type d’analyse, en raison de leur sensibilité plus élevée (limites inférieures de détection), de sélectivité et de répétabilité.

Les métabolites de Trp ont déjà été déterminés dans le sérum humain, le plasma et^{l’urine 13,20,21,22,23,}cependant, les méthodes pour d’autres spécimens biologiques, comme le milieu de culture cellulaire sont également désirées. Précédemment, LC-MS a été employé pour des composés Trp-dérivés dans un milieu rassemblé après culturisation des cellules humaines de gliome, des monocytes, des cellules dendritiques ou des astrocytes traités avec le gamma d’interféron (IFN-γ)^24,25,26. Actuellement, il est nécessaire de nouveaux protocoles validés qui peuvent permettre une évaluation de plusieurs métabolites dans différents médias culturels, cellules et traitements utilisés dans les modèles de cancer.

Le but de la méthode développée est de quantifier (en une seule course analytique) quatre kynurenines majeures qui peuvent indiquer des anomalies dans KP. Présentés ici sont des étapes critiques de notre protocole récemment publié pour l’analyse quantitative LC-SQ de certaines kynurenines significatives en utilisant une norme interne (3-nitrotyrosine, 3NT) dans le milieu recueilli à partir de cellules cancéreuses humaines in vitro ^{cultivés 27}. À notre connaissance, c’est le premier protocole LC-SQ pour la quantification simultanée de 3HKyn, 3HAA, Kyn et XA dans un milieu de culture obtenu à partir des cellules cultivées in vitro. Sur certaines modifications, la méthode pourrait être appliquée davantage pour étudier les changements dans le métabolisme de Trp dans un plus large éventail de modèles de culture cellulaire.

1. Préparation des solutions standard 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA standard stock

1. Peser les réagenouillements dans un flacon avec la plus grande précision (0,3 mg chacun). Pour une meilleure précision, augmenter les reagents, en ajustant le volume du solvant en fonction de l’étape 1.2.
2. Dissoudre les reagents dans 300 μL du solvant pour obtenir une solution de stock de 1 g/L. Dissoudre 3NT en acide formique (FA) de 1 % (v/v) dans l’eau; Kyn, 3HAA, et XA dans le sulfoxyde de diméthyle (DMSO); 3HKyn dans l’eau acidifiée au pH 2.5 avec de l’acide chlorhydrique (HCl).
   ATTENTION: 3HAA irrite les yeux, le nez, la gorge et les poumons. Il est nocif lorsqu’il est inhalé, en contact avec la peau, et s’il est avalé. Portez une protection appropriée, c’est-à-dire des gants et un masque.
3. Fermez étroitement le flacon et placez-le dans un bain ultrasonique pendant 1 min pour accélérer la dissolution.
   REMARQUE : Stockez les solutions de stock à -20 °C et réduisez au minimum le gel/décongélation (3 cycles max) en raison de l’instabilité des solutions de stock.

2. Préparation du milieu de culture traité au charbon de bois

1. Dans un tube, peser 280 mg de charbon actif et ajouter 5 mL du milieu liquide préparé pour la culture des cellules d’intérêt.
2. Secouez le tube avec le milieu et le charbon de bois sur une scie à voir rocker pendant 2 h, à température ambiante (réglez la vitesse à 50 oscillations/min). Ensuite, centrifuger les tubes à 6000 x g pendant 15 min.
3. Retirer le tube de la centrifugeuse et recueillir soigneusement le supernatant sans déranger les sédiments. Répétez la centrifugation si nécessaire, pour éliminer tous les résidus de charbon de bois.
4. Filtrer le supernatant à l’aide d’un filtre seringue de 0,45 μm.
5. Assurez-vous que le milieu de culture prétraité au charbon de bois est privé de traces de kynurenines en exécutant un échantillon pilote sur la LC-MS tel que décrit à l’étape 6.3.2. Sinon, répétez les étapes 2.1-2.4.
   REMARQUE : Si le milieu de culture complet ne contient pas initialement de kynurenines, l’étape de purification à l’aide de charbon de bois pourrait être omise. Dans ce cas, préparez des normes d’étalonnage et des échantillons de contrôle de la qualité à l’aide du milieu complet habituellement préparé pour la culture cellulaire.
6. Conserver le milieu préparé à 4 °C jusqu’à l’analyse.

3. Faire les solutions d’étalonnage et les courbes d’étalonnage

1. Piquer le milieu de culture prétraité au charbon de bois avec 0,75 μL de solution 0,1 g/L 3NT et ajouter quatre normes (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) au moins à six concentrations différentes pour couvrir les plages d’étalonnage. Gardez le volume final de chaque échantillon à 150 μL. Vortex bien. Utilisez des tubes de centrifugeuse de 1,5 mL pour la préparation de l’échantillon.
   NOTE: Points d’étalonnage suggérés pour 3HKyn: 0.018, 0.045, 0.22, 1.12, 2.23, 4.46 μmol/L; pour Kyn: 0.0096, 0.048, 0.24, 1.20, 2.40, 3.84 μmol/L; pour 3HAA: 0.033, 0.16, 0.65, 3.27, 6.53, 13.06 μmol/L; pour XA: 0.019, 0.13, 0.49, 1.22, 3.65, 4.87 μmol/L.
2. Ajouter 150 μL de méthanol froid (conservé à -20 °C) contenant 1 % (v/v) d’acide formique dans chaque tube pour la déprotéinisation de l’échantillon. Fermez bien les tubes et le vortex.
3. Incuber les échantillons à -20 °C pendant 40 min.
4. Centrifuger les échantillons à 14 000 x g pendant 15 min à 4 °C. Retirer les tubes de la centrifugeuse. Recueillir des supernatants dans les nouveaux tubes. Ne pas déranger les sédiments.
5. Transférer 270 μL du supernatant dans le flacon de verre à l’aide d’une pipette automatique. Mettre les flacons dans l’évaporateur et évaporer doucement jusqu’à ce qu’ils soient secs. Utilisez le programme approprié pour les fractions d’eau et de méthanol pour évaporer les composants volatils. N’appliquez pas une température supérieure à 40 °C et évitez le sursèchement.
   REMARQUE : Les flacons de verre à fond plat, c’est-à-dire les flacons chromatographiques facilitent une évaporation plus rapide et des récupérations plus élevées par rapport aux tubes coniques en plastique.
6. Après 30 min, vérifiez l’état d’évaporation. Si nécessaire, poursuivre l’évaporation (p. ex., ajouter 10 min de plus). Évitez le sursèchement.
7. Retirer les flacons de l’évaporateur. Reconstituer chaque échantillon dans 60 μL d’acide formique de 0,1 % (v/v) dans l’eau. Ajouter le solvant dans le flacon contenant le matériau résiduel. Fermez étroitement les flacons et vortex-bien.
8. Transférer l’échantillon dans un tube de 1,5 mL et faire tourner à 14 000 x g pendant 15 min à 4 °C pour séparer la protéine précipitée.
9. Sans perturber la pastille protéique, transférer les supernatants en flacons chromatographiques avec des inserts en verre conique avec une pipette automatique. Fermez bien les fioles.
10. Vérifiez la présence de bulles d’air dans le flacon d’insertion et retirez-les si nécessaire (p. ex., par vortex).
11. Transférez les flacons chromatographiques contenant des échantillons dans l’autosampler LC. Enregistrez la position des échantillons placés dans un bac d’autosampler.

4. Préparation d’échantillons de contrôle de la qualité (QC)

1. Piquer le milieu de culture prétraité au charbon de bois (préparé dans un tube centrifuge de 1,5 ml) avec 0,75 μL de solution 0,1 g/L 3NT et les normes de quatre kynurenines (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) à une concentration sélectionnée à partir de la gamme linéaire des courbes d’étalonnage. Gardez le volume final de l’échantillon à 150 μL.
   REMARQUE : Le cas échéant, préparez plusieurs échantillons de QC à différentes concentrations tombant sous la plage linéaire de la courbe d’étalonnage.
2. Suivez le protocole décrit à la section 3 (étapes 3.2-3.11).

5. Mise en place du système LC-MS

1. Préparer les solvants de phase mobiles : Solvant A : format ammonium de 20 mmol/L dans de l’eau ultrapure (pH 4.3 ajusté à l’acide formique); Solvant B: 100% acétyltrile.
   REMARQUE : N’utilisez que des bouteilles en verre borosilicate. Rincer les bouteilles à l’eau ultrapure avant de la remplir. N’utilisez pas de bouteilles nettoyées avec des détergents.
   ATTENTION: L’acétyltrile provoque de graves effets sur la santé ou la mort. Il est facilement enflammé par la chaleur. Le liquide et la vapeur d’acétylisation peuvent irriter les yeux, le nez, la gorge et les poumons.
   1. Préparer une solution de bouillon de 5 mol/L de format ammonium en dissolvant un réapprovisionnement cristallin (15,77 g) dans 50 mL d’eau ultrapure dans une bouteille en verre. Remuer jusqu’à ce que tous les résidus se dissolvent. Filtrer à travers la membrane de 0,45 μm pour enlever les débris résiduels (p. ex., à l’aide d’un filtre à seringues en nylon). Conserver la solution de stock à 4 °C.
   2. Préparer le solvant A en ajoutant 4 mL de 5 mol/L ammonium formate dans l’eau à 980 mL d’eau ultrapure dans une bouteille en verre ambré et bien mélanger. Immerger une barre d’agitation et mettre la bouteille avec le solvant sur un agitateur magnétique. Immerger une électrode de pH dans la solution et contrôler le pH en remuant. Ajouter la solution de stock d’acide formique (98%-100%) dropwise à l’aide d’une pipette automatique avec pointe de 0,2 mL pour obtenir le pH 4.3, ajuster le volume jusqu’à 1 L avec de l’eau ultrapure et bien remuer.
      REMARQUE : Préparez les solvants au moins une fois par semaine pour éviter toute croissance microbienne.
      MISE EN GARDE : L’acide formique (FA) est toxique lorsqu’il est inhalé, provoque des brûlures de la peau et des lésions oculaires. Travailler sous le capot de fumée; porter des gants de protection et du manteau.
   3. Filtrer toutes les solutions à travers la membrane de 0,22 μm (p. ex., filtre à seringues en nylon) pour éliminer les débris résiduels. En option, utilisez les filtres d’entrée de solvants dédiés aux réservoirs de solvants LC pour protéger le système contre les particules entrantes.
2. Démarrez un logiciel de contrôle et d’acquisition de données LC-MS.
3. Purgez le système LC avec la phase mobile pour éliminer les bulles, et pour amorce tous les canaux solvants.
4. Ensemble d’une colonne de garde pour protéger la colonne analytique de l’engorgement.
5. Rincer le garde et la colonne analytique (C18, 2,1 x 100 mm, 1,8 μm) avec 100% d’acétyonitrile pendant environ 30 min, puis avec 100% de solvant A jusqu’à ce qu’une pression stable dans la colonne soit observée. Contrôlez les performances du système à l’aide du logiciel de contrôle.
6. Définissez les paramètres LC appropriés dans le logiciel d’acquisition de données.
   1. Configurer le programme de gradient: 0-8 min solvant B 0%; 8-17 min solvant B 0-2%; 17-20 min solvant B 2%; 20-32 min solvant B 10-30%; 32-45 min solvant B 0%.
   2. Réglez le débit de phase mobile à 0,15 mL/min, le temps total d’analyse pendant 45 min, la température de la colonne à +40 °C et le volume d’injection à 10 μL.
7. Définissez les paramètres d’acquisition du détecteur de spectrométrie de masse.
   1. Appliquer les paramètres d’ionisation : surveillance ionique unique (SIM), ionisation positive, pression nébuliseur de 50 psi, température de séchage du gaz de +350 °C, séchage du débit de gaz de 12 L/min et tension capillaire de 5 500 V.
   2. Sélectionnez les ions de surveillance analyte : pour 3HKyn m/z 225.0 (période de balayage : 2-6 min, tension fragmentaire : 100 V); pour Kyn m/z 209.0 (période de balayage : 6-12 min, tension fragmentaire : 80 V); pour 3HAA m/z 154.0 (période de balayage : 12-18 min, tension fragmentaire : 80 V); pour 3NT m/z 227.0 (période de balayage : 18-23 min, tension fragmentaire : 100 V); pour XA m/z 206.0 (période de balayage : 23-45 min, tension fragmentaire : 100 V).
8. Construisez une liste de travail et exécutez des échantillons sur le système LC.
9. Dans un premier temps, avant l’analyse des échantillons expérimentaux, exécuter un échantillon vierge (Solvant A) au moins dans les triplicates, suivie d’un échantillon qc.
10. Ouvrez le logiciel d’analyse des données et chargez les résultats obtenus pour l’échantillon qc.
11. Vérifiez la position des pics analytes sur le chromatogramme. Lorsque les signaux se déplacent au-delà de la position prévue, ajustez les portes de temps pour la collecte appropriée des signaux analyte. Consultez le manuel logiciel pour obtenir des instructions sur l’intégration du signal.

6. Construction de la courbe d’étalonnage

1. Dans le logiciel d’acquisition de données, ajoutez des normes d’étalonnage dans la liste de travail et exécutez les normes dans les triplicates.
2. Intégrer et mesurer la zone de pointe correspondant à 3HKyn, Kyn, 3HAA, 3NT et XA au temps de rétention d’environ 4,4 min, 10 min, 16 min, 21 min et 30 min, respectivement.
3. Construisez des courbes d’étalonnage individuelles pour chaque métabolite à l’aide d’un programme de feuilles de calcul.
   1. Pour créer le graphique d’étalonnage, tracez la valeur d’un rapport entre la zone de pointe analyte et la zone de pointe 3NT par rapport à la concentration de l’analyte.
   2. Analyser l’échantillon vierge (milieu de culture prétraité au charbon de bois à pointes seulement avec 3NT) pour s’assurer qu’il n’y a aucune trace des analytes étudiés dans le milieu. Sinon, soustrayez la valeur obtenue de chaque point d’étalonnage.
   3. Vérifiez la linéarité de chaque courbe d’étalonnage.
      1. Individuellement, pour chaque analyte, créer une équation linéaire d’interception de pente (y = hache +b), où y correspond au rapport de la zone de pointe analyte par rapport à la zone de pointe 3NT, a est la pente, x est la concentration d’analyte (μmol/L), et b se réfère à l’interception de courbe. Tracer le graphique « y » par rapport à « x » générera la courbe d’étalonnage.
      2. Ajoutez une ligne de tendance linéaire au graphique, affichez l’équation de la courbe d’étalonnage et le coefficient de régression sur le graphique. Assurez-vous que le coefficient de régression est > 0,990. En cas d’étalonnage inégalé, préparez-les et/ou analysez-les une fois de plus. En option, modifiez la plage de concentration de la courbe d’étalonnage.
   4. Analyser les échantillons qc pour vérifier les performances du système avant d’analyser les échantillons expérimentaux. En cas d’incompatibilité (± écart de 20% par rapport à la valeur de référence), préparez les nouvelles courbes d’étalonnage.

7. Culture cellulaire in vitro et collecte d’échantillons aux fins d’analyse

1. Plaquez les cellules cancéreuses étudiées (MDA-MB-231 ou SK-OV-3) dans DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) contenant 4,5 g/L de ᴅ-glucose, 10% (v/v) sérum bovin fœtal (FBS), 2 mmol/L ʟ-glutamine et 1 U pénicilline/streptomycine et culture à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO₂ pour les étendre pour l’expérience. Passer les cellules à 80% de la confluence.
2. Détachez les cellules du plat de culture à l’aide de trypsine, graines pour l’expérience sur des plaques de 12 puits à une densité de 0,3 × 10^{6 cellules} par puits et placer dans un incubateur pendant la nuit.
3. Le lendemain, aspirez le milieu de la culture et ajoutez du DMEM frais avec ou sans l’ajout des composés étudiés, selon la conception expérimentale.
4. Après 48 h, recueillir le milieu au-dessus des cellules (environ 500 μL) dans un tube de 1,5 mL. Centrifugeuse à 14 000 x g pendant 5 min pour enlever les débris cellulaires. Recueillir le surnatant et le conserver à -80 °C jusqu’à l’analyse.
5. Économisez la pastille cellulaire de l’étape 7.4 pour l’estimation des protéines. Congeler les échantillons à -20 °C.
   REMARQUE : Les résultats obtenus pour un milieu provenant de différents puits devraient être normalisés pour tenir compte de la variabilité du nombre de cellules dans les puits individuels. La concentration en protéines peut être évaluée telle que décrite à l’étape 9.

8. Préparer des échantillons pour l’analyse LC-MS

1. Décongeler l’échantillon congelé à température ambiante et bien mélanger. Transférer 149,25 μL du milieu de culture dans un tube de centrifugation (1,5 mL).
2. Ajouter 0,75 μL de 0,1 g/L de solution 3NT (norme interne). Fermez bien les tubes et le vortex.
3. Ajouter 150 μL de méthanol réfrigéré à -20 °C contenant 1 % (v/v) fa pour la déprotéination de l’échantillon. Fermez bien les tubes et le vortex.
4. Poursuivre la préparation de l’échantillon tel que décrit à la section 3 (étapes 3.3-3.11).
   REMARQUE : Certaines cellules cancéreuses comme SK-OV-3 sécrètent de grandes quantités de Kyn dans un milieu de culture. Pour intégrer les données dans une plage linéaire de la courbe d’étalonnage, une dilution d’environ 100 fois de l’échantillon est nécessaire. Dans ce cas, diluer une partie de l’échantillon avec 0,1 % (v/v) FA dans l’eau et analyser en plus de l’échantillon non dilué. Les échantillons de référence des normes pour la courbe d’étalonnage devraient être préparés en milieu de culture complet 100 fois dilué. Sinon, ajoutez plus de points dans la courbe d’étalonnage (si une solubilité et une linéarité appropriées sont obtenues) pour l’ajuster au niveau de concentration de Kyn dans l’échantillon expérimental.
5. Analyser les échantillons de LC-MS tels que décrits à la section 5. Construisez une liste de travail et exécutez chaque échantillon en triplicate.
6. Une fois la liste de travail terminée, mesurez la zone maximale de l’analyte.
7. Générer une feuille de calcul à l’aide du logiciel disponible et obtenir des données numériques.
8. Dans une colonne de feuille de calcul calculer le rapport de la zone de pointe analyte sur la zone de pointe 3NT.
9. Utilisez une équation d’étalonnage linéaire individuelle dédiée à chaque analyte (à partir de l’étape 6.3.) pour calculer les concentrations d’analytes présentes dans les échantillons expérimentaux.

9. Évaluation de la teneur en protéines et de la normalisation des données

1. Resuspendez la pastille cellulaire de l’étape 7.5 avec 100 μL de solution saline tamponnée de phosphate (PBS) dans le tube de 1,5 mL.
   REMARQUE : Préparez la solution PBS en dissolvant 8 g de chlorure de sodium, 0,2 g de chlorure de potassium, 1,44 g de phosphate de sodium dibasic, phosphate de dihydrogène de potassium dans 950 mL d’eau ultrapure. Bien mélanger. Réglez le pH à 7,4 avec de l’acide chlorhydrique (dropwise). Ajustez le volume jusqu’à 1 L avec de l’eau ultrapure. Bien mélanger jusqu’à homogénéité.
   ATTENTION : L’acide chlorhydrique est très corrosif et doit être manipulé avec des précautions de sécurité appropriées. Le contact avec la peau humaine peut causer des rougeurs, des douleurs, des brûlures cutanées. Travailler sous le capot de fumée; porter des gants de protection et du manteau.
2. Congeler les échantillons à -20 °C, puis décongeler sur la glace. Répétez cette étape 3x.
3. Centrifugeuse les échantillons à 14 000 x g pendant 15 min à 4 °C. Recueillir les supernatants dans les nouveaux tubes. Ne pas déranger la pastille.
4. Diluer les supernatants 10x avec PBS.
5. Construire une courbe d’étalonnage de 0 à 2 μg de la protéine par plage de puits.
   1. Préparer la solution standard de sérum bovin albumine (BSA) pour l’étalonnage. Dissoudre 1,23 μg de BSA dans 1 mL d’eau ultrapure et de puits vortex.
   2. Sur une plaque de 96 puits, chargez différentes quantités de solution standard BSA (1,23 μg/mL) : 0 μL, 2 μL, 4 μL, 5 μL, 7 μL, 10 μL, 15 μL, 20 μL.
   3. Remplissez le puits de PBS jusqu’au volume final de 50 μL.
6. Chargez 10 à 15 μL de cellule lysate de l’étape 9.4 sur la même plaque de 96 puits. Remplissez les puits de PBS pour atteindre le volume final de 50 μL.
   REMARQUE : Si nécessaire, ajustez le volume de la cellule lysate aliquot dans chaque puits pour tenir dans la plage linéaire de la courbe d’étalonnage. Gardez le volume final à 50 μL de l’échantillon par puits.
7. Ajouter 200 μL d’un reagent Bradford (dilué 5 fois avec de l’eau ultrapure) à chaque puits.
8. Incuber le pâté de 96 puits pendant au moins 5 min à température ambiante. Insérez la plaque dans un lecteur de microplaque. Mesurer l’absorption à ν = 595 nm.
9. Construire une courbe d’étalonnage à l’aide d’un programme de feuille de calcul. Tracez la quantité de BSA (μg) par rapport à l’absorption. Ajoutez une ligne de tendance linéaire, affichez l’équation de la courbe d’étalonnage et le coefficient de régression sur le graphique.
10. Utilisez l’équation linéaire (y = hache +b, où y correspond à l’absorption à ν = 595 nm, a est la pente, x est une teneur en protéines (μg), et b se réfère à l’interception courbe) pour calculer la quantité de protéines dans l’échantillon.
    REMARQUE : Considérez un facteur de dilution de l’échantillon dans les calculs.
11. Utilisez la teneur en protéines estimée pour normaliser la quantité de kynurenine dans l’échantillon par 1 mg de protéines. Pour ce faire, divisez la concentration de kynurenines déterminées à l’étape 8.9 avec la teneur totale en protéines de l’étape 9.10.

LC-MS présente des avantages incontestables dans la quantification des molécules biologiquement actives, même si certaines composantes de spécimens complexes provoquent des effets matriciels et compromettent l’ionisation des analytes. Elle conduit à la suppression des ion ou à l’amélioration de l’ion, diminuant fortement la précision et affectant une limite de détection/quantification de la LC-MS, qui est considérée comme un point « faible » de la méthode. Dans notre protocole, les ions sont générés par l’ionisation d’électrospray (ESI) dans le mode positif, qui a été également employé dans d’autres études sur la détermination de métabolites de Trp^13. L’ESI, cependant, est plus sujette aux effets matriciels que l’ionisation chimique de pression atmosphérique (APCI)^28. Ainsi, pour une quantification précise des métabolites Trp dans un milieu de culture cellulaire, nous avons utilisé un étalonnage interne standard et matricielle pour compenser les effets dépendant de la matrice sur le signal analyte et pour corriger la perte des composés cibles au cours d’une étape de préparation de l’échantillon. Nous avons appliqué la même norme interne (3NT) pour tous les analytes étudiés (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA). 3NT n’a pas été trouvé dans le milieu original et frais utilisé pour la culture cellulaire et montre un comportement similaire comme les composés cibles dans les conditions analytiques appliquées. Cela fait de 3NT la norme interne appropriée²⁷. En outre, afin de simplifier le protocole, afin de le rendre plus accessible à un large groupe d’utilisateurs, nous ne proposons qu’une seule étape de préparation de l’échantillon impliquant l’élimination des protéines par traitement au méthanol contenant 1% (v/v) FA.

Dans le protocole présenté, il est recommandé de préparer les courbes d’étalonnage en utilisant le milieu complet utilisé pour la culture cellulaire. Cependant, le milieu de culture pourrait contenir kyn endogène qui perturbe l’estimation correcte de la zone de pointe analyte, en particulier dans les solutions d’étalonnage à faibles concentrations. La figure 1A illustre les résultats de LC-SQ obtenus au cours de l’analyse du DMEM contenant 4,5 g/L de glucose D (DMEM-HG) et 10 % (v/v) de FBS utilisés par notre groupe pour une culture de cellules cancéreuses. Nous avons constaté que le milieu de culture complet frais contient initialement un kyn qui peut être enlevé par purification avec du charbon actif (Figure 1B). Lors de l’analyse des échantillons expérimentaux, le milieu de culture complet du DMEM-HG a également été analysé comme échantillon de contrôle, et la zone de pointe de Kyn a été soustraite de la zone de pointe enregistrée pour Kyn dans chaque échantillon testé.

Figure 1 : Résultats représentatifs de la LC-SQ du milieu de culture DMEM-HG complet (A) avant et (B) après le prétraitement sur le charbon actif. Des échantillons de milieu de culture ont été piqués avec la même quantité de la norme interne (3NT). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Dans l’étape suivante, un temps de rétention pour chaque analyte cible a été établi (voir un chromatogramme dans la figure 2A). La bonne pratique dans l’analyse LC-MS est d’exécuter un échantillon qc avant les échantillons réels pour confirmer les temps de rétention appropriés des analytes. Parfois, un changement dans les signaux LC peut être observé, et les inadéquations ont tendance à se produire. La figure 2B montre un léger changement dans les temps de rétention des analytes, ce qui, cependant, ne perturbe pas les mesures correctes. D’autre part, la figure 2C présente un changement important dans la position des pics cibles. Comme on l’a vu, le signal 3NT a été considérablement déplacé vers un temps de rétention plus court et est sorti de la barrière de temps définie. En l’espèce, une analyse quantitative appropriée était impossible parce que le signal standard interne ne peut pas être mesuré correctement. Cela peut être dû à plusieurs facteurs, à savoir l’équilibrage insuffisant des colonnes, le mélange incorrect des solvants dans la pompe, l’utilisation de diluants d’échantillons inappropriés ou la contamination de la phase stationnaire de la colonne. La figure 2D,cependant, représente une situation où les pics enregistrés souffrent de très faibles intensités. Cela peut être le résultat d’une défaillance d’injection, d’une fuite dans le système ou de dommages causés par la SP. En outre, les composants de la matrice de co-eluting peuvent générer des ions avec m/z sélectionnés pour les analytes cibles, comme dans la figure 3A, où le résultat de l’analyse du milieu de culture des cellules MDA-MB-231 sont montrés. Au moment de la rétention d’environ 25 min, un signal fort dérivé d’un composant matriciel inconnu (composé X) a été observé. Le pic apparaît au cours de la période d’analyse, lorsque l’ion de m/z 206 (sélectionné pour XA) a été surveillé. Toutefois, ce signal ne correspond pas à l’analyte en raison de l’incompatibilité du temps de rétention. Pour éviter les erreurs lors de l’intégration de pointe, une comparaison du temps de rétention avec celui enregistré pour les échantillons de QC est également recommandée.

Figure 2. Exemples de résultats corrects et incorrects. Les chromatogrammes corrects de l’analyse d’échantillon de QC à (A) niveauxmoyens et( B ) de basse concentration enregistrés à différents jours. Exemple du chromatogramme incorrect résultant d’un changement significatif dans les temps de rétention des analytes (C) et des intensités insatisfaisantes des pics (D). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3. Résultats représentatifs du milieu de culture recueillis à partir de différentes lignées de cellules cancéreuses. Le milieu culturel des cellules( A) MDA-MB-231 (cancer du sein humain) et (B) SK-OV-3 (cancer des ovaires humains) a été analysé à l’aide de LC-SQ. Le composé X indique le signal d’un composé inconnu présent dans le milieu de culture qui co-élit avec l’analyte et ionise pour former un ion avec m/z sélectionné pour l’analyte. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Le milieu de culture utilisé pour les cellules cancéreuses (DMEM) contient des quantités importantes de Trp. Son isotope⁽¹³C-Trp) partage le même ion que XA(m/z 206) et pourrait interférer avec la détermination de la XA. Cependant, dans les conditions chromagraphiques appliquées, le signal de Trp est bien séparé du signal XA. Par conséquent, nous avons conclu que trp présent dans DMEM n’affecte pas la quantification et l’exactitude xa de la méthode (Figure 4).

Figure 4. Position des signaux de tryptophane (Trp) et d’acide xanthurnique (XA) sur le chromatogramme ms. Des solutions standard de Trp (49,0 μmol/L) et de XA (48,8 μmol/L) ont été préparées en solvant A (format ammonium de 20 mmol/L dans l’eau, pH 4,3) dans des conditions optimisées de LC-SQ. Les ions de m/z 205 (correspondant à [Trp+H] + )^et m/z 206 (correspondant à [XA+H] + )^ontété surveillés pour Trp et XA, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

La méthode analytique présentée a réussi le test de validation en termes de linéarité, de précision (coefficients de variation ≤15%), de précision (96-104%), de récupération (96-119%) et d’effets matriciels pour tous les analytes, comme on l’a décrit en détail dans notre article ^{précédent 27}.

Enfin, nous avons confirmé une application de l’approche analytique décrite à un milieu recueilli à partir des cellules cancéreuses humaines in vitro. Nos données ont confirmé qu’un niveau de kynurenines peut varier considérablement dans un milieu de culture prélevé à partir de différents types de cellules (Figure 3). Nous avons analysé le milieu de culture à partir de 2 types de lignées cancéreuses, c’est-à-dire les cellules MDA-MB-231 et SK-OV-3 dérivées du cancer du sein et de l’ovaire, respectivement. Les lignes sélectionnées sont souvent utilisées comme modèles pour étudier les événements moléculaires et pour le dépistage des médicaments anticancéraux. Comme nous l’avons observé, les cellules cultivés dans un milieu standard de contrôle ont libéré différentes quantités de métabolites de tryptophane, C’est-à-dire que les cellules MDA-MB-231 ont libéré une quantité quantifiable de Kyn et de XA à faible concentration de nmol/L (figure 3A), tandis que les cellules SK-OV-3 ont montré beaucoup plus de Kyn, sécrétion très faible de XA, et aucune sécrétion d’autres kynurenines étudiées comme indiqué par l’intensité des pics correspondants (figure 3B).

Cet article présente un protocole détaillé de LC-SQ pour la quantification simultanée de quatre métabolites principaux de Trp (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) qui sont mesurés dans un milieu des cellules cancéreuses humaines culturenées in vitro. Une attention particulière est accordée à la préparation de l’échantillon, à la procédure chromatographic/spectrométrie de masse et à l’interprétation des données, les points les plus importants de l’analyse.

En général, l’analyse LC-MS, en raison d’une sensibilité élevée, exige les normes les plus élevées d’une rigueur protocolaire et de la pureté des matériaux usés. Il se réfère à une application de verrerie soigneusement nettoyée et correctement lavée, ainsi que des produits chimiques de haute qualité tout au long de la procédure standard. Il est très important d’utiliser des solvants à base d’eau douce d’une phase mobile pour éviter la contamination microbienne qui, dans cette approche sensible, pourrait affecter considérablement l’analyse. Avant de s’injecter dans un système LC, les échantillons analysés doivent être soigneusement examinés pour déceler la présence de particules insolubles. Il est important de noter que la colonne doit être suffisamment calibrée avant l’analyse de l’échantillon. Le non-respect de ces règles peut entraîner la contamination des échantillons, du système LC et de la colonne analytique ou une ionisation insuffisante de l’échantillon dans la source de SP, ce qui entraîne finalement un déplacement des signaux.

Il y a 2 points clés dans le protocole qui doivent être soulignés afin d’obtenir des résultats optimaux. La partie la plus critique du protocole présenté est l’étape de préparation de l’échantillon. L’utilisation d’une procédure inadéquate entraîne une perte de composés cibles et, par conséquent, une quantification inexacte. Dans notre approche, pendant le développement de la méthode, l’étape de préparation de l’échantillon a été soigneusement optimisée ainsi que la sélection du solvant pour l’élimination des protéines. Comme nous l’avons déterminé, le traitement d’échantillon avec le méthanol contenant 1% (v/v) acide formique a donné les meilleures récupérations pour toutes les kynurenines étudiées. L’impact d’une composition de phase mobile sur l’étendue de l’ionisation analyte a également été évalué. Nous avons vérifié les phases mobiles composées de format ammonium de 0-20 mmol/L ou d’acétate d’ammonium à différents pH ajustés avec de l’acide formique ou acétique. La phase mobile contenant 20 mmol/L ammonium formate dans l’eau (pH 4.3, solvant A) et l’acétyltrile (solvant B) a fourni les meilleures conditions possibles pour la quantification simultanée de Kyn, 3HKyn, 3HAA et XA²⁷. Une autre étape importante de l’analyse LC-MS est l’intégration de pointe. Certaines kynurenines se produisent dans un échantillon à des niveaux de concentration très faibles. Dans ce cas, les signaux des composés de co-eluting peuvent se chevaucher avec le signal d’analyte cible ou générer un pic à un moment de rétention similaire. Un utilisateur inexpérimenté de cette méthode peut trouver quelques difficultés avec une intégration de pointe correcte, comme l’illustre la figure 2C. Ainsi, la vérification du temps de rétention des analytes et la comparaison avec un échantillon qc est nécessaire et fortement recommandé.

Les bonnes pratiques analytiques comprennent la sélection d’une norme interne appropriée pour une analyse quantitative. Ici, nous proposons une approche simple et rentable en utilisant une seule norme interne (3NT) comme analogue de quatre kynurenines. Les résultats ont confirmé que 3NT présente un comportement chromatographic similaire comme les composés cibles et en conséquence il permet d’atteindre une bonne précision et précision de la méthode²⁷. Dans les conditions appliquées de LC, le pic 3NT est bien séparé des signaux des autres analytes et facile à mesurer. Nous nous rendons compte que les normes internes étiquetées isotopiquement (ILIS) utilisées dans de telles analyses^{14,15 fourniront} une meilleure compensation des effets matriciels et un meilleur contrôle de toutes les variables qui peuvent conduire à de faux résultats. D’autre part, les ILIS pour tous les analytes cibles ne sont pas toujours facilement disponibles, et encore moins leur coût élevé. De plus, les ILIS sont plutôt dédiés à LC-MS/MS qu’à LC-SQ avec le mode surveillance ion unique (SIM) que nous avons utilisé dans ce document.

L’utilisation de la 3NT comme norme interne pourrait être considérée ici comme une limitation de la méthode en raison d’une possibilité de formation de 3 nitrotyrosines sur les protéines²⁹. Cependant, dans le cas d’un milieu de culture, nous n’avons observé aucune 3-nitrotyrosine endogène libre. Il nous a permis de reconnaître 3NT comme une norme interne appropriée. Cependant, nous recommandons une évaluation préalable d’un niveau endogène initial de 3NT, particulièrement en étudiant d’autres types de cellules que testés dans ce rapport.

En résumé, lors de la sélection d’un analogue de n’importe quel analyte, il faut tenir compte de nombreuses caractéristiques, par exemple, la similitude chimique et l’absence initiale dans une matrice d’échantillon. En outre, une stabilité de la norme interne analogique dans une matrice d’échantillon, son efficacité de récupération et d’ionisation en présence de composants matriciels peuvent différer des composés cibles. Ainsi, toutes ces caractéristiques doivent être examinées et soigneusement étudiées lors du développement de la méthode.

Le système analytique de la méthode présentée comprenant un détecteur de SP nous a permis d’atteindre de faibles limites de détection (0,0033 - 0,0108 μmol/L)²⁷. De cette façon, les mesures simultanées de 3HKyn, Kyn, 3HAA, XA dans les fourchettes de concentration de 0,018 - 4,46 μmol/L, 0,0096 - 3,84 μmol/L, 0,033 - 13,06 μmol/L, et 0,019 – 4,87 μmol/L, respectivement, ont été atteints. La principale limitation de toute analyse LC-SQ est associée à une séparation adéquate des composants de l’échantillon sur une colonne LC. Une mauvaise séparation contribue à réduire la sélectivité par rapport à la détection avec une spectrométrie de masse quadrupole tandem utilisant des ions de produit et le mode de surveillance des réactions multiples (MRM). Afin d’éviter les interférences provenant d’autres composants matriciels qui partagent les mêmes ions ou des ions similaires avec une molécule cible, les conditions de séparation du LC doivent être soigneusement optimisées. À titre d’exemple, ^{l’isotope 13}C Trp (présent en quantités intraces) génère le même ion de m/z 206 que celui choisi pour la surveillance xa. La mauvaise interprétation a été évitée ici en optimisant les conditions chromatographiques et la séparation satisfaisante de Trp et XA éludé de la colonne (Figure 4).

Dans les applications futures, certaines modifications au protocole peuvent être implémentées. Un utilisateur potentiel peut modifier une concentration de la norme interne (3NT) lorsque les niveaux de kynurenines étudiées devraient diminuer beyound les concentrations présentées ici. Fait important, la concentration de 3NT devrait être la même tant dans les normes d’étalonnage que dans les échantillons expérimentaux. En cas de niveau d’analyte extrêmement élevé, comme kyn observé dans les cellules SK-OV-3, nous vous recommandons de travailler avec une concentration plus élevée de 3NT. Si la dilution de l’échantillon est nécessaire, elle se fait à l’étape finale du protocole, avant l’injection de l’échantillon sur la colonne LC.

Dans la littérature, il y a quelques protocoles proposés pour l’analyse quantitative de LC-MS/MS des kynurenines dans un milieu de culture de différentes cellules. Un protocole fournit une détermination simultanée de 3 métabolites, c’est-à-dire Kyn, 3HKyn et 3HAA, mais il est moins sensible (limite de quantifications (LOQ) à des niveaux plus élevés), contrairement à notre méthode²¹. Un autre rapport a présenté une méthode qui permet la quantification de 4 kynurenines, y compris Kyn, 3HKyn, 3HAA et XA avec loqs^{semblables 25.} Aucun d’entre eux, cependant, n’a été optimisé pour la détection des kynurenines générées par les cellules cancéreuses in vitro. Les composants d’une matrice d’échantillon influencent l’ionisation analyte dans la source de SP en diminuant ou en augmentant le signal, qui est une cause de résultats peu fiables. Pour obtenir des données plus précises, nous avons proposé d’utiliser une norme interne analogique (3NT) en combinaison avec un étalonnage matricielle pour une meilleure compensation des effets dépendants de la matrice.

En utilisant la méthodologie présentée, nous avons pu observer que Kyn était le métabolite Trp le plus abondant dans un milieu de culture prélevé sur les types de cellules cancéreuses analysées, tandis que les autres métabolites étudiés dans des conditions de culture de contrôle n’ont pas été détectés (à l’exclusion de la XA présente en quantités traçables mais détectables). Cependant, quand les cellules ont été stimulées avec un activateur immunisé puissant - lipopolysaccharide bactérien, une plus grande quantité de XA en plus de Kyn a été sécrété.  D’autre part, les 3HKyn et 3HAA détectés qui sont formés en amont de XA dans KP étaient encore sous LOQ²⁷. Cela donne à penser que certains métabolites KP présents en petites quantités dans un milieu culturel pourraient être difficiles à mesurer en utilisant l’approche proposée par la LC-SQ. Néanmoins, le protocole présenté est utile pour identifier les changements dans KP par quantification des métabolites clés de Trp accumulant. L’utilisation de cette méthodologie dans de futures études pour engager un système de culture cellulaire in vitro fournira de nouveaux biomarqueurs des maladies immunitaires et du cancer. Notre approche apporte un test validé et fiable avec une sensibilité pertinente pour les modèles cellulaires qui sont difficiles en raison de faibles concentrations de métabolites KP en aval. Les instructions fournies permettront aux chercheurs de différents domaines d’utiliser cette approche pour quantifier les kynurenines majeures liées au cancer et à d’autres maladies. Nos données (non publiées) montrent qu’il est utile pour étudier la modulation du KP dans les cellules exposées à différents produits de glycation, mais il devrait également trouver une application dans d’autres domaines de recherche et les maladies à composante immunitaire, c’est-à-dire dans la biologie de l’endomètre et la reproduction³⁰.

Le protocole présenté peut être élargi pour déterminer d’autres analytes qui pourraient s’accumuler dans un milieu de culture dans différentes conditions expérimentales. Les normes de référence appropriées des analytes devraient être utilisées pour la validation de la méthode en termes de précision, de précision, de linéarité, de récupération ou de sélectivité avant d’être utilisées pour des analyses quantitatives. Futhermore, selon le but de la recherche, le protocole peut être utilisé pour les kynurenines individuelles (3HKyn, Kyn, 3HAA ou XA). Dans ce cas, les ions correspondant à des composés qui ne sont pas pris en compte pour analyse, peuvent être retirés des paramètres de SP. Les changements appropriés dans le programme de gradient LC aideront à réduire le temps d’analyse.

Lors de l’étude du KP, il est pertinent d’évaluer l’activité de l’enzyme IDO. Cela pourrait être estimé simplement en mesurant la consommation de Trp et la libération de Kyn dans un milieu de culture ou en calculant un rapport concentration kynurenine-tryptophane ([Kyn]/[Trp])³¹. Dans notre approche, nous n’avons pas mesuré une concentration de Trp, cependant, le protocole pourrait être élargi en ajoutant cette cible dans l’analyse LC-SQ. Comme approche plus biochimiquement appropriée, nous recommandons d’exprimer l’activité enzymatique d’IDO comme quantité de Kyn produite par des cellules par milligramme de protéine par minute comme présenté^{ailleurs 32.} Nous avons remarqué un avantage dans l’utilisation de cette approche dans nos autres études sur les cellules cancéreuses (manuscrit en préparation) et recommandons cette méthode lors de l’utilisation du modèle de culture cellulaire in vitro.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ces travaux ont été soutenus par l’Union européenne par le Fonds européen de développement régional dans le cadre du Programme opérationnel développement de la Pologne orientale 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00), par la Faculté des biotechnologies et des sciences de l’environnement de l’Université catholique Jean-Paul II de Lublin (subvention des jeunes scientifiques pour Ilona Sadok), Centre national polonais des sciences, OPUS13 (25/04/01198 2017/2017/25/B/NZ4/01198 pour Magdalena Staniszewska, chercheuse principale).  Les auteurs remercient le Professeur Agnieszka Ścibior du Laboratoire de Stress Oxydatif, Centre de Recherche Interdisciplinaire, JPII CUL pour le partage de l’équipement pour la culture cellulaire et la quantification des protéines.