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* Questi autori hanno contribuito in egual misura
Descriviamo un metodo in vivo per studiare la perdita funzionale di un gene specifico nelle cellule satellitari utilizzando una combinazione di lesione mediata dalla cardiotossina del muscolo scheletrico e l'iniezione di un siRNA auto-disporsi.
Il muscolo scheletrico possiede un'enorme capacità di rigenerarsi dopo un infortunio. Questo processo è guidato principalmente da cellule staminali muscolari, anche definite cellule satellitari. Le cellule satellitari sono caratterizzate dall'espressione del fattore di trascrizione Pax7 e dalla loro posizione sotto la lamina basale nel muscolo scheletrico a riposo. In caso di lesioni, le cellule satellitari si attivano, subiscono l'auto-rinnovamento o la differenziazione per formare nuove miofibre o per fondersi con quelle danneggiate. La funzionalità delle cellule satellitari in vivo può essere studiata utilizzando un modello di lesione basato sulla cardiotossina del muscolo scheletrico. Per studiare la funzione di un gene durante la rigenerazione del muscolo scheletrico, vengono utilizzati principalmente modelli murini transgenici. Qui, presentiamo un metodo alternativo ai topi transgenici, per studiare la funzione genica nelle cellule satellitari durante la rigenerazione, ad esempio nei casi in cui i topi transgenici non sono disponibili. Uniamo la lesione mediata dalla cardiotossina di uno specifico muscolo scheletrico con l'iniezione di un siRNA auto-condurso nel muscolo rigenerante che viene poi assorbito dalle cellule satellitari tra le altre cellule. Di conseguenza, forniamo un metodo per analizzare la funzione genica nelle cellule satellitari durante la rigenerazione in condizioni fisiologiche senza la necessità di topi transgenici.
Il muscolo scheletrico è il tessuto più grande del corpo che rappresenta circa il 40% del peso corporeo totale che consente la locomozione volontaria. L'architettura tissutale del muscolo scheletrico è composta principalmente da miofibre postmitotiche, differenziate terminalmente e multinulettive, nonché da varie altre cellule del sistema nervoso periferico, del sistema vascolare e delle cellule interstitiali1. È importante sottolineare che il muscolo scheletrico ha un'enorme capacità di rigenerare e ripristinare la funzione in caso di lesioni o danni2. Questo processo dipende dal tessuto residente cellule staminali muscolari chiamate anche cellule satellitari3,4. Le cellule satellitari si trovano tra la miofibra e la lamina basale e caratterizzate dall'espressione del fattore di trascrizione Pax75,6,7. In condizioni omeostatiche, le cellule satellitari sono quiescenti ma si attivano a causa di lesioni traumatiche, ad esempio, attraverso esercizi eccentrici o sperimentalmente attraverso l'iniezione del veleno di serpente cardiotossina6,8. Una volta attivate, le cellule satellitari positive Pax7 coesprimono MyoD e Myf5, che impegna le cellule staminali alla differenziazione miogenica. Le cellule satellitari che resistono all'apmappa dei fattori di impegno manterranno il loro potenziale di stelo e torneranno a quiescenza per ricostituire il pool di cellule staminali per le esigenze future. Dopo l'espansione del pool di progenitori miogenici, le reti trascrizionali sono attivate da fattori di differenziazione come La miogenina per avviare l'uscita del ciclo cellulare e la differenziazione dei terminali. Questi mioprogenitori si fondono l'uno con l'altro o con le miofibre esistenti che contribuiscono ai mionuclei per mantenere le dimensioni del dominio mionucleare. Le miofibre esprimono geni di differenziazione muscolare terminale come Myosin Heavy Chain. Infine, le miofibre appena formate crescono e maturano per costruire le unità funzionali del muscolo scheletrico9,10.
La rigenerazione del muscolo scheletrico può essere influenzata da varie condizioni tra cui malattie muscolari o invecchiamento11,12, che vanno da lievi menomazioni a condizioni di pericolo di vita, ad esempio, nella distrofia muscolare di Duchenne13 , 14.Pertanto, la medicina rigenerativa mira a ripristinare il tessuto muscolare scheletrico danneggiato o malfunzionante utilizzando la sua potenza rigenerativa intrinseca prendendo di mira la funzione cellulare satellitare15,16. Per utilizzare il suo pieno potenziale è necessaria una comprensione completa delle cellule satellitari nella loro nicchia endogena durante la rigenerazione del muscolo scheletrico. Sebbene esistano approcci sperimentali per isolare le cellule satellitari adiacenti alle loro miofibre17,la piena complessità delle interazioni cellulari e sistemiche delle cellule satellitari con il loro ambiente può essere riassunta solo in vivo. A tale proposito, grande conoscenza della rigenerazione muscolare scheletrica è stata acquisita utilizzando i modelli di lesioni del topo2,18.
Qui introduciamo uno specifico modello sperimentale di lesione del topo per studiare la rigenerazione mediata delle cellule staminali del danno indotto dalla cardiotossina del muscolo anteriore tibialis in vivo. La cardiotossina, una tossina citolitica derivata da serpente che causa la depolarizzazione della miofibra e la necrosi, viene iniettata nel muscolo tibialis anteriore, che a sua volta innescherà la degenerazione del tessuto seguita dalla rigenerazione. Per analizzare la funzione dei geni durante la rigenerazione acuta, i siRNA auto-consegnanti vengono iniettati il giorno 3 dopo la lesione, al culmine dell'espansione delle cellule satellitari. Gli animali sperimentali vengono sacrificati in vari momenti e i muscoli anteriori tibiali vengono raccolti. I muscoli sezionati vengono congelati ed elaborati per un'ulteriore crio-sezione. La microscopia a immunofluorescenza viene quindi utilizzata per analizzare i marcatori di rigenerazione. Questo metodo consente di sforare la funzione di un singolo gene durante la rigenerazione del muscolo scheletrico guidato da cellule satellitari utilizzando topi di tipo selvatico.
Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Dipartimento per il Benessere Animale del Landesamt f'r Lebensmittelsichecherheit und Verbraucherschutz (03-048/16; TLV; Bad Langensalza, Germania).
1. Lesione muscolare indotta da cardiotossina
NOT: Eseguire tutti gli esperimenti che coinvolgono topi viventi in conformità con la legge nazionale sul benessere degli animali e in condizioni asettiche appropriate. Inoltre, il sacrificio degli animali deve essere effettuato in conformità con la legge nazionale sul benessere degli animali.
2. Iniezione di siRNA auto-condurinissi nel muscolo anteriore rigenerante tibialis (Al terzo giorno lesione post cardiotossina)
3. Dissezione del muscolo anteriore tibiale
4. Criosezione del Muscolo Anteriore Tibialis Rigenerante
5. Immunostaining per marcatori di rigenerazione
6. Colorazione ematossina ed Eosina
Un risultato tipico di una colorazione ematossia ed eosina (H&E) di un tibialis lesione anteriore prima e dopo la cardiotossina mediata è presentato in Figura 4A, B. Nei muscoli di controllo, l'architettura del muscolo è intatta come visto dalla localizzazione dei nuclei nella periferia della miofibra e dalla mancanza di accumulo di cellule mononucleate nello spazio interstiziale (Figura 4A). 7 giorni dopo la lesione mediata dalla cardiotosina si formano nuove miofibre contrassegnate da nuclei situati in posizione centrale (Figura 4B). Inoltre, si può osservare un accumulo di cellule mononleate, costituite principalmente da cellule satellitari ma anche da cellule non miogeniche come le cellule immunitarie. L'intero muscolo deve essere ferito caratterizzato dalla posizione centrale di tutti i mionuclei e dall'accumulo di cellule mononuclate su tutta la sezione muscolare.
Per caratterizzare la progressione e il successo del processo di rigenerazione, possono essere eseguite diverse colorazioni immunofluorescenti utilizzando marcatori di rigenerazione. Il numero di cellule satellitari può essere valutato mediante colorazione per Pax7, il marcatore canonico per le cellule satellitari (Figura 4C,D). Tre giorni dopo la lesione aumenta il numero di cellule satellitari (Figura 4D), le cellule satellitari non si trovano più sotto la lamina basale. Per analizzare ulteriormente il processo di rigenerazione, le miofibre di nuova formazione possono essere macchiate con anticorpi diretti alla miosina dello sviluppo (Figura 4E). Le miofibre di nuova formazione mostrano nuclei situati in posizione centrale e una forte espressione della miosina dello sviluppo. Man mano che le miofibre maturano, l'espressione della miosina dello sviluppo diminuisce, il diametro della miofibra aumenta mentre i nuclei migrano verso la periferia delle miofibre.
L'influenza di un singolo gene sul processo di rigenerazione può essere studiata usando topi transgenici o come mostrato qui per iniezione di un siRNA auto-consegnante. Fluorescentemente etichettato auto-consegna siRNA di controllo strapazzato è stato iniettato nel muscolo tibialis rigenerante anteriore al giorno 3 dopo l'infortunio, il punto del momento in cui la proliferazione delle cellule satellitari raggiunge picchi. Due giorni dopo l'iniezione delle cellule satellitari del siRNA sono state analizzate per la presenza del siRNA fluorescentmente etichettato (Figura 4F). Abbiamo analizzato quante cellule satellitari avevano assunto il siRNA fluorescente due giorni dopo l'iniezione nel muscolo rigenerante (Figura 5). Circa il 75% di tutte le cellule satellitari nel muscolo rigenerante era positivo per il siRNA fluorescente. Inoltre, abbiamo determinato che circa il 74% di tutte le mifose rigeneranti erano positive per il siRNA fluorescente, suggerendo che il 74% delle miofibre rigeneranti aveva assorbito il siRNA o che le cellule satellitari siRNA-positive si erano fuse con l'un l'altro per formare nuove miofibre o che si è verificata la fusione con miofibre rigeneranti già esistenti (Figura 5). Ciò suggerisce che le cellule satellitari occupano il siRNA auto-conroganti e che il siRNA persiste nelle cellule satellitari per almeno due giorni.
Figura 1: Iniezione di cardiotossina nel muscolo anteriore tibialis. (A) I topi sono anestesizzati per inalazione di isoflurane e l'arto inferiore è rasato. (B) Un ago da 29 G viene iniettato nel muscolo anteriore tibiale (C) e spostato lungo l'osso della tibia durante l'iniezione della soluzione di cardiotossina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Passi coinvolti nella dissezione e congelamento del muscolo anteriore tibialis ferito. (A) I muscoli degli arti posteriori sono esposti (B) e la fascia che circonda il muscolo anteriore tibialis viene strappata per esporre il muscolo. (C) Dopo aver rimosso il muscolo, viene tagliato nella regione del ventre medio in due metà di dimensioni simili utilizzando forbici dritte affilate (D). (E) Le metà del muscolo sezionato sono incorporate in uno stampo in alluminio riempito con soluzione di congelamento e congelato in azoto liquido (F). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Attrezzature e passaggi coinvolti nella criosezione dei muscoli anteriori tibiali. (A) La temperatura della camera del criostato è impostata su -21 . (B) Il muscolo anteriore tibialis nella soluzione di congelamento è montato sul supporto del campione. (C) Le sezioni di spessore di 14 m sono attaccate ai vetrini del microscopio in vetro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagini rappresentative dei muscoli anteriori rigeneranti tibiali. Macchie H&E dei muscoli anteriori della tibialis prima (A) e 7 giorni dopo l'infortunio di cardiotossina (B). (C) Nel muscolo non ferito Pax7 cellule satellitari positive (in rosso) si trovano sotto la lamina basale contrassegnata da laminina (in verde). I nuclei sono controordinati con DAPI (in blu). Le celle pax7 positive sono contrassegnate da una freccia. (D) Dopo 10 giorni di rigenerazione, le miofibre sono caratterizzate da nuclei situati in posizione centrale (in blu), Pax7 è mostrato in rosso, laminina in verde. Le celle pax7 positive sono contrassegnate da una freccia. (E) Le miofibre appena formate esprimono la miosina dello sviluppo (in rosso), laminina in verde, i nuclei sono contrastati con DAPI (in blu). (F) Il siRNA auto-consegna etichettato fluorescente (siRED, raffigurato in rosso) si trova ancora nelle cellule satellitari (Pax7 positivo, in verde, contrassegnato da una freccia nell'insenatura) 2 giorni dopo l'iniezione del siRNA auto-consegnante nella rigenerazione del tibialis anteriore muscolo (iniezione al giorno 3 dopo lesione mediata dalla cardiotossina). La laminina è mostrata in bianco, i nuclei sono controregistrati con DAPI (in blu). Barra della scala: 100 m (A e B), 50 m (C-E), 25 m (F). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Quantificazione dell'assorbimento del siRNA fluorescente. (A) Quantificazione dell'assorbimento di siRNA da parte delle cellule satellitari (cellule Pax7) e rigenerazione delle miofibre 2 giorni dopo l'iniezione nel muscolo scheletrico rigenerante. L'iniezione è stata eseguita al giorno 3 dopo la lesione mediata dalla cardiotossina. n - 3, le barre di errore mostrano la quantificazione SEM. (B) sottostante il grafico raffigurato in (A). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Qui presentiamo un metodo per studiare la funzione di un gene specifico durante la rigenerazione del muscolo scheletrico senza la necessità di animali transgenici. Ciò è ottenuto dalla combinazione di lesione muscolare indotta dalla cardiotossina con l'iniezione di un siRNA auto-condurso nel muscolo scheletrico rigenerante al giorno 3 dopo l'infortunio. Abbiamo descritto in dettaglio le procedure di lesione muscolare per cardiotossina, l'iniezione del siRNA auto-consegnante e l'elaborazione dei muscoli raccolti per analizzare il progresso della rigenerazione. Dimostriamo che l'iniezione del veleno di serpente cardiotossina nel muscolo scheletrico ferisce efficacemente l'intero muscolo e che i siRNA auto-consegnanti si trovano in circa il 75% di tutte le cellule satellitari tra le altre cellule due giorni dopo la loro iniezione nel rigenerazione del muscolo scheletrico (Figura 4, Figura 5).
Particolare attenzione dovrebbe essere focalizzata su una lesione omogenea del muscolo anteriore tibialis poiché diversi gradi di lesione influenzano l'esito della rigenerazione e quindi potrebbe essere influenzato anche l'effetto del siRNA. Inoltre, è di fondamentale importanza che l'intera area rigenerante venga iniettata con il siRNA auto-conrogante. Per l'analisi del processo di rigenerazione, si consiglia di confrontare sempre aree simili del muscolo scheletrico rigenerante, quindi, il muscolo anteriore tibialis dovrebbe essere tagliato a metà per confrontare sempre la regione del ventre medio del muscolo. Quando si analizza il muscolo, l'intera criosezione deve essere analizzata poiché la composizione della miofibra differisce nel muscolo anteriore tibialis e potrebbe quindi rigenerarsi in modo diverso.
La funzione delle cellule satellitari può essere studiata da varie procedure sperimentali tra cui la loro coltura sulle miofibre singole isolate adiacenti17, mediante trapianto e analizzando la rigenerazione del muscolo scheletrico dopo lesioni indotte 18,19. Lo studio della funzione delle cellule satellitari utilizzando un modello di lesione indotta in vivo, ad esempio l'iniezione di cardiotossina, fornisce la possibilità di analizzare la funzione delle cellule satellitari anche in termini di interazione con altri tipi di cellule, come macrofagi e l'indagine sull'influenza dei fattori sistemici2. Lesioni del muscolo scheletrico possono essere eseguite con vari mezzi, ad esempio, esercizio eccentrico, lesioni da congelamento, iniezione di BaCl2 o iniezione di veleni di serpente come la cardiotossina o la notexina18. Mentre l'esercizio eccentrico è probabilmente il metodo di lesioni più fisiologico, la lesione a un particolare muscolo è limitata solo20. Le lesioni da congelamento possono essere applicate quando la migrazione delle cellule satellitari verso il sito di lesioni è lo scopo dello studio o solo una parte specifica del muscolo dovrebbe essere ferita. Sperimentalmente lo svantaggio delle lesioni da congelamento è la chirurgia aperta che deve essere eseguita per applicare la sonda metallica preraffreddata. L'iniezione di BaCl2 o veleni di serpente è il metodo più drammatico di lesione, sfidando così la funzione cellulare satellitare più difficile. Inoltre, l'iniezione è minimamente invasiva, il tempo di chirurgia, in generale, è inferiore a cinque minuti e non comporta sutura, ecc. riducendo così al minimo il rischio di infezioni.
Lesione muscolare è per lo più utilizzato per studiare le conseguenze funzionali della perdita delle funzioni geniche, ad esempio, la perdita di Pax77,21. Soprattutto se i topi di vecchiaia sono al centro della questione scientifica, la generazione o l'uso di topi transgenici spesso non è fattibile. L'iniezione di siRNA auto-consegnanti mirati a un gene specifico è un'alternativa praticabile in questi casi ed è stata utilizzata con successo22. In breve, il muscolo tibialis anteriore dei topi è stato ferito per iniezione di cardiotossina e siRNA auto-consegnanti diretti contro la fibronectina (FN) sono stati iniettati al giorno 3 dopo l'infortunio. I muscoli sono stati analizzati 10 giorni dopo l'infortunio e una significativa diminuzione del numero di cellule satellitari è stata osservata nelle condizioni di controllo del siRNA strapazzate. L'efficienza di knockdown è stata determinata nei lismi muscolari interi dalla PCR quantitativa in tempo reale 2 giorni dopo l'iniezione di siRNA, è stata raggiunta una riduzione dei livelli di espressione del 58% suggerendo che l'efficienza di consegna e knockdown è sufficiente per l'efficienza funzionale analisi22. Le alternative per testare l'efficienza del knockdown sono le analisi dell'immunoblot o dell'immunofluorescenza con anticorpi diretti contro il gene bersaglio. L'efficienza e la specificità del siRNA utilizzato per le iniezioni in vivo devono essere determinate prima dell'iniezione nei topi, ad esempio testando l'efficienza nelle cellule satellitari isolate o nei mioblasti primari. L'uso di un pool intelligente composto da 4 siRNA diversi rispetto a un singolo siRNA aumenta l'efficienza del knockdown, ma aumenta anche il rischio di targeting non specifico. La specificità di tutte le sequenze di siRNA utilizzate deve essere testata nella coltura cellulare per evitare effetti fuori bersaglio. Come controllo, un siRNA criptato non mirato deve essere usato poiché l'iniezione di un siRNA di per sé potrebbe influenzare il processo di rigenerazione a causa dell'iniezione e, di conseguenza, danni aggiuntivi del muscolo. Il punto temporale dell'iniezione del siRNA dipende dalla questione scientifica e dal profilo di espressione del gene bersaglio. Generalmente, un'iniezione di siRNA auto-confortante al giorno 3 dopo che la lesione da cardiotossina riguarda la maggior parte dei geni importanti per la proliferazione delle cellule satellitari poiché la proliferazione delle cellule satellitari raggiunge il terzo giorno dopo l'infortunio. Il punto temporale per la prima iniezione di siRNA non deve essere inferiore a 48 h dopo la lesione da cardiotossina poiché il volume di iniezione di cardiotossina è piuttosto alto e la riassorbimento del liquido dovrebbe aver avuto luogo prima di iniettare soluzioni aggiuntive nel muscolo. In generale, più iniezioni di siRNA o una combinazione di siRNA diversi è possibile, anche se si deve considerare che ogni iniezione nel muscolo rigenerante sta causando ulteriori danni.
Una limitazione del metodo descritto è il fatto, che l'effetto osservato non è necessariamente solo a seconda dell'abbattimenti del gene bersaglio nelle cellule satellitari, ma potrebbe essere attribuito ad altri tipi di cellule come le cellule immunitarie o le cellule progenitrici fibro-adipogeni. Pertanto, è necessario combinare questi esperimenti con esperimenti che studiano una popolazione pura di cellule satellitari. Si possono o eseguire esperimenti utilizzando colture galleggianti di miofibra, dove le cellule satellitari vengono coltivate sulle miofibre adiacenti o eseguire esperimenti di trapianto utilizzando cellule satellitari isolate17.
Un'alternativa all'iniezione di siRNA auto-consegnanti è l'iniezione di inibitori di piccole molecole o proteine ricombinanti che possono essere eseguite, a seconda della questione scientifica. Ad esempio, l'iniezione della fibrocellina della proteina extracellulare o degli inibitori di piccole molecole della segnalazione JAK/STAT è stata eseguita con successo nei topi invecchiati15,16. L'analisi di una particolare funzione genica in un tipo specifico di cellula durante la rigenerazione del muscolo scheletrico, ad esempio, nelle cellule satellitari, è possibile solo attraverso l'uso di un modello murino genetico inducibile. Le iniezioni di siRNA auto-consegnanti, proteine ricombinanti o inibitori di piccole molecole potrebbero influenzare più tipi di cellule nel muscolo scheletrico rigenerante.
Ringraziamo Christina Picker e Christine Poser per l'eccellente assistenza tecnica e Saskia Steiner per l'aiuto nella determinazione dell'efficienza della trasfezione del siRNA. Ringraziamo il servizio di base histologia per un grande supporto tecnico, in particolare Sabine Landmann e Linda Rothenburger. Ringraziamo anche il topo di impianto animale presso la FLI per un eccellente supporto. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni della Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA-3975/2-1) e della Deutsche Krebshilfe (DKH-JvM-861005) a J.v.M.
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Isoflurane | Henry Schein | Isothesia | inhalation narcotics |
Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
Anesthesia System (Tec 7) with inhalation box + nose masks | Tem Sega | Minihub | |
Shaver for rodents | isis | GT420 | |
Cardiotoxin | Latoxan | L8102 | snake venom needed for muscle injury |
Accell siRNA smart pool | Dharmacon | depending on your target gene | self delivering siRNA |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-21206 | secondary antibody |
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher | A-21123 | secondary antibody |
Coverslips | VWR | 631-1574 | |
CV Mount | Leica | 14046430011 | mounting medium for immunohistochemistry |
DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | nuclear staining |
devMHC antibody | DHSB | F.1652 | |
Eosin Y | Thermo Fisher | 73104 | |
Haematoxylin Gill No3 | Sigma-Aldrich | GHS316-500ML | |
Insulin syringe (29 g) | Terumo | 3SS05M2813 | syringue used for muscle injections |
Laminin antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
M.O.M blocking reagent | Vector labs | MKB-2213 | blocking for immunofluorescent staining |
Meloxicam | Boehringer Ingelheim | Metacam | analgesics |
OCT | Thermo Fisher | 6502 | tissue embedding |
Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | satellite cell specific antibody |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher | P36934 | aequos mounting medium |
Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | tissue embedding |
Superfrost plus | Thermo Scientific | J1830AMNZ | microscope slides |
TritonX-100 | Amresco | 0694-1L | permeabilization reagent |
Dissection tools | |||
Dumont 5, straight | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Dumont 7, curved | Fine Science Tools | 11272-40 | |
Extra fine Bonn scissors (cutting edge: 13 mm) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-16 | |
Spring scissors (cutting edge: 5 mm, tip diameter: 0.35 mm) | Fine Science Tools | 91500-09 |
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