Method Article
אנו מתארים בשיטה vivo לחקור את אובדן פונקציונלי של גן ספציפי בתאי לווין באמצעות שילוב של קרדיאטוקסין בתיווך הפציעה של שריר השלד ואת הזריקה של siRNA הספק.
שריר השלד בעל קיבולת עצומה להתחדש לאחר הפציעה. תהליך זה מונע בעיקר על ידי תאי גזע שרירים, הנקרא גם תאי לווין. תאי לווין מאופיינים בביטוי של שעתוק גורם Pax7 ומיקומם מתחת הבסיס לאמה בשריר השלד המנוחה. בעת הפציעה, תאי לווין מופעלים, עוברים התחדשות עצמית או בידול ליצירת סיבי מיואלה חדשים או לנתיך עם שנפגעו. הפונקציונליות של תאי לווין ב vivo ניתן לחקור באמצעות מודל פציעה מבוסס קרדיאטוקסין של שריר השלד. כדי ללמוד את הפונקציה של גן אחד במהלך התחדשות של שריר השלד, מודלים העכבר הטרנסגניים משמשים בעיקר. כאן, אנו מציגים שיטה חלופית לעכברים טרנסגניים, כדי לחקור את פונקציית הגן בתאי לווין במהלך התחדשות, למשל, במקרים בהם עכברים טרנסגניים אינם זמינים. אנו משלבים את הפציעה קרדיאטוקסין תיווך של שריר השלד מסוים עם הזריקה של הספק העצמי siRNA לתוך השריר מתחדשות אשר נלקח לאחר מכן על ידי תאי לווין בין תאים אחרים. כך, אנו מספקים שיטה לנתח פונקציה גנטית בתאי לווין במהלך התחדשות בתנאים פיסיולוגיים ללא צורך עכברים טרנסגניים.
שריר השלד הוא הרקמה הגדולה ביותר של הגוף המייצג כ 40% ממשקל הגוף הכולל המאפשר התנדבותי תנועה. האדריכלות רקמה של שריר השלד מורכב בעיקר של postmitotic, סופני הבדיל, מיוקלאוסין סיבים, כמו גם תאים אחרים שונים ממערכת העצבים ההיקפית, כלי דם מערכת, ו ביניים בתאים1. חשוב מכך, שריר השלד יש יכולת אדירה להתחדש ולשחזר פונקציה על פציעה או נזק2. תהליך זה תלוי בתאי גזע השריר תושב הרקמה המכונה גם תאים לווין3,4. תאי לווין ממוקמים בין המויוסיבים לבין הבסיס לאמינה ומאופיין בביטוי של הגורם התמלול Pax75,6,7. תחת תנאים הומסטטיים, תאי לווין הם השקט אבל להיות מופעל עקב פציעה טראומטית, למשל, דרך תרגיל תמהוני או ניסוי באמצעות הזרקה של ארס נחש קרדיאטוקסין6,8. לאחר הפעלת, Pax7 חיובי תאים לווין co-express MyoD ו-Myf5, אשר מבצע את תאי גזע לבידול מיוגני. תאי לווין המתנגדים לupregulation של גורמי מחויבות ישמרו על פוטנציאל הסטדיות שלהם ויחזרו לשקט כדי לחדש את בריכת תאי הגזע לדרישות עתידיות. לאחר התרחבות בריכת הקדמון מיוגני, רשתות מופעלות על ידי גורמי בידול כמו מיוגנמין כדי ליזום את יציאת מחזור התא ובידול מסוף. הmyoprogenitors האלה מנתיך זה לזה או לסיבים הקיימים שתורמים ליוקליאני כדי לשמור על הגודל של התחום היורור. מיוסיבים לבטא שריר מסוף בידול גנים כמו שרשרת כבד רירן. לבסוף, החדש שנוצר מיוסיבים לגדול ובוגרת כדי לבנות את יחידות פונקציונלי של שריר השלד9,10.
התחדשות של שריר השלד יכול להיות מושפע מתנאים שונים, כולל מחלות שריר אוהזדקנות 11,12, החל ליקויים מתון לתנאים סכנת חיים, למשל, ב ניוון שרירים duchenne13 , 14. לכן, הרפואה הרגנרטיבית שואפת לשחזר נזק פגום או בתפקוד שרירי השלד באמצעותכוח ההתחדשות הטבועה שלה על ידי התמקדות בתפקוד תאלווין 15,16. כדי להשתמש בפוטנציאל המלא שלה הבנה מקיפה של תאי לווין נישה אנדוגניים שלהם במהלך התחדשות של שריר השלד נדרש. למרות שגישות נסיוניות קיימות כדי לבודד תאי לווין הסמוכים לסיבים שלהם17, המורכבות המלאה של אינטראקציה תאית ומערכתית של תאי לווין עם הסביבה שלהם יכולה להיות רק לכידה בvivo. בהקשר זה, הידע הגדול על התחדשות שריר השלד נרכשה באמצעות מודלים לפגיעה בעכבר2,18.
כאן אנו מציגים מודל מסוים העכבר הניסיוני פציעה כדי ללמוד את תא גזע מתווך התחדשות של נזק קרדיאטוקסין המושרה של השריר הטישורי הקדמי ב vivo. קרדיאטוקסין, נחש המופק הרעלן cytolytic הגורם מיופולריזציה ו נמק, הוא מוזרק לתוך השריר הקדמי התחדשות, אשר בתורו יגרום ניוון רקמות ואחריו התחדשות. כדי לנתח את הפונקציה של גנים במהלך התחדשות חריפה, הספק העצמי siRNAs מוזרק ביום 3 לאחר הפציעה, בשיא של הרחבת התא לווין. בעלי חיים ניסיוניים מוקרבים בנקודות זמן שונות, והשרירים הקדמי העושורי נאספים. שרירי הגזור קפואים ומעובדים עבור הקפאה נוספת. מיקרוסקופ immunofluorescence משמש לניתוח סמנים של התחדשות. שיטה זו מאפשרת חקירה של הפונקציה של גן יחיד במהלך התחדשות תא לווין מונחה שריר השלד באמצעות עכברים סוג פראי.
כל הליכי בעלי החיים אושרו על ידי מחלקת הרווחה של בעלי החיים של התנגר לנדסברג Lebensmittelsicherheit und ורראוצ'רשיץ (03-048/16; TLV Bad Langensalza, גרמניה).
1. קרדיאטוקסין פגיעה שרירים הנגרמת
הערה: בצע את כל הניסויים הכרוכים בעכברים חיים בהתאם לחוק הלאומי לרווחת בעלי חיים ותחת תנאים אספטי מתאימים. כמו כן, יש להקריב את הקרבת בעלי חיים בהתאם לחוק הלאומי למען רווחת בעלי חיים.
2. הזרקה של העצמי הספק siRNA לתוך להתחדשות שריר קדמי התחדשות (ביום 3 Post קרדיאטוקסין פציעה)
3. חיתוך השריר הקדמי החישורי
4. קריוסיב של התחדשות שריר קדמי הפיזי
5. כתמים חיסוני עבור סמנים של התחדשות
6. המטאוקסילין ואאוזין צביעת
תוצאה אופיינית של המטאוקסילין ו אאוזין (H & E) מכתים את השריר הקדמי הטישורי לפני ואחרי הפציעה קרדיאטוקסין בתיווך מוצג באיור 4א, ב. בשרירי השליטה, הארכיטקטורה של השריר שלמה כנראה על ידי לוקליזציה של גרעינים בפריפריה של סיבים מיואיים וחוסר הצטברות של תאים מונונותים בחלל ביניים (איור 4A). 7 ימים לאחר קרדיאטוקסין מתווכת פציעה סיבים חדשים נוצרות מסומנים על ידי גרעיני מרכזי הממוקם (איור 4B). יתר על כן, הצטברות של תאים מונונותים ניתן לצפות, המורכב בעיקר של תאי לווין, אך גם תאים לא מיוגניים כמו תאים חיסוניים. השריר כולו צריך להיפגע על ידי המיקום המרכזי של כל והצטברות של תאים מונונוקלאואיים בחלק השריר כולו.
כדי לאפיין את ההתקדמות וההצלחה של תהליך ההתחדשות, מספר מעבדים אימונוofor, שימוש בסמנים של התחדשות ניתן לבצע. את מספר תאי הלווין ניתן להעריך על ידי כתמים עבור Pax7, סמן קאנוני עבור תאי לווין (איור 4ג, ד). שלושה ימים לאחר הפציעה מספר התאים לווין עולה (איור 4D), תאי לווין אינם נמצאים תחת הבסיס לאמנה יותר. כדי לנתח עוד יותר את תהליך ההתחדשות, סיבים מיותמים שנוצרו לאחרונה יכול להיות מוכתם עם נוגדנים מכוונים רירן התפתחותית (איור 4E). מיוסיבים שנוצרו לאחרונה להציג גרעינים מרכזי ממוקם ביטוי חזק של רירן התפתחותית. כמו סיבי מיוהים בוגרת, הביטוי של הרירן פוחתת התפתחותית, קוטרו של מיויוסיבי גדל בעוד גרעיני הם מגירה לפריפריה של סיבי מיוכן.
ההשפעה של גן יחיד על תהליך של התחדשות יכול להיות נחקר באמצעות עכברים טרנסגניים או כפי שמוצג כאן על ידי הזרקה של siRNA לספק את עצמו. Fluorescently התווית עצמית שליטה השליטה מקושקשות siRNA הוזרק לתוך השריר להתחדשות התחדשות הקדמית ביום 3 לאחר הפציעה, נקודת הזמן כאשר התפשטות של תאים לווין פסגות. יומיים לאחר ההזרקה של התאים siRNA לווין נותחו עבור נוכחות של siRNA המסומן בדגל (איור 4F). ניתחנו כמה תאי לווין לקחו את התווית באופן fluorescently כיום לאחר ההזרקה לתוך השריר מתחדשות (איור 5). כ 75% של כל תאי הלווין בשריר מיוצר מתחדשות היו חיוביים עבור התווית siRNA שכותרתו. יתר על כן, קבענו כי כ 74% של כל הסיבים להתחדשות מיותהיו חיוביים עבור התווית siRNA המסומן באופן מרומז כי או 74% הסיבים התחדשות מיועלה לקח את siRNA או כי התאים siRNA-חיובית לווין או התמזגו עם זה לזה כדי ליצור סיבים חדשים או היתוך עם הסיבים הקיימים כבר מחדש מחדש שהתרחשו (איור 5). זה מרמז כי תאים לווין לקחת את הספק העצמי siRNA וכי siRNA נמשכת בתאי הלווין לפחות יומיים.
איור 1: הזרקת קרדיאטוקסין לתוך השריר הקדמי הפיזי. (א) עכברים מורדם על ידי שאיפת isofלאנה והגפיים התחתונות מגולחים. (ב) 29 גרם מחט מוזרק לתוך השריר הקדמי הטישורי (C) והועבר לאורך עצם השוקה במהלך ההזרקה של הפתרון קרדיאטוקסין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: שלבים המעורבים בניתוח והקפאת השריר הקדמי הפצוע. (א) שרירי הגפיים האחוריות חשופים (ב) ו fascia המקיפים את השריר הקדמי החישורי נקרע כדי לחשוף את השריר. (ג) לאחר הסרת השריר, הוא נחתך באזור הבטן האמצעית לשני חצאים של גודל דומה באמצעות מספריים ישרים חדה (D). (ה) החצאים של השריר הגזור מוטבעים בעובש רדיד אלומיניום מלא בתמיסה קפואה וקפוא בחנקן נוזלי (F). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ציוד ושלבים המעורבים בהקפאה של השרירים הקדמי השרישורי. (א) הטמפרטורה הקאמרית של הקריוסטט מוגדרת ל-21 ° c. (ב) השריר החישורי הקדמי בתמיסת ההקפאה מותקן על מחזיק המדגם. (ג) סעיפים 14 יקרומטר מחוברים שקופיות מיקרוסקופ זכוכית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תמונות מייצגות של מתחדשות השרירים הקדמי השרישורי. H & E כתמים של השרירים הקדמי הקרדיאטוקסין לפני (A) ו -7 ימים לאחר פציעה (ב). (ג) בתאי לווין שPax7 חיוביים (באדום) ממוקמים מתחת ללאטינה הבסיס המסומן על ידי למינציה (בירוק). גרעינים מוכתם נגד DAPI (בכחול). Pax7 תאים חיוביים מסומנים בחץ. (ד) לאחר 10 ימים של התחדשות, סיבי מיוים מאופיינים על ידי גרעין ממוקם במרכז (בכחול), Pax7 מוצג באדום, למינציה בירוק. Pax7 תאים חיוביים מסומנים בחץ. (ה) שנוצר מחדש סיבים התפתחותיים רירן (באדום), הלמינציה בירוק, גרעינים מוכתם נגד dapi (בכחול). (ו) באמצעות התווית העצמית שכותרתו Sirna (sired, מתואר באדום) עדיין נמצא בתאי לווין (Pax7 חיוביים, בירוק, מסומן על ידי חץ בכניסה) 2 ימים לאחר ההזרקה של העצמי הספק sirna לתוך ליצור מתחדשות הקדמי הבריא שריר (הזרקה ביום 3 לאחר פציעה קרדיאטוקסין מתווכת). הלמינציה מוצגת בלבן, גרעינים מוכתמים באמצעות DAPI (בכחול). סרגל בקנה מידה = 100 יקרומטר (A ו-B), 50 יקרומטר (C-E), 25 יקרומטר (F). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: כימות הספיגה של siRNA המסומנת בדגל. (א) כימות של ספיגת sirna על ידי תאי לווין (Pax7 + תאים) ומתחדשות מיואיים 2 ימים לאחר ההזרקה לתוך שריר השלד מתחדשות. הזריקה בוצעה ביום 3 לאחר קרדיאטוקסין מתווכת פציעה. n = 3, קווי שגיאה מציגים את ה-SEM. (B) כבסיס לגרף המתואר ב-(א). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
כאן אנו מציגים שיטה לחקור את הפונקציה של גן מסוים במהלך התחדשות של שריר השלד ללא צורך בעלי חיים טרנסגניים. זה מושגת על ידי שילוב של פגיעה קרדיאטוקסין שרירים המושרה עם הזריקה של הספק העצמי siRNA לתוך שריר השלד מתחדשות ביום 3 לאחר הפציעה. תיארנו בפרוטרוט את ההליכים של פגיעה בשריר ידי קרדיאטוקסין, ההזרקה של הספק העצמי siRNA ועיבוד של השרירים שנקטפו לנתח את ההתקדמות של התחדשות. אנו מדגימים כי הזרקה של ארס נחש קרדיאטוקסין לתוך שריר השלד ביעילות פוגעת השריר כולו, כי האספקה עצמית sirnas נמצאים סביב 75% של כל תאי הלווין בין סוגי תאים אחרים יומיים לאחר ההזרקה שלהם לתוך ה מתחדשות שריר השלד (איור 4, איור 5).
תשומת לב מיוחדת צריך להיות ממוקד על פציעה הומוגנית של השריר הקדמי התחדשות מאז דרגות שונות של פגיעה בתוצאת ההתחדשות ובכך גם את ההשפעה של siRNA עשוי להיות מושפע. יתר על כן, חשוב בצורה קריטית כי כל האזור מתחדשות מוזרק עם הספק העצמי siRNA. לניתוח של תהליך ההתחדשות, מומלץ תמיד להשוות אזורים דומים של שריר השלד מתחדשות, ולכן, השריר הקדמי הפיזי צריך להיות חתוך במחצית להשוות תמיד את אזור הבטן האמצעית של השריר. כאשר לנתח את השריר, את כל הקריודור כל צריך להיות מנותח מאז הרכב מיוכי סיבים שונה השריר הקדמי החדש ולכן עשוי להתחדש באופן שונה.
הפונקציה של תאי לווין יכול להיות נחקר על ידי הליכים ניסיוניים שונים, כולל התרבות שלהם על הסמוך המבודד היחיד מיוסיבים17, על ידי השתלת ועל ידי ניתוח התחדשות של שריר השלד לאחר פציעה מושרה 18,19. חקירת הפונקציה של תאי לווין באמצעות מודל פציעה vivo מושרה, למשל, הזרקה של קרדיאטוקסין, מספק את היכולת לנתח את הפונקציה תא לווין גם במונחים של האינטראקציה שלהם עם סוגי תאים אחרים כגון מקרופאגים ו חקירת השפעת גורמים מערכתית2. הפציעה של שריר השלד יכול להתבצע על ידי אמצעים שונים, למשל, תרגיל תמהוני, הקפאת פציעה, הזרקה של bacl2 או הזרקה של מסוכנים נחש כגון קרדיאטוקסין או notexin18. בעוד תרגיל מוזר הוא כנראה שיטת הפציעה הפיזיולוגית ביותר, הפגיעה בשריר אחד מסוים מוגבלת רק20. פציעות הקפאה ניתן להחיל כאשר הגירה של תאי לווין לכיוון האתר של פציעה הוא מטרת המחקר או רק חלק ספציפי של השריר צריך להיפגע. ניסויים בחיסרון של פציעות הקפאה הוא הניתוח הפתוח שצריך לבצע כדי ליישם את הבדיקה מתכת מקורר. הזרקה של bacl2 או מסוכנים נחש היא השיטה הדרמטית ביותר של פציעה, ובכך מאתגר תא לווין הפונקציה ביותר. יתר על כן, הזריקה היא פולשנית מינימלית, זמן ניתוח, באופן כללי, הוא פחות מחמש דקות ואינו כרוך suturing, וכו '. ובכך למזער את הסיכון של זיהומים.
פגיעה בשריר משמשת בעיקר כדי לחקור את ההשלכות הפונקציונליות של אובדן של פונקציות גנים, למשל, אובדן של Pax77,21. במיוחד אם עכברים מיושנים הם המוקד של השאלה המדעית, הדור או השימוש בעכברים טרנסגניים הוא לעתים קרובות לא ריאלי. הזרקה של הספק העצמי siRNAs המיקוד גן ספציפי הוא חלופה קיימא במקרים אלה והשתמשו בהצלחה22. בקצרה, השרירים הקדמי הפרושורי של עכברים נפצע על ידי הזרקה של קרדיאטוקסין והספק העצמי siRNAs מכוון נגד fibronectin (FN) הוזרק ביום 3 לאחר הפציעה. שרירים נותחו 10 ימים לאחר הפציעה וירידה משמעותית במספרים תא לווין נצפתה siFN לעומת התנאים siRNA שליטה מקושקשות. היעילות של הנוק-אין נקבע ב-lysates שרירים שלמים על ידי ה-PCR בזמן אמת כמותי 2 ימים לאחר הזרקת siRNA, ירידה ברמות הביטוי של 58% הושג כי מסירה ו-מציאה יעילות מספיקים עבור פונקציונלי ניתוח22. חלופות לבדיקת יעילות הנוק-אין הן או כתמי החיסונית או ניתוח חיסוני או נוגדנים המכוונים נגד הגן היעד. את היעילות ואת הספציפיות של siRNA המשמש זריקות vivo צריך להיקבע לפני הזרקה לתוך עכברים, למשל, על ידי בדיקת היעילות בתאי לווין מבודדים או myoblasts חזיק ראשוני. השימוש במאגר חכם המורכב 4 siRNAs שונים לעומת Sirnas יחיד מגביר את היעילות של הסתרה, אך גם מגביר את הסיכון של המיקוד לא ספציפי. הספציפיות של כל רצפי siRNA המשמשים צריך להיבדק בתרבות התא כדי למנוע אפקטים מחוץ ליעד. כפקד, לא מיקוד מקושקשות siRNA יש להשתמש מאז ההזרקה של siRNA למשל עלול להשפיע על תהליך התחדשות בשל הזריקה, ובכך, נזק נוסף של השריר. נקודת הזמן של הזרקת siRNA היא בהתאם לשאלה המדעית ועל פרופיל הביטוי של הגן היעד. באופן כללי, הזרקה של הספק עצמית siRNA ביום 3 לאחר קרדיאטוקסין פציעה מטרות רוב הגנים חשוב עבור התפשטות תא לווין מאז פסגות לווין הפצת התפשטות סביב היום 3 לאחר הפציעה. נקודת הזמן עבור הזרקת siRNA הראשון לא צריך להיות פחות מ 48 h לאחר פציעה קרדיאטוקסין מאז נפח ההזרקה של קרדיאטוקסין הוא גבוה למדי וספיגה מחדש של הנוזל היה צריך להתרחש לפני הזרקת פתרונות נוספים לתוך השריר. באופן כללי, זריקות מרובות של siRNAs או שילוב של siRNAs שונים אפשרי למרות שצריך לשקול כי כל הזרקה לתוך השריר מחדש גורם נזק נוסף.
מגבלה אחת של השיטה המתוארת היא העובדה, כי ההשפעה נצפתה היא לא בהכרח רק תלוי בנוק של הגן היעד בתאי לווין, אבל יכול להיות מיוחס סוגים אחרים של תאים כגון תאים חיסוניים או בתאי מחולל הזרע fibro. לכן, יש צורך לשלב ניסויים אלה עם ניסויים בחקירת אוכלוסייה טהורה של תאי לווין. אפשר לבצע ניסויים באמצעות תרבויות מיוסיבים צף, שבו תאי לווין הם מתורבתים על הסיבים הסמוכים שלהם או לבצע ניסויים השתלת באמצעות תאי לווין מבודדים17.
חלופה להזרקה של הספק העצמי siRNAs היא הזרקה של מעכבי מולקולה קטנה או חלבונים רקומביננטי אשר ניתן לבצע, בהתאם לשאלה המדעית. למשל, ההזרקה של חלבון מטריקס fibronectin או מולקולה קטנה מעכבי של JAK/STAT איתות בוצע בהצלחה עכברים בגילאי15,16. ניתוח של פונקציה גנטית מסוימת סוג תא אחד במהלך התחדשות של שריר השלד, למשל, בתאי לווין, ניתן רק באמצעות שימוש של מודל העכבר הגנטי inducible. זריקות של הספק העצמי siRNAs, חלבונים רקומביננטי או מעכבי מולקולה קטנה עשויה להשפיע על סוגי תאים מרובים להתחדשות שריר השלד.
היינו רוצים להודות לכריסטינה בוחר וכריסטין מתחזה לסיוע טכני מעולה ו Saskia שטיינר לעזרה עם קביעת היעילות של הטיפול siRNA. אנו מודים לשירות הליבה היסטולוגיה לתמיכה טכנית גדולה, במיוחד סבין לנדמן ולינדה רות'נבורגר. אנחנו גם מודים לעכבר מתקן החי ב FLI לתמיכה מעולה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מתוך הגרמני Forsch, מייסמייססלססרמייישסביםף (MA-3975/2-1) והגרמני (DKH-JvM-861005) לJ.v.M.
המחברים לא מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Isoflurane | Henry Schein | Isothesia | inhalation narcotics |
Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
Anesthesia System (Tec 7) with inhalation box + nose masks | Tem Sega | Minihub | |
Shaver for rodents | isis | GT420 | |
Cardiotoxin | Latoxan | L8102 | snake venom needed for muscle injury |
Accell siRNA smart pool | Dharmacon | depending on your target gene | self delivering siRNA |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-21206 | secondary antibody |
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher | A-21123 | secondary antibody |
Coverslips | VWR | 631-1574 | |
CV Mount | Leica | 14046430011 | mounting medium for immunohistochemistry |
DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | nuclear staining |
devMHC antibody | DHSB | F.1652 | |
Eosin Y | Thermo Fisher | 73104 | |
Haematoxylin Gill No3 | Sigma-Aldrich | GHS316-500ML | |
Insulin syringe (29 g) | Terumo | 3SS05M2813 | syringue used for muscle injections |
Laminin antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
M.O.M blocking reagent | Vector labs | MKB-2213 | blocking for immunofluorescent staining |
Meloxicam | Boehringer Ingelheim | Metacam | analgesics |
OCT | Thermo Fisher | 6502 | tissue embedding |
Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | satellite cell specific antibody |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher | P36934 | aequos mounting medium |
Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | tissue embedding |
Superfrost plus | Thermo Scientific | J1830AMNZ | microscope slides |
TritonX-100 | Amresco | 0694-1L | permeabilization reagent |
Dissection tools | |||
Dumont 5, straight | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Dumont 7, curved | Fine Science Tools | 11272-40 | |
Extra fine Bonn scissors (cutting edge: 13 mm) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-16 | |
Spring scissors (cutting edge: 5 mm, tip diameter: 0.35 mm) | Fine Science Tools | 91500-09 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved