Il Madagascar sibilo scarafaggio come modello alternativo Non mammiferi animali per studiare la virulenza, patogenesi e l'efficacia dei farmaci

Presentiamo un protocollo per utilizzare il Madagascar sibilo scarafaggio come modello alternativo non mammiferi animali fare virulenza batterica, patogenesi, tossicità dei farmaci, l'efficacia dei farmaci e studi di risposta immunitaria innata.

Molti aspetti dell'immunità innata sono conservati tra mammiferi e insetti. Un insetto, il Madagascar sibilo scarafaggio dal genere Gromphadorhina, può essere utilizzato come modello animale alternativo per lo studio della virulenza, interazione ospite-patogeno, risposta immunitaria innata e l'efficacia dei farmaci. Dettagli per l'allevamento, cura e allevamento di blatta di sibilo sono forniti. Abbiamo anche illustrare come si può essere infettati con batteri come gli agenti patogeni intracellulari Burkholderia mallei, pseudomallei del b. e b. thailandensis. Uso della blatta di sibilo è poco costoso e risolve problemi normativi a che fare con l'uso dei mammiferi nella ricerca. Inoltre, risultati trovati utilizzando il modello di scarafaggio sibilante sono riproducibili e simili a quelli ottenuti utilizzando modelli mammiferi. Così, la blatta di sibilo del Madagascar rappresenta un host surrogato attraente che dovrebbe essere esplorato lo svolgimento di studi sugli animali.

L'uso degli insetti come alternative non mammiferi di modelli animali per studiare la patogenesi batterica e difesa innata ospite è stato guadagnando slancio negli ultimi anni. Logisticamente, ciò è dovuto il loro costo relativamente economico e la facilità di ottenimento, alla gestione e cura per gli insetti rispetto ai mammiferi. Non c'è anche nessuna politica di regolamentazione che disciplina l'uso degli insetti nella ricerca; non è soggetto alla competenza o limitazioni imposte da qualsiasi animale utilizzano Comitato o agenzia governativa. Gli insetti come modelli animali surrogati sono particolarmente suscettibili agli studi di screening completo per fattori di virulenza, interazioni ospite-patogeno e valutazioni di efficacia del farmaco anti-microbica. Loro utilizzo può ridurre il numero di mammiferi utilizzati per la ricerca, superando alcuni dei dilemmi etici inerenti allo svolgimento della sperimentazione animale ^1,2.

Gli insetti possono servire come host surrogato perché c'è un elevato grado di comunanza tra il sistema immunitario innato di insetti e mammiferi ^1,3. Plasmatocytes insetto sia macrofagi dei mammiferi fagocitare microrganismi ⁴. La controparte dell'insetto per i neutrofili è emociti ^5,6. Vie di burst ossidativo intracellulare in insetto e cellule di mammifero sono simili; specie reattive dell'ossigeno in entrambi sono prodotte da orthologous p47^phox e p67^phox proteine ⁵. Le cascate di segnalazione a valle dei recettori Toll in insetti e recettori Toll-like e interleukin-1 nei mammiferi sono notevolmente simili; entrambi provocare la produzione di peptidi antimicrobici, quali defensine ⁷. Così, gli insetti possono essere utilizzati per studiare i meccanismi immuni innati generali condivisi da metazoi.

Un insetto chiamato il Madagascar sibilo scarafaggio dal genere Gromphadorhina, è uno della più grande specie di scarafaggio che esiste, in genere arrivano fino a 5-8 cm a maturità. È nativo solo per l'isola del Madagascar ed è caratterizzato dal suono sibilante che rende - un suono che si produce quando la blatta di sibilo espelle l'aria attraverso aperture respiratorie chiamate spiracoli ⁸. Il sibilo caratteristico serve come una forma di comunicazione sociale tra sibilo scarafaggi per corteggiamento e aggressione ⁹ e può essere sentito quando un uomo è disturbato nel suo habitat. Blatta di sibilo del Madagascar è lenta rispetto allo scarafaggio americano e altre specie di parassiti urbani. È facile da curare e allevare; una blatta di sibilo incinta può produrre prole di 20 a 30 alla volta. Un bambino sibilo scarafaggio, chiamato una ninfa, raggiunge la maturità sessuale a 5 mesi dopo subendo 6 mute e può vivere fino a 5 anni, sia in natura che in cattività ⁸.

Abbiamo utilizzato il Madagascar sibilo scarafaggio come un host surrogato per l'infezione con gli agenti patogeni intracellulari Burkholderia mallei, pseudomallei del b.e b. thailandensis ^10,11. La virulenza di questi patogeni nel sibilo scarafaggi è stata confrontata alla loro virulenza nel modello animale benchmark per Burkholderia, criceto siriano. Abbiamo trovato che la dose letale 50% (LD₅₀) di pseudomallei del b. e b. mallei era simile in entrambi modelli ¹¹. Interessante, b. thailandensis, sebbene non virulenti nel modello di roditore, è letale nei scarafaggio sibilante ¹¹. Questa differenza rispetto a b. thailandensis infezione sottolinea l'utilità del modello scarafaggio sibilante; B. thailandensis attenuando mutanti possono essere risolti più facilmente nella Blatta di sibilo che nei modelli del roditore. Inoltre, b. thailandensis viene spesso utilizzato come organismo modello per pseudomallei del b. e b. mallei ^10,12,13, identificare mutazioni attenuante in esso potrebbe portare a target simili nei suoi parenti più virulenti.

Nonostante la differenza di virulenza di b. thailandensis nella Blatta di sibilo contro il criceto siriano, mutazioni nei fattori di virulenza critici, come quelli nel sistema di secrezione tipo 6-1 (T6SS-1), che sono attenuando in b. mallei e B. pseudomallei, sono similmente attenuanti per thailandensis b. ¹¹. Il modello di scarafaggio sibilante è ulteriormente convalidato in quanto singoli mutanti di T6SS (T6SS-2-T6SS-6) in b. pseudomallei, che non incidono sulla virulenza in criceti siriani, rimangono virulenti nei sibilo scarafaggi ¹¹. Così, la blatta di sibilo è un modello animale di surrogati valida per le tre specie di Burkholderia . Recentemente abbiamo utilizzato la blatta di sibilo come un modello animale di surrogato per esaminare l'efficacia della clorochina farmaco anti-malarici (CLQ) contro Burkholderia infezione ¹⁰ e la sua tossicità.

Qui, descriviamo l'allevamento e la cura del Madagascar sibilo scarafaggio e fornire dettagli su come infettare questo insetto con tre specie di Burkholderia . Inoltre, ci dimostrano che la blatta di sibilo è un modello praticabile surrogato per studiare la virulenza e l'efficacia dei farmaci nelle infezioni da Burkholderia e che probabilmente può anche servire come un host surrogato per altri batteri patogeni in studi simili.

1. preparati per il mantenimento di una colonia di scarafaggio sibilante

1. Preparare le gabbie per gli scarafaggi sibilante a vivere in. Applicare un sottile strato di vaselina, circa 20 a 30 mm di larghezza, alla circonferenza delle pareti interne nella parte superiore della gabbia per evitare i sibilanti scarafaggi da arrampicata fuori dalla gabbia e fuggire.
   Nota: Sibilo scarafaggi possa essere alloggiato in una varietà di contenitori che hanno una grande superficie, sono di altezza sufficiente e hanno palpebre. Utilizzare il mouse gabbia (~ 43 x 23 cm x 20 cm). Per le gabbie destinate a 37 ° C, non applicare vaselina.
2. Includono una scatola di cartone dell'uovo posizionata capovolto all'interno della gabbia per fornire un nascondiglio per gli insetti naturalmente timidi. Non sostituire la scatola di cartone dell'uovo con uno in polistirolo per prevenire l'ingestione di plastica.
3. Non forniscono biancheria da letto per pulizia più facile e aumentare la visibilità delle ninfe appena schiusi.
4. Ottenere l'alimento di cane asciutto che contiene una composizione di ~ 20% di proteina grezza. Grossolanamente macinare il cibo per cani con un robot da cucina o un frullatore e conservare a 4 ° C.
5. Ottenere diversi piatti poco profonde e pietre di acquario o una spugna per cibo e acqua.
   Nota: capsule di Petri sono raccomandati.

2. sibilo scarafaggio cura e allevamento

1. Ottenere nazionali Madagascar sibilo scarafaggi (~ 5cm) da un allevatore commerciale. Le specie utilizzate in questo protocollo sono Gromphadorhina laevigata. Disimballare la scatola di spedizione contenente i sibilanti scarafaggi subito dopo il ricevimento.
2. Seguire le linee guida istituzionali adeguate per l'uso di dispositivi di protezione individuale nella gestione degli animali.
   Nota: Utilizzare guanti monouso spessi per la manipolazione scarafaggi tarsali artigli di una blatta di sibilo sono taglienti.
3. Trasferimento fino a 75 grandi scarafaggi sibilanti (> 3 cm) per grande gabbia. Trasferire le ninfe appena schiusi e più piccole (< 3 cm) a una gabbia separata.
   Nota: Mantenere significativamente più di 75 grande sibilo scarafaggi per gabbia del mouse potrebbero portare al deterioramento della salute della Colonia e potrebbero anche provocare morti.
4. Gestire uno scarafaggio appena standard, che è grigiastro a colori, delicatamente ed evitare di schiacciarlo. In alternativa, consentire l'esoscheletro scurire e indurire prima di maneggiarlo.
   Nota: Non è necessario rimuovere gli acari, Gromphadorholaelaps schaeferi, che spesso accompagnano sibilanti scarafaggi al ricevimento da allevatori. Gli acari vantaggioso mantenere pulito i sibilanti scarafaggi e sono innocui per gli esseri umani.
5. Alimentazione sibilanti scarafaggi con alimento di cane asciutto di terra in un piatto fondo una o due volte a settimana. Fornire abbastanza cibo per cani per garantire che i sibilanti scarafaggi hanno cibo a sufficienza fino l'alimentazione successiva. Scartare qualsiasi cibo che è diventato umido e ammuffito.
6. Oltre a cibo per cani, fornire cut up frutta e verdura, come le mele, patate o lattuga, in un piatto piano. Gettare cibo ammuffito o marcio.
7. Fornire acqua potabile una volta o due volte a settimana in un piatto piano, ma non riempire troppo il piatto per evitare perdite nella gabbia. Posto pietre piccolo acquario o con una spugna nel piatto per fornire una piattaforma di atterraggio per piccole ninfe. Utilizzare acqua ad osmosi inversa, se disponibile.
8. Tenere sibilo scarafaggi al buio a temperature che vanno dai 21 ° C ai 30 ° C. Tenere grandi scarafaggi sibilanti destinati a sperimentazione ad una temperatura più bassa (~ 21 ° C) per ~ 2 mesi diminuire l'allevamento e la gravidanza. Al contrario, mantenere le ninfe alle più alte temperature (28 ° C a 30 ° C) per accelerare la crescita.
   Nota: Mantenere gabbie a temperatura ambiente (21 ° C) in un oscuro armadietto.
9. Fornire umidità includendo una pentola di acqua se sibilo scarafaggi sono conservati in un'incubatrice.
10. Pulire la gabbia di scavare fuori asciutte feci regolarmente o trasferendo sibilo scarafaggi a una gabbia pulita ogni 2-3 settimane. Tenere asciutto il fondo della gabbia. Pulire la gabbia immediatamente se l'acqua in eccesso è consentito di accumulare e mescolare con l'escremento nella parte inferiore della gabbia.

3. scarafaggio preparazione per la sperimentazione

1. Trasferire il numero appropriato di sibilanti scarafaggi in una gabbia di un incubatore a 37 ° C 1 a 3 settimane prima di un esperimento per acclimatazione. Comprendono un gruppo di controllo per l'iniezione. Questo periodo di acclimatazione è fondamentale per evitare shock termici durante la sperimentazione.
2. Non applicare vaselina per gabbie destinate a 37 ° C poiché l'alta temperatura si scioglie la gelatina.
3. Controllare i sibilanti scarafaggi ogni 1 o 2 giorni per sostituire il cibo e acqua e pulire la gabbia.
4. Ottenere contenitori di plastica trasparente monouso per alimenti con coperchio per il raggruppamento degli scarafaggi sibilanti durante la sperimentazione. Per la ventilazione, perforare i fori nel coperchio o sul lato del contenitore con un chiodo e un martello.
   Nota: Utilizzare contenitori tappo a vite sopra snap cap contenitori nell'impostazione di livello 3 di biosicurezza. Contenitori di protezione automatici possono essere rinforzati con nastro adesivo, se necessario.
5. Il giorno dell'iniezione, distribuire 6-12 acclimatati sibilanti scarafaggi nei gruppi per contenitore, garantendo una distribuzione uguale di sesso e massa corporea.
6. Determinare il sesso del singoli sibilanti scarafaggi. Determinare il sesso dall'importanza di corna presenti maschi e la mancanza della stessa sulle femmine.
7. Pesare gli scarafaggi sibilanti individuali. Per facilitare la pesatura di una blatta di sibilo sull'equilibrio, è necessario racchiuderlo all'interno di due barche di pesare che hanno stati tarati.
   Nota: Per coerenza tra esperimenti, utilizzare sibilanti scarafaggi con un peso di 4 a 8 g. Tuttavia, nessuna differenza nella sopravvivenza dopo l'infezione sono state trovate fra piccole (1,5-2 g) e grandi (6-8 g) sibilo scarafaggi. Per studi di farmaco, utilizzare sibilanti scarafaggi con un peso di ~ 5 g per ottenere una concentrazione di farmaco più coerenza al corpo massa.
8. Al posto di un piatto di acqua, includono acqua alta contenuto frutta o verdura, ad esempio una fetta di mela o di patate. Gettare cibo marcio. Non forniscono acqua supplementare per mantenere il contenitore asciutto.
9. Ritorno sibilo scarafaggi a 37 ° C fino a iniezioni.

4. coltura e preparati

Nota: Le specie batteriche utilizzate in questo protocollo sono mallei b. pseudomallei del b. e b. thailandensis. Tutte le manipolazioni con b. mallei e b. pseudomallei devono avvenire in classe II o cabine di sicurezza biologica di classe III si trovano a un livello di biosicurezza (BSL) laboratorio 3. Eseguire manipolazioni con b. thailandensis in simili di sicurezza biologico mobili situate in un laboratorio BSL2 o BSL3. Seguire istituzionale procedura operativa standard per il lavoro di BSL3. Seguire le linee guida istituzionali per l'uso di dispositivi di protezione individuale durante la manipolazione di batteri.

1. Preparare un piatto matrice di Burkholderia con almeno 3 giorni prima dell'infezione. Luria-Bertani (Lennox) (LB) di utilizzare agar per pseudomallei del b. o b. thailandensis e uso LB agar completati con 4% glicerolo per b. mallei. Batteri di striscia da uno stock di glicerolo 25% conservato a-80 ° C.
   Nota: Striscia sempre il piatto matrice direttamente dallo stock congelati glicerolo; evitare il passaggio seriale dei batteri da piastra a piastra come ciò potrebbe causare ridotta virulenza.
2. Inoculare il brodo di 10-20 mL LB con diverse colonie di b. pseudomallei o b. thailandensis dalla piastra di master. Allo stesso modo inoculare libbra di brodo completato con 4% glicerolo per b. mallei.
3. Agitare il brodo di coltura a 175 a 250 giri/min a 37 ° C per ~ 18 h.
4. Centrifugare 2 o 3 mL di cultura a 5.000 x g per 10 min.
5. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet batterico in tampone sterile di fosfato salino (PBS, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mm Na₂PO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, pH 7.4).
6. Diluire i batteri con PBS per ottenere una densità ottica (OD) di 0,5, misurata a un'assorbanza a 600 nm in uno spettrofotometro.
7. In serie di diluire i batteri dieci volte in tampone PBS dalla partenza OD di 0,5. Utilizzare queste sospensioni per infezione.
8. Determinare la Colonia formando unità (CFU) dell'inoculo di diluizione seriale e placcatura di aliquote di 100 µ l su agarizzati. Incubare le piastre a 37 ° C per 24-48 h.

5. droga preparazioni

1. Determinare la giusta quantità di farmaco da somministrare al corpo massa. Il dosaggio CLQ dato per la blatta di sibilo era basato sul dosaggio standard per i mammiferi, che è di 50 mg/kg/giorno.
2. Risospendere o diluire il farmaco di interesse nel veicolo. Ad esempio, è possibile diluire CLQ in PBS ad una concentrazione di 12 mg/mL. Questa concentrazione fornisce 300 µ g di droga per un g ~ 6 sibilando iniettato uno scarafaggio in un 25 µ l volume.
3. Se necessario, è possibile sterilizzare la soluzione droga facendolo passare attraverso un filtro per siringa 0,22 µm.
4. Conservare la soluzione di droga a 4 ° C fino all'utilizzo. Riscaldare la soluzione di droga per almeno 21 ° C (temperatura ambiente) prima di iniezioni.

6. montaggio dell'iniettore

1. Impostare il puntatore al volume desiderato (25 µ l) ruotando la vite di regolazione su una pipetta ripetitiva.
2. Spingere il pulsante di rilascio della pipetta ripetitivo verso l'interno e tirare verso l'esterno il pestello. La pipetta ripetitiva è ora pronta ad accogliere una siringa caricata.
   Nota: Calibrare il volume espulso dalla pipetta ripetitiva misurando la quantità di acqua espulsa su un equilibrio.
3. Riempire una siringa da 1 mL con sospensione contenente batteri o droga.
4. Collegare la siringa a una sterile 26 o 27 G x ½ pollice (o meno) dell'ago.
5. Picchiettare la siringa per le bolle d'aria nella parte superiore del galleggiante ed espellere le bolle e qualche sospensione in un contenitore riempito con candeggina al 10%.
6. Scatta la siringa sulla clip siringa della pipetta ripetitiva con la smussatura dell'ago rivolto verso l'alto.
7. Tirare la barra di sblocco e premere il pulsante erogatore saldamente per eseguire iniezioni in bianco in un contenitore riempito con candeggina al 10%, fino a quando lo stantuffo della siringa è contro il pestello.
8. Eseguire 1 o 2 ulteriori iniezioni in bianco per garantire fuoriuscite di liquido dalla siringa. La pipetta ripetitiva è pronto / a per preparazioni iniettabili.

7. scarafaggio iniezioni

1. Eseguire tutte le iniezioni di scarafaggio in un armadietto in un BSL2 di sicurezza biologica classe II o classe III o BSL3 impostazione utilizzando istituzionale raccomandati dispositivi di protezione individuale.
2. Pulire le superfici di lavoro nell'armadietto di sicurezza che possono venire a contatto con gli scarafaggi sibilanti. Utilizzare candeggina al 10% seguita da etanolo al 70% per rimuovere residuo candeggina. Lasciare asciugare la superficie per aria.
3. Con una mano, afferrare la blatta di sibilo al suo fianco. Immobilizzare una blatta di sibilo tale che non è in grado di rinculo durante l'iniezione. Piegare leggermente la blatta di sibilo in modo che le membrane cutanee tra le terga addominale sono esposti.
4. Con l'altra mano, tenere la pipetta ripetitiva tale che l'ago è a 0° di angolo di 30° dalla linea mediana dorso-ventrale della blatta di sibilo. Forare la membrana cutanea adiacente il 3^rd, 4^tho 5^th tergum dall'estremità posteriore.
   Nota: Entrata dell'ago nella Blatta di sibilo all'angolo indicato assicura che l'ago non andare e uscire fuori la blatta di sibilo. Il sito di iniezione assicura che il materiale espulso è contenuto all'interno della cavità addominale riempita di emolinfa. Pratica che tiene i sibilanti scarafaggi e iniettando con acqua prima di iniezioni di impresa con batteri vivi o droga.
5. Premere il pulsante di erogazione saldamente per iniettare il volume. Estrarre delicatamente l'ago allo stesso angolo come quello usato per l'ingresso.
6. Posto la blatta di sibilo iniettata in un contenitore separato per distinguerlo dai sibilanti scarafaggi che non sono ancora state iniettate. Pulire qualsiasi emolinfa che può avere trasudava fuori dal sito di iniezione.
7. Continuare a iniettare altri scarafaggi sibilante all'interno di un gruppo utilizzando la siringa e l'ago stesso. Interrompere l'iniezione prima che lo stantuffo della siringa raggiunge il fondo del barile per prevenire dosaggio incompleta nell'ultima iniezione.
8. Per le iniezioni multiple in un singolo Blatta di sibilo, come quelli con batteri e droga, iniettare a lati diversi di una tergum sul lato dorsale degli scarafaggi sibilante. In alternativa, è possibile eseguire iniezioni multiple iniettando alle terga differenti (3^rd a 5^th).
9. Assicurarsi che i coperchi dei contenitori siano ben fissati. Rafforzare i coperchi con nastro adesivo, se necessario.
10. Incubare il sibilo scarafaggi in un incubatore umidificato 37 ° C.

8. registrazione sibilo scarafaggio morbosità e mortalità

1. Eseguire tutti gli esami di scarafaggio sibilante in un armadietto con istituzionali di sicurezza biologica classe II o classe III dispositivi personali di protezione raccomandati. Pulire le superfici nell'armadietto di sicurezza con candeggina al 10% seguita da etanolo al 70%. Asciugare l'area di lavoro all'aria.
2. Punteggio ottenuto sibilanti scarafaggi una o due volte al giorno per un periodo di 1 o 2 settimane utilizzando la morbosità segnando tabella (tabella 1).
3. Rimuovere gli scarafaggi morti sibilanti dal contenitore e registrare il numero di sopravvissuti.
4. Trasferire i restanti live sibilo scarafaggi in un contenitore pulito se l'umidità in eccesso ha accumulato nella parte inferiore del contenitore. In alternativa, è possibile utilizzare asciugamani di carta monouso per togliere l'umidità in eccesso.
5. Sostituire il cibo marcio quotidiano e ritorno sibilo scarafaggi nell'incubatore umidificato 37 ° C.
6. Alla fine dello studio, posizionare sopravvissuti in un sacchetto di biohazard e congelare a-80 ° C per eutanasia.
7. Analizzare statisticamente i dati¹⁴ per determinare LD₅₀ e dall'analisi di Kaplan-Meier e Log-Rank per la sopravvivenza. Come con tutte le sperimentazioni dell'insetto, alcuni decessi possono verificarsi nel gruppo di controllo. Questi decessi sono attribuiti alla mortalità naturale degli insetti ¹⁵. Per una discussione più dettagliata su come conto per decessi nel gruppo di controllo, vedere riferimento¹⁵.

Questa sezione illustra i risultati che sono stati ottenuti quando le blatte di sibilo del Madagascar sono stati infettati con b. mallei, b. pseudomallei, o b. thailandensis; i risultati mostrano che questo insetto è un modello animale trattabile per diverse specie di Burkholderia nello studio della virulenza, tossicità dei farmaci e l'efficacia dei farmaci contro l'infezione batterica. Altri scarafaggi sibilanti è sopravvissuto in gruppi che sono stati infettati con i mutanti attenuati (Δhcp1) rispetto a gruppi che sono stati infettati con wildtype b. pseudomallei K96243, parentale b. mallei SR1, o b. thailandensis (DW503 Figura 1). Al contrario, l'infezione con virulenti mutanti (Δhcp2 o Δhcp3) ucciso i sibilanti scarafaggi allo stesso modo il wildtype pseudomallei del b. (Figura 1). Infezione con la specie di Burkholderia avirulente mammiferi, b. thailandensis E264 e suoi derivati sensibili di aminoglicoside DW503, mostrano che il modello di scarafaggio sibilante è particolarmente adatto per il delucidamento mutazioni in B. thailandensis che portano ad attenuazione (Figura 2). Così, è un modello animale di più raccordo per b. thailandensis studi rispetto ai modelli del roditore. Aumentando le concentrazioni o le iniezioni multiple di CLQ non uccidere gli scarafaggi sibilanti; Ciò illustra che la tossicità dei farmaci possono anche essere testati nel modello scarafaggio sibilante (Figura 3). Inoltre, l'efficacia di CLQ contro b. thailandensis infezione è illustrato nella Figura 4. Aspetti importanti del sibilo scarafaggio cura e infezione sono illustrati nella Figura 5. Tabella 1 può essere utilizzato per segnare la morbosità di sibilo scarafaggi durante gli esperimenti.

Figura 1: Sibili sopravvivenza scarafaggio dopo l'iniezione con virulento e attenuato Burkholderia . Otto scarafaggi sibilanti per ogni gruppo sono stati iniettati con 25 µ l di sospensione batterica. Sibilanti scarafaggi sono stati controllati per la sopravvivenza una volta al giorno per 5 giorni. (A) scarafaggi sibilante sono stati iniettati con parentale b. mallei SR1 (piazza aperta) o il mutante dihandicap 1 Δ (quadrato chiuso) a 100 CFU. (B) scarafaggi sibilante sono stati iniettati con wild-type b. pseudomallei K96243 (piazza aperta), Δhcp1 (quadrato chiuso), Δhcp2 (triangolo aperto), o Δhcp3 (cerchio aperto) mutante a 10 CFU. (C) scarafaggi sibilante sono stati iniettati con parentale thailandensis b. DW503 (piazza aperta) o mutante dihandicap 1 Δ (quadrato chiuso) a 100 CFU. Figura originariamente pubblicato in riferimento ¹¹. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Sibilo sopravvivenza scarafaggio dopo l'iniezione di aumento delle concentrazioni di B. thailandensis per LD₅₀ determinazione. Otto scarafaggi sibilanti per ogni gruppo sono stati iniettati con wildtype b. thailandensis E264 (A) o il derivato di aminoglicoside sensibili DW503 (B) e la sopravvivenza è stato segnato per 7 giorni. Il DL₅₀ è 3 CFUs per E264 e 6 CFU per DW503. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Sibilo sopravvivenza scarafaggio dopo l'iniezione con la clorochina. Cinque scarafaggi sibilanti per ogni gruppo sono stati iniettati una volta (A) o due volte in due giorni consecutivi (B) con 250 (diamante), (quadrato), 500 o 1.000 µ g (triangolo) CLQ o PBS (cerchio) e la sopravvivenza è stato segnato per 7 giorni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Sibili sopravvivenza scarafaggio dopo infezione con B. thailandensis e trattamento con clorochina. scarafaggi sibilanti 10 a 12 per ogni gruppo sono stati infettati con thailandensis b. DW503 e non trattati (Piazza), infettati con thailandensis b. DW503 e trattati con (CLQ triangolo), trattati con CLQ da solo (a diamante), o erano non infetti e non trattati (cerchio). Sopravvivenza è stato registrato per 7 giorni. La curva di sopravvivenza, un composto di 4 esperimenti separati, viene espresso come una percentuale pari al numero totale dei superstiti diviso per il numero totale di sibilanti scarafaggi per ogni trattamento nei giorni indicati. L'inoculo CFU dato variava da 10 a 20 LD₅₀. Figura originariamente pubblicato in riferimento ¹⁰. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Immagini relative al modello di scarafaggio sibilante. (A), A donna sibilo scarafaggio manca sporgenze sulla sua testa. (B) una blatta di sibilo del maschio può essere identificato dalla presenza di corna. Blatta di sibilo (C), A deve molt fuori suo esoscheletro a crescere. L'insetto emergente è bianco a colori ma si scurisce gradualmente come il nuovo esoscheletro indurisce. (D) sibilo scarafaggi può essere alloggiata in un contenitore di plastica tappo snap con fori di ventilazione durante un esperimento. (E) sotto BSL3 condizioni, sibilo scarafaggi sono alloggiate in vite tappo plastica contenitori. (F), un grosso topo gabbia è usata per ospitare una colonia di scarafaggio sibilante. Dovrebbe contenere cibo, acqua e una scatola di cartone dell'uovo per nascondersi. (G) scarafaggi sibilante sono iniettati con una siringa da 1 mL, collegata a una pipetta ripetitiva. Blatta di sibilo (H) A viene inoculato tramite l'iniezione attraverso la membrana cutanea tra le terga addominale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: sibilo morbosità scarafaggio segnando sistema. Il Punteggio complessivo per un gruppo di scarafaggi sibilanti è basato sulla blatta di sibilo con il punteggio più alto nel gruppo.

Condizioni sperimentali ottimali iniziano con una colonia di scarafaggio sibilante sano, che richiede un minimo ma impegno costante di tempo. Anche se sibilo scarafaggi può andare per un periodo di tempo relativamente lungo (~ settimane) senza cibo e acqua, manutenzione settimanale o bi-settimanale gabbia dovrà essere fornite. Ciò comprende il controllo il cibo e la fornitura di acqua e assicurando che la gabbia sia asciutta. Mantenere le condizioni di vita asciutto è particolarmente importante durante l'acclimatazione e l'incubazione a temperature più elevate; troviamo che più sibilanti scarafaggi morti e ad un ritmo superiore alle più alte temperature quando contenitori non venivano pulite ogni giorno.

La chiave per dosaggio costante o inoculazione di blatta di sibilo consiste nel premere il pulsante di erogazione sulla pipetta ripetitiva saldamente. Si consiglia di praticare questa tecnica, il caricamento della siringa sulla pipetta ripetitiva ed esecuzione di iniezioni in bianco. Il passo che richiede più tempo della procedura per un operatore di nuovo alla tecnica è holding o immobilizzare la blatta di sibilo durante l'iniezione. È pertanto consigliabile anche molto pratica la tecnica della holding e iniettando più scarafaggi sibilanti prima di affrontare un progetto più ambizioso. Questo può essere ottenuto mantenendo un piccolo gruppo di sibilanti scarafaggi che viene utilizzato esclusivamente per le pratiche di iniezione. Anche se abbiamo trovato che iniezione può essere eseguita rapidamente quando si tiene la blatta di sibilo sul suoi lato, altre tecniche per detenzione sibilo scarafaggi (ad es. immobilizzare una blatta di sibilo su una superficie curva liscia; che si appollaia il sibilo scarafaggio sul dito medio mentre il dito indice e il pollice immobilizzare esso) può essere comodo e dovrebbe essere esplorato da operatori diversi.

L'uso del modello scarafaggio sibilante offre diversi vantaggi rispetto ad altri modelli di insetti (per esempio la larva di verme di cera Galleria mellonella e il moscerino della frutta Drosophila melanogaster) che precedentemente sono stati usati come modelli animali con Burkholderia infezione ^16,17,18. Ad esempio, la finestra sperimentale per una blatta di sibilo varia da mesi e anni consentendo flessibilità ai ricercatori, considerando che per una larva di verme di cera è solo cinque giorni ^19,20. Per una larva di verme di cera, il periodo di cinque giorni coincide anche con il encasement del bozzolo; rimozione dei bozzoli è un processo laborioso che può causare traumi fisici per le larve ²⁰. Ancora più importante, un mutante di b. thailandensis T6SS-1 che è attenuato in entrambi il criceto siriano e il sibilo scarafaggio ¹¹, era virulento in Galleria, suggerendo che la Galleria non è un buon modello per lo studio della alcuni mutanti come T6SS in b. thailandensis (dati non mostrati).

L'uso di blatta di sibilo presenta parecchi vantaggi sopra la Mosca della frutta. La blatta di sibilo è grande e di una massa di corpo sostanziale con un esoscheletro duro che permette di essere facilmente gestita durante le iniezioni. Al contrario, la Mosca della frutta è piccola e richiede attrezzature specializzate per l'inoculazione. Inoltre, considerando che la blatta di sibilo, naturalmente, vive a temperature che sono simili a o supera la temperatura del corpo umano, la temperatura ottimale per la Mosca della frutta è tra 22 a 28 ° C. Questo rende il moscerino della frutta di uso limitato nel contesto di studiare i processi che dipendono dalla temperatura del corpo umano (ad esempio formazione di cellule giganti multi-nucleate Burkholderia ¹⁰).

Esistono alcuni svantaggi per l'utilizzo di sibilo scarafaggi. La genetica di blatta di sibilo non è anche studiata come quelli di Drosophila o anche Galleria. La blatta di sibilo ha anche un notevole "ick" o fattore lordo. Tuttavia, la blatta di sibilo rimane un host surrogato attraente e praticabile per Burkholderia fornendo chiari vantaggi al suo uso nella ricerca che sono unici per la specie. Come abbiamo illustrato che il Madagascar sibilo scarafaggio è un host surrogato trattabili per Burkholderia, molto probabilmente può anche servire come un host surrogato per altri batteri patogeni e ci stiamo attualmente utilizzando in tali studi.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

J. Chua, N.A. Fisher, D. DeShaze e A.M. Friedlander progettato le procedure descritte nel manoscritto. J. Chua, N.A. Fisher, S.D. Falcinelli e D. DeShaze eseguito gli esperimenti. J. Chua ha scritto il manoscritto.

Gli autori ringraziano Steven A. Tobery per l'eccellente assistenza tecnica e Joshua J. W. Roan, Nora D. Doyle, David P. Fetterer, Nicholas R. Carter e Steven J. Kern per l'analisi statistica.

Il lavoro è stato supportato dalla Defense minaccia riduzione Agenzia proposta n #CBCALL12-THRB1-1-0270 A.M.F e #CBS. MEDBIO.02.10.Rd.034 a D.D.

Opinioni, interpretazioni, conclusioni e raccomandazioni sono quelle degli autori e non sono necessariamente approvati dall'esercito statunitense.

Il contenuto di questa pubblicazione non riflettono necessariamente le opinioni o le politiche del dipartimento della difesa, né fa menzione di nomi commerciali, prodotti commerciali, o organizzazioni implicano l'approvazione dal governo statunitense.