Analisi delle proteine ​​di legame della cap in cellule umane esposte a condizioni fisiologiche di ossigeno

Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5' cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m⁷GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex is by far the most common pathway to initiate protein synthesis in eukaryotic cells, but stress-specific variations of this complex are now emerging. Purifying cap-binding proteins with an affinity resin composed of Agarose-linked m⁷GTP (a 5' mRNA cap analog) is a useful tool to identify factors involved in the regulation of translation initiation. Hypoxia (low oxygen) is a cellular stress encountered during fetal development and tumor progression, and is highly dependent on translation regulation. Furthermore, it was recently reported that human adult organs have a lower oxygen content (physioxia 1-9% oxygen) that is closer to hypoxia than the ambient air where cells are routinely cultured. With the ongoing characterization of a hypoxic eIF4F complex (eIF4F^H), there is increasing interest in understanding oxygen-dependent translation initiation through the 5' mRNA cap. We have recently developed a human cell culture method to analyze cap-binding proteins that are regulated by oxygen availability. This protocol emphasizes that cell culture and lysis be performed in a hypoxia workstation to eliminate exposure to oxygen. Cells must be incubated for at least 24 hr for the liquid media to equilibrate with the atmosphere within the workstation. To avoid this limitation, pre-conditioned media (de-oxygenated) can be added to cells if shorter time points are required. Certain cap-binding proteins require interactions with a second base or can hydrolyze the m⁷GTP, therefore some cap interactors may be missed in the purification process. Agarose-linked to enzymatically resistant cap analogs may be substituted in this protocol. This method allows the user to identify novel oxygen-regulated translation factors involved in cap-dependent translation.

Il controllo traslazionale sta emergendo come un passo altrettanto importante regolazione trascrizionale dell'espressione genica, in particolare durante i periodi di stress cellulare ^1. Un punto focale di controllo traduzione è al fattore limitante di iniziazione dove le prime fasi della sintesi proteica coinvolgono il legame della eucariotica fattore di iniziazione 4E (eIF4E) al 7-methylguanosine (m ⁷ GTP) 5 'tappo di mRNA ² . eIF4E è parte di un complesso di nome trimeric eIF4F che include eIF4A, una elicasi RNA, e eIF4G, una proteina impalcatura necessaria per l'assunzione di altri fattori di traduzione e le 40S del ribosoma ^3. In condizioni fisiologiche normali, la stragrande maggioranza degli mRNA vengono tradotti attraverso un meccanismo di cap-dipendente, ma sotto i periodi di stress cellulare circa il 10% di mRNA umani contiene 5 'UTR che potrebbero consentire di traduzione cap-indipendente rito di iniziazione ^1,4. traduzione Cap-dipendente è stata storicamente sinonimounità organizzative con eIF4F, tuttavia, le variazioni specifiche di stress di eIF4F sono diventati un argomento di tendenza ^5-8.

Vari stress cellulari causano attività eIF4E da reprimere attraverso la mammalian target of complesso rapamicina 1 (mTORC1). Questa chinasi diventa compromessa sotto stress, che provoca l'aumento di attività di uno dei suoi obiettivi, la proteina 4E-binding (4E-BP). Non fosforilata 4E-BP si lega ad eIF4E e blocca la sua capacità di interagire con eIF4G causando la repressione della traduzione cap-dipendente ^9,10. È interessante notare che, un omologo di eIF4E chiamato eIF4E2 (o 4EHP) ha un'affinità molto più basso per 4E-BP ^11, forse permettendogli di eludere la repressione dello stress-mediata. Infatti, inizialmente caratterizzato come un repressore della traduzione a causa della sua mancanza di interazione con eIF4G ^12, eIF4E2 avvia la traduzione di centinaia di mRNA che contengono RNA elementi di risposta all'ipossia nella loro 3 'UTR durante lo stress ipossico ^6,13. Questo mi attivaziones raggiunto attraverso le interazioni con eIF4G3, RNA-binding protein 4 motivo, e il fattore inducibile dall'ipossia (HIF) 2α a costituire un complesso eIF4F ipossica, o eIF4F ^{H 6,13.} Come un repressore in condizioni normali, eIF4E2 si lega con GIGYF2 e ZNF598 ^14. Questi complessi sono stati, in parte, identificati attraverso Agarose-linked m ⁷ resine GTP affinità. Questo metodo classico ¹⁵ è standard nel campo della traduzione ed è i saggi migliore e più tecnica comunemente usata per isolare complessi cap-binding in pull down e in vitro di legame ^16-19. Come le macchine di traduzione cap-dipendente sta emergendo come flessibile ed adattabile con le parti tra loro cambiare ^6-8,13, questo metodo è un potente strumento per individuare rapidamente nuove proteine di legame della cap coinvolti nella risposta allo stress. Inoltre, le variazioni di eIF4F potrebbe avere vaste implicazioni come diversi sistemi modello eucarioti sembrano utilizzare un omologo eIF4E2 per le risposte di stress talicome A. thaliana ^20, S. pombe ^21, D. melanogaster ^22, e C. elegans ^23.

L'evidenza suggerisce che le variazioni di eIF4F non possono essere strettamente limitato a condizioni di stress, ma essere coinvolti nella fisiologia normale ^24. La fornitura di ossigeno ai tessuti (alle estremità capillari) o all'interno dei tessuti (misurata tramite microelettrodi) varia dal 2-6% nel cervello ^25, 3-12% nei polmoni ^26, 3.5-6% nell'intestino ^27, 4% in il fegato ^28, 7-12% nel rene ^29, 4% nel muscolo ^30, e 6-7% nel midollo osseo ^31. Le cellule e mitocondri contengono meno del 1,3% di ossigeno ^32. Questi valori sono molto più vicini a ipossia che l'aria ambiente in cui le cellule sono normalmente coltivate. Questo suggerisce che ciò che è stato precedentemente pensato come processi cellulari specifici per ipossia possono essere rilevanti in un ambiente fisiologico. È interessante notare che, eIF4F e eIF4F ^H partecipare attivamente al inizio della traduzione di piscine distinte o classi di mRNA in diverse linee cellulari umane differenti esposti all'ossigeno fisiologica o "physioxia" ^24. Low ossigeno spinge anche il corretto sviluppo del feto ³³ e le cellule hanno generalmente più alti tassi di proliferazione, durata della vita più lunga, meno danni al DNA e meno risposte allo stress generale in physioxia ^34. Pertanto, eIF4F ^H è probabilmente un fattore chiave per l'espressione dei geni selezionati in condizioni fisiologiche.

Qui, forniamo un protocollo per le cellule di coltura in condizioni di ossigeno fisiologiche fissi o in un intervallo di fluttuazione dinamica che rischia più rappresentativa di microambienti tissutali. Un vantaggio di questo metodo è che le cellule sono lisate nella workstation ipossia. E spesso non è chiaro come la transizione dalla coltura cellulare ipossica a lisi cellulare avviene in altri protocolli. Le cellule vengono spesso rimossi prima da un piccolo incubatore ipossia esserefore lisi, ma questa esposizione all'ossigeno potrebbe influenzare percorsi biochimici come risposta cellulare a ossigeno è rapida (uno o due min) ^35. Alcune proteine di legame della cap richiedono interazioni con una seconda base o possono idrolizzare il GTP m ^7, quindi alcuni interattori capitalizzazione possono perdere nel processo di purificazione. Agarosio-linked per analoghi cap enzimaticamente resistenti può essere sostituito in questo protocollo. Esplorare l'attività e la composizione di eIF4F ^H e altre varianti del eIF4F attraverso il metodo descritto qui farà luce sui complessi macchinari di espressione genica che le cellule utilizzano in condizioni fisiologiche o risposte allo stress.

1. Preparativi per colture cellulari

1. Acquisto commercialmente disponibili scorte di cellule umane.
   NOTA: Questo protocollo utilizza il carcinoma del colon-retto HCT116 e renali cellule primarie umane prossimali tubulari epiteliali (HRPTEC).
2. Fare 500 ml di mezzo per la cultura di HCT116: Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) / medio alta di glucosio integrato con 7,5% siero fetale bovino (FBS) e 1% penicillina / streptomicina (P / S).
3. Fare 500 ml di mezzo per la cultura di HRPTEC: media delle cellule epiteliali integrato con il 5% FBS, 1% supplemento di crescita delle cellule epiteliali, e l'1% P / S.
4. Preparare 500 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS): 140 mm NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 15 mm KH ₂ PO _4. Regolare il pH a 7,4 e sterilizzare in autoclave per 40 minuti a 121 ° C.

2. Apertura di Cell Coltura

1. Con attenzione aspirare il medium da un piatto confluenti 80-90% senza disturbare tegli cellule.
2. Aliquota 3-5 ml di PBS 1x per piatto cultura, rock delicatamente ogni pallone per rivestire la superficie del piatto, e con attenzione aspirare il PBS 1x. Ripetere l'operazione per un secondo lavaggio 1x PBS.
3. Aliquota 3 ml di acido tripsina-etilendiamminotetraacetico 0,05% (EDTA) in ogni piatto cultura e delicatamente in modo uniforme di roccia per rivestire le cellule con tripsina-EDTA. Incubare a 37 ° C per 2-3 minuti.
4. Trasferire le cellule staccate in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugare a 4000 xg per 90 sec.
5. Risospendere il pellet cellulare in 1 ml di DMEM completo.
6. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Calcolare quanti apirogene e polistirolo 100 millimetri cella cultura piatti sono necessari per raggiungere una densità di semina iniziale di circa 2.500-5.000 cellule per cm ^2.
7. terreno completo Pre-caldo coltura cellulare made in passi 1.2 o 1.3 in un bagno d'acqua C 37 ° C per 30-45 minuti.
8. Decontaminare la bottiglia medio e fiala cella con il 70% di etanolo. Da questo punto in avanti tuttile operazioni devono essere eseguite in modo asettico.
9. Aliquotare 6 ml di DMEM completo in altrettante piatti di coltura cellulare 100 mm richiesti per utilizzare l'intero volume di cellule congelate nella densità di semina di cui al punto 2.6.
10. Trasferire il volume di sospensione cellulare calcolata al punto 2.6 a ciascuno dei piatti 100 coltura mm. Oscillare ciascuna piastra manualmente per distribuire uniformemente le cellule sulla superficie della piastra.
11. Posizionare la testa di serie 100 millimetri piatto di coltura cellulare in incubatore a 37 ° C in atmosfera di CO ₂ 5%. Consentono alle cellule di incubare, almeno 24 ore prima che i passi successivi.

3. Trapianto

1. Mostra ogni piatto di coltura cellulare al microscopio per determinare la percentuale di confluenza cellule (cellule% coprono l'area del piatto). le cellule per l'incubatore e pre-caldo terreno completo e PBS 1x Return. Procedere al passaggio successivo, se le cellule sono 80-100% confluenti.
2. aspirare accuratamente la media trascorsa senza disturbare ilcellule in ogni piatto cultura.
3. Aliquota 3-5 ml di PBS 1x per piatto cultura, rock delicatamente ogni pallone per rivestire la superficie del piatto, e con attenzione aspirare il PBS 1x. Ripetere l'operazione per un secondo lavaggio 1x PBS.
4. Aliquota 3 ml di 0,05% tripsina-EDTA in ogni piatto cultura e agitare delicatamente per rivestire in modo uniforme le cellule con tripsina-EDTA. Incubare a 37 ° C per 2-3 minuti.
5. Durante questa incubazione, un'aliquota di 10 ml di terreno completo in altrettanti piatti della cultura sono necessari per ottenere la densità cellulare di 2.500-5.000 cellule per cm ^2.
6. Quando le cellule hanno staccata dalla piastra, aggiungere rapidamente 3 ml di inibitore della tripsina 1x definito e miscelare delicatamente il piatto per 1 min per garantire che tutte le tripsina-EDTA è stato neutralizzato.
7. Trasferire le cellule staccate in una sterile 15 ml provetta e mettere da parte. Aggiungere 3 ml di PBS 1X per il piatto per raccogliere tutte le cellule rimanenti e il trasferimento che per lo stesso 15 ml provetta.
8. Agglomerare le cellule per centrifugazione a 150 xgper 5 min.
9. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 3 ml di mezzo completo.
10. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e seminare 150 mm piastre di coltura contenente 15 ml di terreno completo per ottenere una densità cellulare di 2.500-5.000 cellule per cm ^2. Utilizzare due di 150 mm per ogni test cap-binding.
    NOTA: diffusione di ossigeno alle cellule tramite mezzo liquido dipende dal volume di ^36. Si raccomanda di mantenere il volume dei mezzi coerenti tra esperimenti se le cellule aderenti o cellule in sospensione sono utilizzati. I supporti possono essere pre-condizionati (incubate nella postazione di lavoro per 24 ore, come discusso in discussione) per evitare questi variabilità in diffusione.
11. Porre le capsule testa di serie-cultura nel termostato a 37 ° C in atmosfera di CO ₂ 5%. Consentono alle cellule di incubare, almeno 24 ore prima di procedere alle fasi successive.

4. L'esposizione Physioxic

1. Visualizza le cellule sotto il microscopio. per besrisultati t, in modo che le cellule sono 70-80% confluenti per una esposizione di 24 ore, il 50-60% confluenti per un'esposizione 48 ore, e il 40-50% confluenti per un'esposizione 72 ore.
2. Posizionare le cellule in una workstation ipossia per il tempo desiderato (24, 48, o 72 ore a seconda dell'esperimento).
3. Impostare la workstation per la physioxia appropriata.
   NOTA: Ad esempio, un'impostazione 3% O ₂ sarebbe accompagnata da 5% di CO ₂ e il 92% N _2.
   NOTA: Se le fluttuazioni di ossigeno all'interno di una gamma dinamica si desiderano su una linea temporale specifico, il programma il programma nello strumento o regolare manualmente le impostazioni di ossigeno agli intervalli desiderati.
4. Impostare l'umidità al 60%. L'atmosfera workstation è molto secca comunque, e dei media sarà notevolmente evapora durante lunghi esperimenti (> 48 ore). Mantenere una riserva media in un pallone di coltura di cellule all'interno della stazione di lavoro (in modo che il supporto viene equilibrato con l'ambiente workstation) per ricostituire i mezzi di comunicazione nel DIS coltura cellularelui è.
   NOTA: Ogni soluzione che interagirà con le cellule prima di lisi (come PBS e tripsina-EDTA) deve essere pre-condizionato per 24 ore prima dell'uso nella workstation ipossia in modo che l'ossigeno disciolto equilibra con l'ossigeno atmosferico ^36.
5. Mantenere le cellule all'interno della stazione di lavoro fino lisi.

5. Buffer Preparazione per il saggio Cap-binding

1. Preparare 1x Tris-Buffered Saline (TBS).
   1. In 800 ml di dH ₂ O, sciogliere 8,76 g di NaCl e 6,05 g Tris Base.
   2. Portare la soluzione ad un pH finale di 7,4 usando 1 M HCl.
   3. Portare il volume finale di 1 L con dH ₂ O.
2. Preparare tampone di lisi non denaturazione. Preparare Lysis Buffer il giorno del test tappo vincolante. Fare tampone di lisi in più per lavare le perline agarosio vuote e la γ-amminofenil-m ⁷ GTP agarosio perline C10-linked (passi 7.9 e 7.13).
   1. In 7 ml di dH ₂ O, aggiungere 160 ml 5 M NaCl, 160 microlitri 1 M Tris-HCl pH 7,4, 40 microlitri 200 mM NaF, 40 microlitri 1 M MgCl ₂ e 40 microlitri 1 mM sodio orthovanadate.
   2. Aggiungere 40 ml di Igepal alla soluzione 7 ml. Tagliare la punta della pipetta per aiutare recuperare Igepal in quanto è estremamente viscoso.
   3. Mescolare pipettando su e giù, o vortice, la soluzione 7 ml finché tutti i Igepal è stato dissolto.
   4. Aumentare il volume finale della soluzione a 8 ml e tenere in ghiaccio.
3. Preparare 4x dodecil solfato di sodio (SDS) -page Sample Buffer.
   1. In un becher, unire 16 ml 1 M Tris-HCl pH 6,8, 12,64 ml di glicerolo, e 8 ml ditiotreitolo (DTT).
   2. Aggiungere 3,2 g di SDS e 0,16 g di blu di bromofenolo. Lasciare in polvere per sciogliere completamente mescolando con un bastoncino magnetico.
   3. Aliquota in provette da 1,5 ml microcentrifuga e conservare a -20 ° C.

6. cellulare Lysis

1. Preparare non denaturazione-tampone di lisi e tenere in ghiaccio il giorno di The cap-binding assay.
2. Pre-calda 1x PBS e tripsina in un bagno d'acqua a 37 ° C per 30 min.
3. Aliquota 980 ml di tampone di lisi in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga per ogni test cap-binding in corso di esecuzione.
4. Aggiungere 10 ml di 4- (2-amminoetil) benzensolfonile fluoruro cloridrato e 10 ml di 100x cocktail di inibitori delle proteasi ai 980 ml di tampone di lisi. Tenere in ghiaccio.
5. Eliminare il supporto da ogni piatto 150 millimetri in un contenitore di rifiuti all'interno della stazione di lavoro ipossia.
6. Lavare le cellule con 3-4 ml di caldo 1x PBS e scartare tutto il liquido.
7. Aggiungere 1 ml di caldo 0,05% tripsina-EDTA per ogni piatto e lasciate riposare per 2 minuti o fino a quando le cellule non sono rispettate piastra.
8. Usando una pipetta, trasferire le cellule di una piastra in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Ripetere se necessario in modo che ciascuna piastra di cellule viene trasferito in un 1,5 ml provetta separata.
9. Centrifugare le provette da 1,5 ml microcentrifuga a 6.000 g per 90 sec to agglomerare le cellule.
10. Aspirare il tripsina con una pipetta senza disturbare il pellet. Se il pellet è disturbato, ri-centrifugare la provetta da 1,5 ml a 6.000 g per 90 sec.
11. Lavare le cellule con caldo PBS 1x pipettando gentilmente 200 ml di PBS nella provetta appena sopra il pellet. Re-centrifuga se il pellet è disturbato.
12. Aspirare il PBS senza disturbare il pellet.
13. Pipettare 500 microlitri dalle 1 ml preparati soluzione tampone di lisi sul primo pellet cellulare. Risospendere il pellet interamente pipettando su e giù.
14. Combinare le cellule risospese con il secondo pellet di cellule e risospendere il secondo pellet pipettando su e giù. Ripetere questo processo fino a quando tutti i pellet sono stati combinati e risospese per ogni campione.
15. Combinare il lisato con i restanti 500 ml di tampone di lisi in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
16. Rimuovere campioni dalla workstation ipossia.
    NOTA: Dopo aver aggiunto tampone di lisi, unall fasi successive devono essere eseguite in aria ambiente come workstation ipossia è impostato a 37 ° C e le seguenti operazioni devono essere eseguite a freddo (4 ° C o su ghiaccio).
17. Lisare le cellule utilizzando blanda agitazione ruotando i campioni a 4 ° C per 1,5-2 ore.
18. Centrifugare le cellule lisate a 12.000 xg per 15 min a 4 ° C per rimuovere i detriti cellulari.
19. Trasferire il lisato in una nuova provetta da 1,5 ml e scartare il pellet.
20. Prenotare una porzione (5-10%) del surnatante da utilizzare nel suo complesso controllo di input lisato cellulare per future analisi western blot.

7. Assay Cap-binding

1. Per ogni campione, trasferire 50 ml di vuoto agarosio liquami controllo tallone e 50 ml di liquame tallone γ-amminofenil-m ⁷ GTP agarosio C10-linked per separare 1,5 ml microprovette. Utilizzare forbici per rimuovere la punta della pipetta per facilitare la raccolta della poltiglia tallone.
2. Agglomerare le perline by centrifugazione della poltiglia a 500 xg per 30 sec.
3. Rimuovere il surnatante con attenzione e risospendere le sfere in 500 ml di TBS.
4. Ripetere i punti 7.2 e 7.3. Agglomerare le perline a 500 xg per 30 sec e rimuovere il surnatante.
5. Trasferire il surnatante contenente il lisato dal punto 6.19 al tubo di 1,5 ml microcentrifuga contenente le perline agarosio vuote.
   NOTA: Le perle di agarosio bianco agiscono come una fase di pre-compensazione per rimuovere le proteine ​​dal lisato che interagiscono in modo non specifico con il tallone.
6. Incubare per 10 minuti a 4 ° C con agitazione.
7. Pellet le perline agarosio vuote per centrifugazione a 500 g per 30 sec.
8. Trasferire il lisato alla provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente le γ-amminofenil-m ⁷ GTP agarosio perline C10-linked.
9. Lavare le perline agarosio vuote da risospendere le sfere in 500 ml di tampone di lisi, pellet le perline per centrifugazione a 500 xg per 30 secondi, e scartando la Supernatant. Ripetere questa operazione quattro volte per un totale di cinque lavaggi.
10. Risospendere le sfere agarosio vuote nel tampone campione 1x SDS-PAGE, e far bollire le perline per 90 secondi a 95 ° C. Conservare a -20 ° C per una futura analisi western blot per osservare se la proteina di interesse si lega in modo non specifico per il tallone.
11. Incubare il lisato con le perline γ-amminofenil-m ⁷ GTP agarosio C10-collegate con agitazione per 1 ora a 4 ° C per catturare le proteine di legame della cap.
12. Agglomerare le γ-amminofenil-m ⁷ GTP agarosio perline C10-linked per centrifugazione a 500 g per 30 sec. Eliminare il surnatante.
13. Lavare le γ-amminofenil-m ⁷ GTP agarosio perline C10-linked ripetendo il passaggio 7.9.
14. Risospendere le sfere in 600 microlitri di tampone di lisi.
15. Aggiungere GTP ad una concentrazione finale di 1 mM.
16. Incubare le γ-amminofenil-m ⁷ GTP agarosio perline C10-linked + 1 mM GTP con agitazione per 1 ora a 4 ° C. Nota: Questosarà dissociarsi proteine che interagiscono in modo non specifico con m ⁷ GTP (vale a dire, di interagire anche con GTP non metilato).
17. Agglomerare le γ-amminofenil-m ⁷ GTP agarosio perline C10-linked per centrifugazione a 500 g per 30 sec.
18. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml microcentrifuga e aggiungere 200 ml di 4x tampone campione SDS-PAGE (50 mM Tris-HCl, 100 mM DTT, 2% SDS, 0,1% blu di bromofenolo e 10% glicerolo). Conservare il campione di controllo GTP a -20 ° C per una futura analisi Western Blot ^37. Lavare le perline ripetendo il passaggio 7.9.
19. Risospendere le sfere in 1x tampone campione SDS-PAGE (50 mM Tris-HCl, 100 mM DTT, 2% SDS, 0,1% blu di bromofenolo e 10% glicerolo) e ebollizione a 95 ° C per 90 sec. Conservare il m frazione ⁷ GTP-bound a -20 ° C per una futura analisi Western Blot ^37.

Analisi di Capacità Cap-binding in risposta ad ossigeno di eIF4E e eIF4E2 in un m ⁷ GTP Affinity Colonna

Le figure 1 e 2 rappresentano le macchie occidentali del tipico m ⁷ GTP affinità purificazione delle due principali proteine di legame della cap in risposta alle fluttuazioni di ossigeno in due linee cellulari umane: umane renale prossimale cellule primarie tubulari epiteliali (HRPTEC) in F IGURA 1 e carcinoma colorettale ( HCT116) in Figura 2. Le cellule sono mantenute al disponibilità di ossigeno indicata per 24 ore per garantire che l'ossigeno disciolto nel mezzo liquido è equilibrata con l'aria all'interno della workstation ipossia. La corsia di ingresso (IN) rappresenta il 10% di tutto il lisato cellulare prima della m vengono aggiunti ⁷ perline agarosio GTP-linked per catturare le proteine di legame della cap. Questo corsia ingresso è utilizzato come base per misurare arricchimentodi una proteina bersaglio in m ⁷ GTP pulldown. La corsia GTP è l'eluato dalle m ⁷ GTP perle che erano eluire con 1 mM GTP. Questa fase consente per la rilevazione di proteine ​​che riconoscono anche GTP non metilato. Le proteine di legame della cap eIF4E e eIF4E2 riconoscono m ⁷ GTP specificamente, ma il loro omologo eIF4E3 (non mostrato qui) si lega anche a GTP non metilato. La capacità di eIF4E e eIF4E2 di impegnare la struttura di tappo 5 'mRNA (m ⁷ GTP) può essere misurato comparando l'intensità delle loro bande in m ⁷ colonna GTP relativa all'intensità nella corsia di ingresso (pool totale disponibile).

Tale quantificazione può essere effettuata misurando l'intensità dei pixel delle bande proteiche per tre repliche biologiche con un software di analisi delle immagini, come ImageJ. I risultati sono espressi come mezzo relativo delle unità di densità (RDU) ± errore standard della media. valori grezzi prima di normalizzazioneda campioni sia sperimentali e di controllo sono stati confrontati con t-test non appaiati a due code di Student. P <0.05 è stato considerato statisticamente significativo. Questo esperimento rappresentativo mostra che le due linee cellulari diverse gamme di ossigeno per un loro utilizzo eIF4E e eIF4E2. La figura 1 mostra che nel HRPTEC solo eIF4E si lega fortemente al m ⁷ GTP al 8% O ₂ (Figura 1A), che sia eIF4E e eIF4E2 sono significativamente associati con m ⁷ GTP 3-5% O ₂ (Figura 1B - C), e che solo eIF4E2 lega fortemente ai m ⁷ GTP all'1% O ₂ (Figura 1D). In figura 2, in cellule HCT116, l'uso di ossigeno-dipendente di queste proteine di legame della cap è differente: solo eIF4E lega significativamente al m ⁷ GTP a 12% O ₂ (Figura 2A), entrambe le proteine di legame della cap legano significativamente al m ⁷ GTP nell'intervallo 5-8% O ₂(Figura 2B - C), e solo eIF4E2 si lega in modo significativo al m ⁷ GTP al 3% O ₂ (Figura 2D). L'assenza di eluizione dalla colonna GTP m ⁷ con GTP mostra che eIF4E e eIF4E2 sono specifici per m ⁷ GTP e non riconoscono GTP non metilato. I grafici a barre rappresentano la quantificazione delle tre repliche biologiche utilizzando ImageJ. I nostri risultati dimostrano che due principali proteine di legame della cap, eIF4E e eIF4E2, differiscono nella loro capacità di legare il ⁷ GTP struttura cap mRNA m in un modo di ossigeno-dipendente.

Sulla base di letteratura precedente, che queste due proteine ​​avviare la traduzione di classi uniche di mRNA, questo spostamento dell'attività cap-binding potrebbe comportare diversi proteomi generato per adattarsi ai cambiamenti nella disponibilità di ossigeno. Questa tecnica può essere utilizzata per caratterizzare fattori inizio della traduzione nuove che interagiscono con il tappo mRNA 5 '(o con le proteine di legame della cap) attraverso un approccio mirato Western Blot o un approccio di ampio respiro quali l'analisi di spettrometria di massa di un GTP eluato m ^7.

Figura 1: eIF4E e eIF4E2 attività si sovrappongono durante physioxia in HRPTEC 3-5% O _2. Saggi di acquisire utilizzando m ⁷ GTP perline in renale prossimale cellule epiteliali tubulare umana (HRPTEC) lisati esposti a (A) 8%, (B) 5%, (C) 3% o (D) 1% O ₂ per 24 ore. GTP, lavaggio GTP per misurare specificità per m ⁷ GTP; m ⁷ GTP, proteine legate a m ⁷ perle GTP GTP dopo lavaggio. Western blot rappresentativi sono mostrati e dati di almeno tre esperimenti indipendenti sono stati quantificati da ImageJ ed espressi in unità di densità relativa (RDU) rispetto al 10% di ingresso (IN) del complesso lisato cellulare. * P <0.05 (spaiato due code test t) è stato considerato un cambiamento significativo quando si confrontano l'arricchimento di eIF4E o eIF4E2 nella frazione cap-bound (m ⁷ GTP) alla IN. Dati, media ± errore standard della media (SEM) di tre esperimenti indipendenti. Questa ricerca è stato originariamente pubblicato nel Journal of Biological Chemistry. Timpano, S. e Uniacke, le cellule umane in coltura J. sotto ossigeno fisiologico utilizzano due proteine ​​di legame della cap per reclutare mRNA distinti per la traduzione. 2016; 291 (20): 10.772-82 ^24. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. eIF4E e le attività eIF4E2 sovrappongono durante physioxia in HCT116 5-8% O _2. Saggi di acquisire utilizzando m ⁷ GTP perline in HCT116 colorettale umano lisati carcinoma esposti a (A) 12%, (B) 8%, (C) 5% o (D) 3% O ₂ per 24 ore. GTP, lavaggio GTP per misurare specificità per m ⁷ GTP; m ⁷ GTP, proteine legate a m ⁷ perle GTP GTP dopo lavaggio. Western blot rappresentativi sono mostrati e dati di almeno tre esperimenti indipendenti sono stati quantificati da ImageJ ed espressi in unità di densità relativa (RDU) rispetto al 10% di ingresso (IN) del tutto lisato cellulare. * P <0.05 (spaiato due code test t) è stato considerato un cambiamento significativo quando si confrontano l'arricchimento di eIF4E o eIF4E2 nella frazione cap-bound (m ⁷ GTP) alla IN. Dati, media ± errore standard della media (SEM) di tre esperimenti indipendenti. Questa ricerca è stato originariamente pubblicato nel Journal of Biological Chemistry. Timpano, S. e Uniacke, le cellule umane in coltura J. sotto ossigeno fisiologico utilizzano due proteine ​​di legame della cap per reclutare mRNA distinti per la traduzione. 2016; 291 (20): 10.772-82 ^24. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

L'analisi delle proteine ​​di legame della cap in cellule umane esposte a condizioni di ossigeno fisiologiche può consentire l'identificazione di nuovi fattori di inizio della traduzione di ossigeno-regolamentato. L'affinità di questi fattori per tappo di mRNA o di altre proteine cap-associate al 5 'può essere misurata con la forza della loro associazione di m ⁷ GTP-linked perline agarosio. Un avvertimento di questa tecnica è che misura il potenziale cap-legame delle proteine ​​post-lisi, ma essa è stata eseguita in condizioni non denaturanti che mantengono le interazioni proteina-proteina e modificazioni post-traduzionali (PTM). Diverse interazioni proteina-proteina mediano il legame della famiglia eIF4E al cap al 5 '. Il 4E-BP lega e reprime eIF4E bloccando la sua interazione con eIF4G e prevenire il reclutamento dei 43S pre-iniziazione complessi ^38. Il complesso eIF4E / 4E-BP rimane legato al tappo mRNA 5 ', bloccando ogni iniziazione da tale trascrizione, e ci riesceessere utilizzato come marker per l'inibizione eIF4E in m ⁷ colonne GTP affinità. Viceversa, l'interazione di eIF4E con eIF4G sul m ⁷ colonne GTP potrebbe essere un marcatore per l'iniziazione traduzione attiva. PTM sono un altro metodo per regolare l'attività dei fattori di inizio della traduzione. Ad esempio, la fosforilazione di eIF4E da Mnk1 può aumentare la sua affinità per il mRNA 5 'Cap ^39. Il modificatore proteina codificata dal interferone stimolata Gene 15 (ISG15) è un PTM che aumenta l'attività tappo vincolante eIF4E2 in risposta ad induzione di interferone tramite infezione patogeno ^40. Il gene ISG15 contiene un elemento di risposta all'ipossia nel suo promotore suggerendo che questo sistema potrebbe regolare eIF4E2 in ossigeno basso. Molto poco si sa su come PTM possono alterare l'attività delle proteine ​​di legame della cap in condizioni di ossigeno fisiologicamente rilevanti. Questa tecnica seguita da analisi di spettrometria di massa potrebbe rivelare PTM ossigeno-regolata e fisiologicamente rilevanti nuovi Tha mediare l'attività dei fattori di traduzione iniziazione.

Un metodo alternativo per la cattura con una m ⁷ GTP tappo analogico potrebbe essere quella di un tappo immunoprecipitare vincolante conosciuta proteine come eIF4E o eIF4G ed eseguire la spettrometria di massa per identificare le proteine associate. Un limite di questa strategia è che le proteine di legame della cap hanno spesso ruoli cellulari alternative come all'interno di stress granuli ⁴¹ o in traduzione cap-indipendenti ^1,4. Pertanto, utilizzando m ⁷ analoghi cap GTP è il migliore, il metodo più affidabile per isolare le proteine di legame della cap, in particolare nell'ambito delle indagini nuove proteine cap-associata. Una limitazione di utilizzare un tappo GTP analogico m ⁷ è che alcune proteine di legame della cap come il scavenger decapping enzima DcpS non solo interagire con il tappo GTP mRNA m ^7, ma richiedono anche la seconda base per la rilegatura ^42. Inoltre, gli enzimi decapping in generale, come ad esempio il complesso DCP1 / DCP2, possono Hydrolyze m ⁷ GTP e ridurre efficacemente la capacità della resina. Pertanto, alcune proteine ​​di legame della cap possono essere persi in questa analisi. Per ignorare questi avvertimenti, enzimaticamente resistenti analoghi cap mRNA possono essere utilizzati. Due analoghi cap non idrolizzabili, mononucleotide m ⁷ GpCH2pp o dinucleotide m ⁷ GpCH2ppA hanno dimostrato di catturare DcpS, DCP1, e DCP2 ^43. Questi analoghi cap mRNA non sono disponibili in commercio, ma devono essere sintetizzati chimicamente de novo. Un altro limite di questo protocollo è che solo cap-binding proteine ​​o proteine ​​che interagiscono con le proteine ​​di legame della cap tramite "bagarinaggio" da scattare. Mentre cap-dipendente inizio della traduzione è la principale forma di iniziazione, meccanismi di cap-indipendente sono particolarmente frequenti durante condizioni di stress cellulare ^1. Tuttavia, nel contesto di questa tecnica e tendenze emergenti nel campo della traduzione iniziazione ^6-8,24, individuando i fattori di stress-indotta romanzo che participate nell'iniziazione cap-dipendente è una promettente area di ricerca.

Un altro fattore da considerare in questo protocollo è l'ossigeno nei media. Coltura di cellule in un mezzo liquido fornisce una barriera tra le cellule e l'atmosfera. E 'stato dimostrato che i mezzi liquidi possono richiedere fino a 24 ore per equilibrare con la composizione gas atmosferico ^36. Pertanto, le cellule devono essere coltivate per 24 ore nella disponibilità di ossigeno desiderato prima di lisi, oppure i media possono essere pre-condizionati se sono necessarie incubazione più brevi. Precondizionamento consiste nel mantenere il supporto nella workstation ipossia per almeno 24 ore in un pallone di coltura sterile che permette lo scambio di gas. Qualsiasi soluzione ossigenata introdotta per le cellule all'interno della stazione di lavoro ipossia potrebbe rapidamente cambiare vie di segnalazione cellulare, come l'avvio di traduzione cap-dipendente che è in fase di esame in questo protocollo. A causa della sensibilità dei percorsi ossigeno-sensing in cellule, qualsiasi soluzione che saràinteragire con le cellule prima di lisi, come PBS e tripsina-EDTA deve anche essere pre-condizionati per almeno 24 ore. Lisi e lavaggio post-lisi buffer devono essere utilizzati freddo e sono quindi non pre-condizionati nella workstation ipossia 37 ° C. Mentre alcune modifiche di ossigeno-dipendente alle proteine ​​potrebbero essere attivo post-lisi, i tamponi freddi sono tenuti a ridurre al minimo le attività enzimatiche e "rimescolamento" di proteina-proteina o proteina-RNA complessi che potrebbero portare a manufatti. Una modifica di questo protocollo per aumentare la severità può essere pre-condizioni di lisi e lavaggio post-lisi buffer per 24 ore e poi incubare in ghiaccio all'interno della stazione di lavoro prima dell'uso. Media e tamponi non devono essere tenuti in workstation ipossia per più di tre giorni perché queste soluzioni si concentreranno a causa dell'evaporazione dell'acqua. Per gli studi a lungo termine (> 3 giorni), l'importo iniziale di cellule seminate deve essere attentamente considerata. Come le cellule si dividono e la superficie del piatto diventa affollato,altri stress, come l'acidificazione media potrebbero influenzare l'attività delle proteine ​​di legame della cap. L'ultimo giorno dell'esperimento, le cellule dovrebbero avere una confluenza del 80-90%.

Ci sono quattro passaggi critici all'interno di questo protocollo: mantenendo le cellule nella stazione di lavoro ipossia fino lisi, la quantità di cellule utilizzate, lavare le perline, e il controllo non metilato GTP. 1) Ci sono diversi metodi per mantenere le cellule in ossigeno basso. La maggior parte di questi includono piccole camere che possono ospitare solo piatti di coltura cellulare, ma qualsiasi manipolazione o cella lisi devono essere eseguiti al di fuori delle camere presenti nell'aria ambiente. Componenti della macchina di ossigeno-sensing come i fattori ipossia inducibile sono attivati o inattivati nel giro di uno o due minuti e ^35. Pertanto, come accennato in precedenza, la lisi delle cellule in una stazione di lavoro ipossia è fondamentale per garantire l'attività delle proteine ​​di legame della cap è associata alla rispettiva disponibilità di ossigeno. 2) Il numero di cellesuggerito in questo protocollo (due piatti 150 mm) è sufficiente per forte m ⁷ GTP interattori quali la famiglia eIF4E o membri della eIF4F complesso (eIF4A e eIF4G). Più cellule, almeno cinque piatti di 150 mm, potrebbe essere richiesto di rilevare le proteine con interazioni transitori o che solo associato con la m ⁷ GTP mRNA tappo attraverso eIF4F. 3) Lavare le perline dopo di loro incubazione con il lisato cellulare possono essere eseguite in maniera rigorosa e meno rigoroso. Il protocollo qui presentata offre un'opzione stringente dove tampone di lisi è usato per lavare le perline cinque volte. Se le proteine ​​con interazioni deboli a Cap-binding proteins sono di interesse, si può effettuare un minor numero di lavaggi e utilizzare soluzione salina Tris tamponata al posto del tampone di lisi. 4) Anche se è importante pre-cancellare il lisato cellulare con coniugata agarosio per rimuovere le proteine ​​che interagiscono in modo non specifico con il tallone, alcune proteine ​​di legame della cap non possono distinguere tra la vera struttura tappo mRNA, GTP metilato (m⁷ GTP), e GTP non metilato. Una di queste proteine è il eIF4E omologo eIF4E3 ^44. Eluizione le perline con GTP sarà rimuovere qualsiasi proteina che riconosce anche GTP non metilato, che possa essere di interesse. La rilevanza biologica di proteine che riconoscono entrambi m ⁷ GTP e GTP deve essere ancora completamente chiariti. Questo è sottolineata dalle poche pubblicazioni che coinvolgono eIF4E3 (che è una bona fide proteina cap-vincolante con un cap-dominio di legame conservato) rispetto alle proteine eIF4E e eIF4E2, che fanno riconoscere m ⁷ GTP da GTP non metilato.

Questa tecnica, come presentato, può essere eseguito come un approccio mirato per identificare m ⁷ interattori GTP di interesse o come approccio ampio analizzando l'eluato GTP m ⁷ tramite spettrometria di massa. Diverse altre tecniche possono seguire l'esposizione physioxic (protocollo 4) per analizzare l'attività cap-binding, come frazionamento subcellulare, immunofluorescenza, co-immunoprecipitazione, unND analisi polysome. il controllo traslazionale sta emergendo come un contributore uguale espressione genica come trascrizione. Utilizzando questa tecnica per indagare l'attività e la composizione dei complessi cap-binding farà luce su come inizio della traduzione cap-dipendente è regolata in risposta a basso ossigeno.

The authors declare that they have no competing financial interests.

This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada and the Ontario Ministry of Research and Innovation.