Analyse von Cap-bindende Proteine ​​in menschlichen Zellen zu Physiologische Sauerstoffbedingungen ausgesetzt

Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5' cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m⁷GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex is by far the most common pathway to initiate protein synthesis in eukaryotic cells, but stress-specific variations of this complex are now emerging. Purifying cap-binding proteins with an affinity resin composed of Agarose-linked m⁷GTP (a 5' mRNA cap analog) is a useful tool to identify factors involved in the regulation of translation initiation. Hypoxia (low oxygen) is a cellular stress encountered during fetal development and tumor progression, and is highly dependent on translation regulation. Furthermore, it was recently reported that human adult organs have a lower oxygen content (physioxia 1-9% oxygen) that is closer to hypoxia than the ambient air where cells are routinely cultured. With the ongoing characterization of a hypoxic eIF4F complex (eIF4F^H), there is increasing interest in understanding oxygen-dependent translation initiation through the 5' mRNA cap. We have recently developed a human cell culture method to analyze cap-binding proteins that are regulated by oxygen availability. This protocol emphasizes that cell culture and lysis be performed in a hypoxia workstation to eliminate exposure to oxygen. Cells must be incubated for at least 24 hr for the liquid media to equilibrate with the atmosphere within the workstation. To avoid this limitation, pre-conditioned media (de-oxygenated) can be added to cells if shorter time points are required. Certain cap-binding proteins require interactions with a second base or can hydrolyze the m⁷GTP, therefore some cap interactors may be missed in the purification process. Agarose-linked to enzymatically resistant cap analogs may be substituted in this protocol. This method allows the user to identify novel oxygen-regulated translation factors involved in cap-dependent translation.

Translational Steuerung zeichnet sich als ein ebenso wichtiger Schritt , um die Transkriptionsregulation in der Genexpression, insbesondere in Zeiten der zellulären Stress ^1. Ein Schwerpunkt der Translationskontrolle ist bei der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Einleitung , wo die ersten Schritte der Proteinsynthese , die Bindung des eukaryotische Initiationsfaktor 4E (eIF4E) an die 7-Methylguanosin (m ⁷ GTP) 5' - Cap von mRNAs beinhalten ² . eIF4E ist Teil eines trimeren Komplex namens eIF4F die eIF4A, eine RNA - Helikase und eIF4G, ein Gerüstprotein , die für die Rekrutierung anderer Übersetzungsfaktoren und die 40S - Ribosoms ³ umfasst. Unter normalen physiologischen Bedingungen, die überwiegende Mehrheit der mRNAs über einen CAP-abhängigen Mechanismus übersetzt, aber unter Perioden der zellulären Stress etwa 10% der humanen mRNAs enthalten 5 'UTR , die cap-unabhängige Translation Initiation ^1,4 ermöglichen kann. Cap-abhängige Translation ist historisch Synonymous mit eIF4F jedoch stressspezifische Varianten von eIF4F haben ein Trend - Thema geworden ^5-8.

Verschiedene Zellspannungen verursachen eIF4E Aktivität über die Säugetier-Ziel von Rapamycin-Komplex 1 (mTORC1) verdrängt werden. Diese Kinase wird unter Stress beeinträchtigt, die eines seiner Ziele in der erhöhten Aktivität führt, die 4E-Bindungsprotein (4E-BP). Nicht-phosphoryliert 4E-BP bindet an eIF4E und blockiert ihre Fähigkeit , mit eIF4G wodurch die Unterdrückung von Cap-abhängige Translation ^9,10 zu interagieren. Interessanterweise hat ein Homolog von eIF4E namens eIF4E2 (oder 4EHP) eine viel geringere Affinität für 4E-BP ^11, vielleicht so dass es Stress-vermittelten Repression zu entziehen. Tatsächlich zunächst als Repressor der Übersetzung charakterisiert aufgrund seiner mangelnden Wechselwirkung mit eIF4G ¹² initiiert eIF4E2 Übersetzung von Hunderten von mRNAs , die RNA Hypoxie - Response - Elemente in ihren 3' - UTR ^6,13 während des hypoxischen Stress enthalten. Diese Aktivierung is durch Wechselwirkungen mit eIF4G3 erzielte RNA - Bindungsprotein - Motiv 4 und der Hypoxie - induzierbaren Faktor (HIF) 2α einen hypoxischen eIF4F Komplex oder eIF4F ^{H 6,13} zu bilden. Als Repressor unter normalen Bedingungen bindet eIF4E2 mit GIGYF2 und ZNF598 ^14. Diese Komplexe wurden, teilweise identifiziert durch Agarose-linked m ⁷ GTP Affinitätsharze. Diese klassische Methode ¹⁵ ist im Bereich der Übersetzungsnorm und ist die beste und am häufigsten verwendete Technik cap-Bindungskomplexe in Zug zu isolieren , nach unten und in - vitro - Bindungsassays ^16-19. Da der cap-abhängigen Translationsmaschinerie als flexibel und anpassungsfähig mit inter ändernden Teilen Schwellen ^6-8,13 Dieses Verfahren ist ein leistungsfähiges Werkzeug , um schnell neue cap-Bindungsproteine in der Stressantwort beteiligt identifizieren. Weiterhin ist in Variationen eIF4F könnte weitreichende Auswirkungen haben, da mehrere eukaryotische Modellsysteme scheinen eine eIF4E2 Homolog für Stressreaktionen zu verwenden, wiewie A. thaliana ^20, S. Pombe ^21, D. melanogaster ²² und C. elegans ^23.

Hinweise darauf , dass Variationen in eIF4F nicht streng auf Stressbedingungen beschränkt, sondern in der normalen Physiologie ²⁴ einbezogen werden. Die Sauerstoffversorgung der Gewebe (in Kapillarenden) oder innerhalb von Geweben (via Mikroelektroden gemessen wird ) variiert von 2-6% im Gehirn ^25, 3-12% der Lunge ^26, 3,5-6% im Darm ^27, 4% in die Leber ^28, 7-12% in der Niere ^29, 4% in Muskel ³⁰ und 6-7% in dem Knochenmark ^31. Zellen und Mitochondrien enthalten weniger als 1,3% Sauerstoff ^32. Diese Werte sind sehr viel näher an Hypoxie als die Umgebungsluft, wo Zellen routinemßig kultiviert. Dies legt nahe, dass das, was vorher waren gedacht als Hypoxie-spezifische zelluläre Prozesse in einer physiologischen Umgebung von Bedeutung sein können. Interessanterweise eIF4F und eIF4F ^H aktiv an der Translationsinitiations verschiedener Pools oder Klassen von mRNAs in verschiedenen menschlichen Zelllinien teilnehmen zu physiologischen Sauerstoff ausgesetzt oder "physioxia" ^24. Niedrige Sauerstoff treibt auch die richtige Entwicklung des Fötus ³³ und Zellen haben in der Regel höhere Proliferationsraten, längere Lebensdauer, weniger DNA - Schäden und weniger allgemeine Stressreaktionen in physioxia ^34. Daher ist eIF4F ^H wahrscheinlich ein wichtiger Faktor bei der Expression von ausgewählten Genen unter physiologischen Bedingungen.

Hier bieten wir ein Protokoll zur Kultivierung von Zellen in festen physiologischen Sauerstoffbedingungen oder in einem dynamischen Schwankungsbereich, die wahrscheinlich mehr repräsentativ für Gewebe-Mikroumgebungen ist. Ein Vorteil dieses Verfahrens ist, dass Zellen innerhalb der Hypoxie Workstation lysiert werden. Es ist oft nicht klar, wie der Übergang von hypoxische Zellkultur zu Zellaufschluß wird in anderen Protokollen durchgeführt. Zellen werden oft zunächst von einem kleinen Hypoxie Inkubator entfernt werdenVordergrund - Lyse, aber diese Exposition gegenüber Sauerstoff konnte biochemische Wege beeinflussen , wie die zelluläre Reaktion auf Sauerstoff schnell ist (ein oder zwei Minuten) ^35. Bestimmte cap-bindende Proteine erfordern Wechselwirkungen mit einer zweiten Base oder die m ⁷ GTP hydrolysieren daher einige Kappe Interaktoren können in dem Reinigungsverfahren fehlen. Agarose-gebundenen enzymatisch sicheren Verschluss-Analoga können in diesem Protokoll ersetzt werden. Erforschung der Aktivität und Zusammensetzung der eIF4F ^H und andere Variationen von eIF4F durch das hier beschriebene Verfahren wird Licht auf die komplizierten Genexpression Maschinerien , die Zellen während der physiologischen Bedingungen oder Stressreaktionen zu nutzen.

1. Vorbereitungen für die Zellkultur

1. Erwerben Sie kommerziell verfügbaren Bestände von menschlichen Zellen.
   Hinweis: Dieses Protokoll nutzt HCT116 kolorektalem Karzinom und primären humanen renalen proximalen Tubulusepithelzellen (HRPTEC).
2. Make 500 ml Medium für die Kultur von HCT116: Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) / Hochglucosemedium, supplementiert mit 7,5% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin (P / S).
3. Machen Sie 500 ml Medium für die Kultur von HRPTEC: Epithelial Zellmedium mit 5% FBS, 1% Epithelzellwachstum Ergänzung und 1% P / S.
4. Bereiten 500 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS): 140 mM NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 15 mM KH ₂ PO _4. PH-Wert auf 7,4 und Sterilisieren durch Autoklavieren für 40 min bei 121 ° C.

2. Einleitung der Zellkultur

1. aspirieren vorsichtig das Medium von einem 80-90% konfluent Gericht ohne t störener Zellen.
2. Aliquotieren 3-5 ml 1x PBS pro Kulturschale, schaukeln sanft jeden Kolben zur Beschichtung der Oberfläche der Schale, und sorgfältig die 1x PBS absaugen. Wiederholen Sie dies für eine zweite 1x PBS zu waschen.
3. Aliquot 3 ml von 0,05% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in jede Kulturschale und sanft die Zellen mit Trypsin-EDTA gleichmäßig zu beschichten schaukeln. Inkubieren bei 37 ° C für 2-3 min.
4. Übertragen Sie die abgelösten Zellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 4000 × g für 90 Sekunden.
5. Resuspendieren Zellpellet in 1 ml vollständigem DMEM.
6. Zählen von Zellen mit einem Hämozytometer. Berechnen Sie, wie viele nicht-pyrogene und Polystyrol 100 mm - Schalen Zellkultur erforderlich , um eine anfängliche Aussaatdichte von etwa 2.500-5.000 Zellen pro cm ² zu erreichen.
7. Vorwärmen komplette Zellkulturmedium für 30-45 min in Schritten 1.2 oder 1.3 in einem 37 ° C Wasserbad gestellt.
8. Dekontaminieren Mediumflasche und Zell Fläschchen mit 70% Ethanol. Von diesem Zeitpunkt an alleOperationen sollten aseptisch durchgeführt werden.
9. Aliquot 6 ml komplettem DMEM in so viele 100 mm Zellkulturschalen erforderlich, um das gesamte Volumen des gefrorenen Zellen im Aussaatdichte in Schritt 2.6 erwähnt zu verwenden.
10. Übertragen, um das Volumen der Zellsuspension berechnet in Schritt 2.6 zu jeder der 100 mm-Kulturschalen. Schaukeln Sie jede Platte manuell gleichmäßig die Zellen über die Oberfläche der Platte verteilen.
11. Platzieren Sie die seeded 100 mm Zellkulturschale in den Inkubator bei 37 ° C in einer 5% CO ₂ -Atmosphäre. Lassen Zellen mindestens 24 Stunden vor den nächsten Schritten zu brüten.

3. Subkultivierung

1. Informieren jeder Zellkulturschale unter einem Mikroskop den Prozentsatz der Zellen Konfluenz (% Zellen mit der Fläche der Schale) zu bestimmen. Zurück Zellen in den Inkubator und vorwärmen komplettes Medium und 1x PBS. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt, wenn die Zellen 80-100% konfluent sind.
2. aspirieren vorsichtig das verbrauchte Medium ohne die störendeZellen in jeder Kulturschale.
3. Aliquotieren 3-5 ml 1x PBS pro Kulturschale, schaukeln sanft jeden Kolben zur Beschichtung der Oberfläche der Schale, und sorgfältig die 1x PBS absaugen. Wiederholen Sie dies für eine zweite 1x PBS zu waschen.
4. Aliquot 3 ml 0,05% Trypsin-EDTA in jede Kulturschale und sanft schaukeln die Zellen gleichmäßig zu beschichten mit Trypsin-EDTA. Inkubieren bei 37 ° C für 2-3 min.
5. Während dieser Inkubation aliquote 10 ml vollständigem Medium in so viele Kulturschalen erforderlich sind , um Zelldichte von 2.500-5.000 Zellen pro cm ² erhalten.
6. Wenn die Zellen von der Platte abgelöst, fügen Sie schnell 3 ml 1x definiert Trypsininhibitor und sanft die Schale für 1 min schwenken, um sicherzustellen, dass alle von der Trypsin-EDTA neutralisiert wurde.
7. Übertragen Sie die abgelösten Zellen in ein steriles 15 ml Zentrifugenröhrchen und beiseite stellen. 3 ml 1x PBS in die Schale jegliche verbleibenden Zellen zu sammeln und zu übertragen, die zum gleichen 15 ml Zentrifugenröhrchen.
8. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren 150 xg5 min.
9. Aspirieren den Überstand und Zellpellet in 3 ml vollständigem Medium.
10. Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und Samen 150 mm Kulturschalen mit 15 ml vollständigem Medium eine Zelldichte von 2.500-5.000 Zellen pro cm ² zu erhalten. Verwenden Sie zwei 150 mm für jede Kappe Bindungsassay.
    HINWEIS: Sauerstoffdiffusion zu den Zellen durch flüssige Medien ist abhängig von dem Volumen ^36. Es wird empfohlen, das Volumen der Medien konsistent zwischen den Experimenten zu halten, ob anhaftenden Zellen oder Zellen in Suspension verwendet werden. Medien werden kann vorbehandelt (inkubiert in der Workstation für 24 Stunden wie in Diskussion besprochen), um diese Variabilitäten in Diffusion zu vermeiden.
11. Legen Sie die geimpfte Kulturschalen im Inkubator bei 37 ° C in einer 5% CO ₂ -Atmosphäre. Lassen Zellen mindestens 24 Stunden inkubiert, bevor zu den nächsten Schritten fortfahren.

4. Physioxic Exposure

1. Sehen Sie sich die Zellen unter dem Mikroskop. BESt Ergebnisse, stellen Sie sicher, dass die Zellen sind 70-80% konfluent für eine 24-Stunden-Exposition, 50-60% konfluent für eine 48 Stunden Belichtung und 40 bis 50% konfluent für eine 72 Stunden Exposition.
2. Platzieren Sie die Zellen in eine Hypoxie-Workstation für die gewünschte Zeit (24, 48 oder 72 Stunden je nach Experiment).
3. Stellen Sie die Workstation an den entsprechenden physioxia.
   HINWEIS: Zum Beispiel eine 3% O ₂ Einstellung von 5% CO ₂ und 92% N ₂ begleitet würden.
   HINWEIS: Wenn die Sauerstoffschwankungen innerhalb eines dynamischen Bereichs sind eine bestimmte Zeitleiste, programmieren Sie den Zeitplan in das Gerät gewünscht über oder manuell die Sauerstoff-Einstellungen in den gewünschten Intervallen einzustellen.
4. Stellen Sie die Luftfeuchtigkeit auf 60%. Die Workstation Atmosphäre ist sehr trocken dennoch und Medien wird deutlich bei langen Experimenten (> 48 h) zu verdampfen. Halten Sie eine Medien Reserve in einer Zellkulturflasche in der Workstation (so, dass die Medien mit der Workstation Atmosphäre ins Gleichgewicht gebracht wird), um die Medien in der Zellkultur dis aufzufüllener ist.
   HINWEIS: Jede Lösung , die mit den Zellen vor der Lyse (wie PBS und Trypsin-EDTA) sollte vorab konditioniert für 24 h vor der Verwendung innerhalb der Hypoxie Workstation so daß der gelöste Sauerstoff mit dem Luftsauerstoff zu interagieren ³⁶ äquilibriert.
5. Halten Zellen innerhalb der Arbeitsstation, bis die Lyse.

5. Vorbereitung Puffer für Cap-Bindungsassay

1. Bereiten 1x Tris-gepufferter Salzlösung (TBS).
   1. In 800 ml dH ₂ O lösen sich 8,76 g NaCl und 6,05 g Tris - Base.
   2. Man bringt die Lösung auf einen endgültigen pH von 7,4 unter Verwendung von 1 M HCl.
   3. Bringen Sie das endgültige Volumen auf 1 l mit dH ₂ O.
2. Bereiten Sie nicht denaturierende Lyse-Puffer. Bereiten Sie die Lyse-Puffer, den Tag des cap-Bindungstest. Machen Sie zusätzliche Lysepuffer die leeren Agarosekügelchen und die γ-aminophenyl-m ⁷ GTP Agarose - C10-verknüpften Kügelchen (Schritte 7.9 und 7.13) zu waschen.
   1. In 7 ml dH ₂ O, fügen Sie 160 ul 5 M NaCll, 160 & mgr; l 1 M Tris-HCl pH 7,4, 40 ul 200 mM NaF, 40 & mgr; l 1 M MgCl ₂ und 40 & mgr; l 1 mM Natriumorthovanadat.
   2. In 40 ul Igepal auf die 7 ml Lösung. Schneiden Sie die Spitze der Pipette abrufen zu helfen Igepal, da es extrem zähflüssig ist.
   3. Mischen durch Pipettieren von oben und unten, oder Wirbel, die 7 ml Lösung, bis alle der Igepal aufgelöst wurde.
   4. Heben Sie das endgültige Volumen der Lösung auf 8 ml und auf Eis halten.
3. Bereiten Sie 4x Natriumdodecylsulfat (SDS) -PAGE Probenpuffer.
   1. In einem Becherglas kombinieren 16 ml 1 M Tris-HCl pH 6,8, 12,64 ml Glycerin und 8 ml Dithiothreitol (DTT).
   2. In 3,2 g SDS und 0,16 g Bromphenolblau. Lassen Pulver zu lösen vollständig mit einem magnetischen Rührstab durch Mischen.
   3. Aliquote in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bei -20 ° C.

6. Zellyse

1. Bereiten Sie nicht denaturierende Lyse-Puffer und auf Eis halten den Tag der the cap-Bindungstest.
2. Vorwärmen 1x PBS und Trypsin in einem 37 ° C Wasserbad für 30 min.
3. Aliquot 980 ul Lysepuffer in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für jede cap-Bindungsassay durchgeführt wird.
4. Zugabe von 10 & mgr; l von 4- (2-aminoethyl) benzolsulfonyl Fluorid-Hydrochlorid und 10 & mgr; l 100x-Protease-Inhibitor-Cocktail zu den 980 & mgr; l Lysepuffer. Halten Sie sich auf dem Eis.
5. Entsorgen Sie die Medien von jedem 150-mm-Schale in einem Abfallbehälter in der Hypoxie-Workstation.
6. Waschen Sie die Zellen mit 3-4 ml warmem 1x PBS und entsorgen Sie die gesamte Flüssigkeit.
7. 1 ml warmes 0,05% Trypsin-EDTA zu jeder Schale und ließ für 2 min sitzen oder bis die Zellen nicht mehr an der Platte haftete.
8. Mit einer Pipette übertragen die Zellen einer Platte zu einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen, wie erforderlich, so daß jede Platte der Zellen auf einem separaten 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen überführt wird.
9. Zentrifugieren Sie die 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen bei 6000 × g für 90 s to die Zellen pelletieren.
10. Saugen Sie das Trypsin mit Hilfe einer Pipette ohne das Pellet zu stören. Wenn das Pellet gestört ist, wieder Zentrifuge die 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen bei 6000 × g für 90 Sekunden.
11. Waschen Sie die Zellen mit warmem 1x PBS durch sanftes Pipettieren von 200 ul PBS in das Röhrchen gerade oberhalb des Pellets. Re-Zentrifuge, wenn das Pellet wird gestört.
12. Saugen Sie das PBS, ohne das Pellet zu stören.
13. Pipette 500 & mgr; l aus den 1 ml hergestellt Lyse-Pufferlösung auf die erste Zellpellet. Das Pellet vollständig durch Auf- und Abpipettieren.
14. Kombinieren Sie die resuspendierten Zellen mit dem zweiten Zellpellet und resuspendieren das zweite Pellet durch Auf- und Abpipettieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Pellets wurden für jede Probe kombiniert und erneut suspendiert.
15. Kombinieren des Lysats mit den verbleibenden 500 ul Lysepuffer in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
16. Entfernen Proben aus der Hypoxie-Workstation.
    HINWEIS: Nach dem Lysepuffer Zugabe einll nachfolgenden Schritte sind in der Umgebungsluft durchgeführt werden, da der Hypoxie-Workstation auf 37 ° C eingestellt ist und die folgenden Schritte ausgeführt werden kalt (4 ° C oder auf Eis) werden.
17. Lyse der Zellen unter Verwendung von leichtem Rühren durch Drehen der Proben bei 4 ° C für 1,5-2 Stunden.
18. Zentrifugation der lysierten Zellen bei 12.000 xg für 15 min bei 4 ° C um Zelltrümmer zu entfernen.
19. Übertragen Sie das Lysat in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und verwerfen das Pellet.
20. Reservieren ein Teil (5-10%) des Überstands als Ganzes Zelllysat Eingangssteuerung für zukünftige Western-Blot-Analyse verwendet werden.

7. Cap-Bindungsassay

1. Für jede Probe werden 50 & mgr; l des Zuschnitts Agarosekügelchen Steuer Slurry und 50 ul der γ-aminophenyl-m ⁷ GTP Agarose - C10-linked Kügelchenaufschlämmung 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zu trennen. Mit einer Schere die Spitze der Pipette zu entfernen Sammlung des Wulstes Aufschlämmung zu erleichtern.
2. Pellet die Perlen by Zentrifugieren der Aufschlämmung bei 500 xg für 30 sec.
3. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und resuspendieren die Perlen in 500 ul TBS.
4. Wiederholen Sie die Schritte 7.2 und 7.3. Pellet die Kügelchen bei 500 g für 30 Sekunden und entfernen Sie den Überstand.
5. Den Überstand des Lysats aus Schritt 6,19 bis 1,5 ml Mikroröhrchen, das die leeren Agarosekügelchen enthält.
   HINWEIS: Die leeren Agarosekügelchen wirken als pre-Löschschritt Proteine ​​aus dem Lysat zu entfernen, die nicht spezifisch mit der Wulst zusammenwirken.
6. Inkubieren für 10 min bei 4 ° C unter leichtem Schütteln.
7. Pellet die leere Agarosekügelchen von bei 500 × g für 30 Sekunden zentrifugiert.
8. Übertragen Sie das Lysat auf die 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen , die γ-aminophenyl-m ⁷ GTP Agarose - C10-verknüpften Kügelchen enthält.
9. Waschen Sie die leere Agarosekügelchen durch Resuspendieren der Kügelchen in 500 ul Lysepuffer, die Perlen der Pelletierung von 30 s bei 500 · g zentrifugiert, und Verwerfen des supernatant. Wiederholen Sie diese vier Mal für insgesamt fünf Wäschen.
10. Resuspendieren der leeren Agarosekügelchen in 1x SDS-PAGE-Probenpuffer, und kochen Sie die Perlen für 90 Sekunden bei 95 ° C. Bei -20 ° C für zukünftige Western-Blot-Analyse zu beobachten, ob das Protein von Interesse bindet unspezifisch an dem Wulst.
11. Inkubieren des Lysats mit den γ-aminophenyl-m ⁷ GTP Agarose - C10-verknüpften Kügelchen unter leichtem Schütteln für 1 h bei 4 ° C cap-Bindungsproteine zu erfassen.
12. Pellet die γ-aminophenyl-m ⁷ GTP Agarose - C10-gebundene Kügelchen durch bei 500 × g für 30 Sekunden zentrifugiert. Überstand verwerfen.
13. Waschen Sie die γ-aminophenyl-m ⁷ GTP Agarose - C10-verknüpften Kügelchen Schritt 7.9 wiederholen.
14. Resuspendieren der Kügelchen in 600 & mgr; l Lysepuffer.
15. Hinzufügen GTP zu einer Endkonzentration von 1 mM.
16. Inkubieren der γ-aminophenyl-m ⁷ GTP Agarose - C10-verknüpften Kügelchen + 1 mM GTP unter leichtem Schütteln für 1 h bei 4 ° C. Anmerkung: Diesedistanziere werden Proteine , die nicht spezifisch mit m ⁷ GTP interagieren (dh interagieren auch mit nicht-methylierte GTP).
17. Pellet die γ-aminophenyl-m ⁷ GTP Agarose - C10-gebundene Kügelchen durch bei 500 × g für 30 Sekunden zentrifugiert.
18. Den Überstand in ein neues 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen eingewogen und 200 & mgr; l 4x SDS-PAGE-Probenpuffer (50 mM Tris-HCl, 100 mM DTT, 2% SDS, 0,1% Bromphenolblau und 10% Glycerin). Bewahren Sie die GTP Kontrollprobe bei -20 ° C für eine spätere Western - Blot - Analyse ^37. Waschen Sie die Perlen um 7,9 Schritt zu wiederholen.
19. Resuspendieren der Kügelchen in 1x SDS-PAGE-Probenpuffer (50 mM Tris-HCl, 100 mM DTT, 2% SDS, 0,1% Bromphenolblau und 10% Glycerin) und Kochen bei 95 ° C für 90 sec. Speichern die m ⁷ GTP-gebundenen Fraktion , die bei -20 ° C für zukünftige Western - Blot - Analyse ^37.

Analyse von Cap-Bindungsfähigkeit in Reaktion auf den Sauerstoff von eIF4E und eIF4E2 in einem m ⁷ GTP Affinitätssäule

Die 1 und 2 Western - Blots von typischen m ⁷ GTP Affinitätsreinigung von zwei Haupt cap-Bindungsproteine in Reaktion auf Sauerstoff- Schwankungen in zwei humanen Zelllinien repräsentieren: primäre humane renale proximalen tubulären Epithelzellen (HRPTEC) in F ild 1 und kolorektales Karzinom ( HCT116) in Abbildung 2. Zellen werden für 24 h bei der angegebenen Sauerstoffverfügbarkeit aufrechterhalten in dem flüssigen Medium, um sicherzustellen, daß der gelöste Sauerstoff mit der Luft innerhalb der Hypoxie Workstation äquilibriert wurde. Die Eingabespur (IN) entspricht 10% des gesamten Zell - Lysat vor der m ⁷ GTP-gebundenen Agarosekügelchen zugegeben cap-Bindungsproteine zu erfassen. Dieser Eingang Spur wird als Basis verwendet, die Anreicherung zu messeneines Zielproteins in der m ⁷ GTP Pulldown. Die GTP Spur wird das Eluat aus den m ⁷ GTP Perlen , die eluiere mit 1 mM GTP wurden. Dieser Schritt ermöglicht die Detektion von Proteinen, die auch nicht-methylierten GTP erkennen. Die Cap-bindende Proteine eIF4E und eIF4E2 m ⁷ GTP spezifisch erkennen, aber ihre Homolog eIF4E3 (hier nicht dargestellten) bindet auch an nicht-methylierte GTP. Die Fähigkeit von eIF4E und eIF4E2 die 5' - mRNA - Cap - Struktur (m ⁷ GTP) zu binden , kann durch Vergleich der Intensität der Banden in der m ⁷ GTP Spalte relativ zu der Intensität in der Eingabespur (insgesamt verfügbaren Pool) gemessen werden.

Diese Quantifizierung kann durch Messen der Pixelintensität der Proteinbanden für drei biologischen Replikaten mit einer Bildanalysesoftware, wie beispielsweise ImageJ durchgeführt werden. Ergebnisse sind als relative mittels Dichteeinheiten (RDU) ± Standardfehler des Mittelwerts ausgedrückt. Raw-Werte vor der Normalisierungsowohl aus experimentellen und Kontrollproben wurden im Vergleich mit ungepaarten zweiseitigen Student-t-Test. P <0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Diese repräsentative Experiment zeigt, dass die beiden Zelllinien unterschiedliche Bereiche von Sauerstoff für ihre eIF4E und eIF4E2 Nutzung haben. 1 zeigt , dass in HRPTEC nur eIF4E bindet stark an m ⁷ GTP mit 8% O ₂ (Figur 1A), daß sowohl eIF4E und eIF4E2 sind signifikant mit m ⁷ GTP 3 bis 5% O ₂ (1B - C) zugeordnet ist , und dass nur eIF4E2 bindet stark an m ⁷ GTP bei 1% O ₂ (Figur 1D). In 2 ist in HCT116 - Zellen, die sauerstoffabhängige Verwendung dieser cap-bindenden Proteine ist unterschiedlich: nur eIF4E bindet signifikant m ⁷ GTP auf 12% O ₂ (2A), wobei beide cap-Bindungsproteine erheblich m binden ⁷ GTP in den 5-8% O ₂ Bereich(2B - C) und nur eIF4E2 bindet signifikant m ⁷ GTP bei 3% O ₂ (2D). Das Fehlen der Elution von der Säule m ⁷ GTP mit GTP zeigt , dass eIF4E und eIF4E2 zu GTP m ⁷ spezifisch sind und nicht nicht-methylierten GTP erkennen. Die Balkendiagramme repräsentieren Quantifizierung von drei biologischen Replikaten mit ImageJ. Unsere Ergebnisse zeigen , dass zwei Haupt cap-Bindungsproteine, eIF4E und eIF4E2, in ihrer Fähigkeit unterscheiden , die mRNA m ⁷ GTP Cap - Struktur in einer sauerstoffabhängiger Weise zu binden.

Basierend auf früheren Literatur, dass diese beiden Proteine, die die Übersetzung von einzigartigen Klassen von mRNAs, diese Verschiebung in cap-Bindungsaktivität in unterschiedliche Proteome könnte erzeugt initiieren führen zu Veränderungen in der Sauerstoffverfügbarkeit anzupassen. Diese Technik kann verwendet werden, um neue Translationsinitiationsfaktoren zu charakterisieren, die mit der 5 'cap mRNA interagieren(oder mit cap-bindenden Proteinen) durch eine gezielte Western - Blot - Ansatz oder einem breiten Ansatz wie die Massenspektrometrie - Analyse eines m ⁷ GTP Eluat.

Abbildung 1: eIF4E und eIF4E2 Überschneidungen bei physioxia in HRPTEC 3-5% O _2. Capture Assays m ⁷ GTP beads in menschlichen Nieren proximaler Tubuli Epithelzelle (HRPTEC) Lysate (A) 8% unter Verwendung ausgesetzt ist , (B) 5%, (C) 3% oder (D) 1% O ₂ für 24 Std. GTP, GTP Wäsche zu messen Spezifität für m ⁷ GTP; m ⁷ GTP, gebundene Proteine zu m ⁷ GTP Perlen nach GTP zu waschen. Repräsentative Western-Blots gezeigt und Daten von wenigstens drei unabhängigen Experimenten wurden durch ImageJ quantifiziert und ausgedrückt als relative Dichteeinheiten (RDU) bezogen auf 10% Eingang (IN) des gesamten Zell-Lysats. * P <0,05 wurde (ungepaarten two-tailed Student-t-Test) eine wesentliche Änderung in Betracht gezogen , wenn die Anreicherung von eIF4E oder eIF4E2 in der Kappe gebundenen Fraktion (m ⁷ GTP) zum IN - Vergleich. Daten, Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM) von drei unabhängigen Experimenten. Diese Forschung wurde ursprünglich im Journal of Biological Chemistry veröffentlicht. Timpano, S. und Uniacke, J. Mensch kultivierten Zellen unter physiologischen Sauerstoff verwenden zwei cap-bindende Proteine ​​unterschiedliche mRNAs für die Translation zu rekrutieren. 2016; 291 (20): 10.772 bis 82 ^24. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. eIF4E und eIF4E2 Überschneidungen bei physioxia in HCT116 5-8% O _2. Capture - Assays unter Verwendung von m ⁷ GTP beads in HCT116 menschlichen Lysaten kolorektalem Karzinom ausgesetzt (A) 12%, (B) 8%, (C) 5% oder (D) 3% O ₂ für 24 Std. GTP, GTP Wäsche zu messen Spezifität für m ⁷ GTP; m ⁷ GTP, gebundene Proteine zu m ⁷ GTP Perlen nach GTP zu waschen. Repräsentative Western-Blots gezeigt und Daten von wenigstens drei unabhängigen Experimenten wurden durch ImageJ quantifiziert und ausgedrückt als relative Dichteeinheiten (RDU), bezogen auf 10% Eingang (IN) des gesamten Zell-Lysats. * P <0,05 wurde (ungepaarten two-tailed Student-t-Test) eine wesentliche Änderung in Betracht gezogen , wenn die Anreicherung von eIF4E oder eIF4E2 in der Kappe gebundenen Fraktion (m ⁷ GTP) zum IN - Vergleich. Daten, Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM) von drei unabhängigen Experimenten. Diese Forschung wurde ursprünglich im Journal of Biological Chemistry veröffentlicht. Timpano, S. und Uniacke, J. Menschliche Zellen unter physiologischen Sauerstoff kultiviert nutzen zwei cap-bindende Proteine ​​unterschiedliche mRNAs für die Translation zu rekrutieren. 2016; 291 (20): 10.772 bis 82 ^24. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die Analyse der Cap-bindenden Proteinen in menschlichen physiologischen Sauerstoffbedingungen ausgesetzt Zellen können für die Identifizierung von neuen Sauerstoff-regulierten Translationsinitiationsfaktoren ermöglichen. Die Affinität dieser Faktoren für die 5 'Cap der mRNA oder andere cap-assoziierte Proteine können durch die Stärke ihrer Verbindung zu m ⁷ GTP-gebundenen Agarosekügelchen gemessen werden. Eine Einschränkung dieser Technik ist, dass sie die cap-Bindungspotential von Proteinen nach der Lyse misst, aber es wird unter nicht-denaturierenden Bedingungen durchgeführt, die Protein-Protein-Wechselwirkungen und post-translationalen Modifikationen (PTMs) aufrechtzuerhalten. Mehrere Protein-Protein-Interaktionen vermitteln an die 5'-Kappe die Bindung des eIF4E Familie. Die 4E-BP bindet und reprimiert eIF4E durch seine Interaktion mit eIF4G blockiert und die Rekrutierung der 43S Präinitiationskomplex ³⁸ zu verhindern. Die eIF4E / 4E-BP-Komplex bleibt an das 5'-mRNA-Cap-gebunden, jede Einleitung von diesem Transkript blockiert und kannals Marker in m ⁷ GTP Affinitätssäulen für eIF4E Hemmung verwendet werden. Im Gegensatz dazu ist die Wechselwirkung von eIF4E mit eIF4G auf m ⁷ GTP Spalten könnte ein Marker für aktive Translationsinitiations sein. PTMs sind eine weitere Methode, um die Aktivität von Translationsinitiationsfaktoren zu regulieren. Zum Beispiel die Phosphorylierung von eIF4E durch Mnk1 kann seine Affinität erhöhen , um die 5' - mRNA ³⁹ begrenzen. Das Protein Modifikator durch die Gene Stimulated Interferon codiert 15 (ISG15) ist ein PTM, die die Cap-Bindungsaktivität von eIF4E2 als Reaktion auf Interferoninduktion durch Erreger der Infektion ⁴⁰ erhöht. Das ISG15-Gen enthält eine Hypoxie-Response-Element in seinem Promotor was darauf hindeutet, dass dieses System eIF4E2 bei niedrigen Sauerstoff regulieren könnte. Sehr wenig ist darüber bekannt, wie PTM bei physiologisch relevanten Sauerstoffbedingungen, die Aktivität von Cap-bindenden Proteinen verändern können. Diese Technik durch Massenspektrometrie-Analyse gefolgt könnte neuartige Sauerstoff geregelt offenbaren und physiologisch relevanten PTM thbei vermitteln die Aktivität von Translationsinitiationsfaktoren.

Ein alternatives Verfahren mit einem m ⁷ GTP Kappe analog zu erfassen wäre eine bekannte cap-bindendes Protein wie eIF4E oder eIF4G zu Immunpräzipitation und Massenspektrometrie zu identifizieren assoziierten Proteinen durchführen. Eine Einschränkung dieser Strategie ist , dass Cap-bindende Proteine oft alternative zelluläre Rollen haben wie in Stress - Granulat ⁴¹ oder in cap-unabhängige Translation ^1,4. Daher ist die beste m ⁷ GTP cap Analoga verwendet, zuverlässigste Methode cap-bindende Proteine zu isolieren, insbesondere wenn neue cap-assoziierten Proteinen zu untersuchen. Eine Einschränkung der Verwendung eines m ⁷ GTP Kappe analog ist , dass einige cap-bindende Proteine , wie beispielsweise der Abfänger Entkappung Enzym DcpS nicht nur mit der m ⁷ GTP mRNA cap interagieren, sondern auch die zweite Basis ⁴² erfordern für die Bindung. Weiterhin kann Entkappung Enzyme im allgemeinen, wie das DCP1 / DCP2 Komplex, hydrolyze GTP m ⁷ und effektiv Harzkapazität reduzieren. Daher können einige cap-bindende Proteine ​​in dieser Analyse verloren. Um diese Einschränkungen zu umgehen können, enzymatisch resistent mRNA-Cap-Analoga verwendet werden. Zwei nicht hydrolysierbare Kappe Analoga, Mononukleotid m ⁷ GpCH2pp oder Dinucleotid m ⁷ GpCH2ppA wurden zu erfassen DcpS, DCP1 gezeigt, und DCP2 ^43. Diese mRNA - Cap - Analoga sind im Handel nicht erhältlich, sondern müssen chemisch de novo synthetisiert werden. Eine weitere Einschränkung dieses Protokolls ist es, dass nur cap-bindenden Proteinen oder Proteinen in Wechselwirkung mit Cap-bindenden Proteinen über "Huckepack" wird erfasst werden. Während cap-abhängige Translationsinitiations die Hauptform der Initiation ist, cap-unabhängige Mechanismen sind besonders bei Bedingungen von Zellstress ¹ weit verbreitet. Doch im Zusammenhang mit dieser Technik und Trends im Bereich der Translationsinitiations ^6-8,24, Identifizierung neuer Stress-induzierten Faktoren , die participate in cap-abhängige Initiation ist ein vielversprechendes Forschungsgebiet.

Ein weiterer Faktor in diesem Protokoll zu prüfen ist, Sauerstoff in den Medien. Kultivieren von Zellen in einem flüssigen Medium, eine Barriere zwischen den Zellen und der Atmosphäre. Es hat sich gezeigt , dass flüssige Medien bis 24 Stunden in Anspruch nehmen kann mit der Zusammensetzung der Gasatmosphäre ³⁶ zu äquilibrieren. Daher müssen Zellen für 24 h in der gewünschten Sauerstoffverfügbarkeit vor der Lyse kultiviert werden, oder das Medium kann vorbehandelt wenn kürzere Inkubationszeiten erforderlich sind. Vorbehandlung beinhaltet die Medien in der Hypoxie-Workstation für mindestens 24 Stunden in einem sterilen Kulturkolben aufrechterhalten, die den Gasaustausch ermöglicht. Gegebenenfalls oxygenierte Lösung für die Zellen innerhalb der Hypoxie Workstation eingeführt könnte schnell zelluläre Signalwege ändern, wie der cap-abhängigen Translationsinitiation, die in diesem Protokoll untersucht wird. Aufgrund der Empfindlichkeit der Sauerstoff-Sensing Wege in Zellen, jede Lösung, die werdeninteragieren mit Zellen vor der Lyse wie PBS und Trypsin-EDTA muss auch für mindestens 24 Stunden vorbehandelt werden. Lysis und nach der Lyse Waschpuffer muss kalt verwendet werden und sind daher nicht in der 37 ° C Hypoxie Arbeitsplatz vorge konditioniert. Während einige sauerstoffabhängige Modifikationen an Proteinen aktiven post-Lyse sein könnte, werden die kalten Puffer erforderlich enzymatischen Aktivitäten zu minimieren und "shuffling" von Protein-Protein oder Protein-RNA-Komplexe, die zu Artefakten führen kann. Eine Änderung dieses Protokolls Stringenz zu erhöhen sein, um Vorbedingung Lyse und nach der Lyse Waschpuffer für 24 Stunden und dann innerhalb der Workstation vor der Verwendung auf Eis inkubiert. Medien und Puffer sollten nicht in der Hypoxie Arbeitsstation für mehr als drei Tage aufbewahrt werden, da diese Lösungen wird durch Wasserverdampfung zu konzentrieren. Für längere Zeitstudien (> 3 Tage), entkernt die anfängliche Menge an Zellen sorgfältig berücksichtigt werden müssen. Da Zellen sich teilen und die Oberfläche der Schale wird überfüllt,andere Belastungen wie Medien Ansäuerung könnte die Aktivität von Cap-bindenden Proteine ​​beeinflussen. Am letzten Tag des Experiments sollten die Zellen eine Konfluenz von 80-90% aufweisen.

Es gibt vier wichtige Schritte in diesem Protokoll: die Zellen in der Hypoxie-Workstation bis Lyse beibehalten wird, die Menge der Zellen verwendet, um die Perlen zu waschen, und die nicht methylierten GTP Kontrolle. 1) Es gibt verschiedene Methoden Zellen in geringen Sauerstoff aufrechtzuerhalten. Die meisten von ihnen gehören kleine Kammern, die nur Zellkulturschalen, aber jede Manipulation oder Zell-Lyse halten können, müssen außerhalb der Kammern in der Umgebungsluft durchgeführt werden. Komponenten der Sauerstoff-Fühl Maschinen wie den Hypoxie - induzierbaren Faktoren aktiviert oder in einer Angelegenheit von ein bis zwei Minuten ³⁵ inaktiviert. Daher ist, wie zuvor erwähnt, ist es, die Zellen in einer Hypoxie Workstation Lysieren kritisch, um die Aktivität der cap-Bindungsproteine, um sicherzustellen, ist mit dem jeweiligen Sauerstoffverfügbarkeit zugeordnet sind. 2) Die Anzahl der Zellenin diesem Protokoll vorgeschlagen (zwei 150 - mm - Schalen) ist ausreichend für starke m ⁷ GTP - Inter wie die eIF4E Familie oder Mitglieder des eIF4F - Komplex (eIF4A und eIF4G). Mehrere Zellen mindestens fünf 150 mm - Schalen könnten erforderlich werden , um Proteine mit transienten Interaktionen zu erfassen oder sich nur assoziieren mit dem m ⁷ GTP mRNA cap durch eIF4F. 3) Waschen der Kügelchen, nachdem sie mit dem Zelllysat Inkubation kann in einem strengen und weniger strenge Art und Weise durchgeführt werden. Das Protokoll hier vorgestellten bietet eine strenge Option, wo Lysepuffer verwendet wird, um die Kügelchen fünfmal zu waschen. Wenn Proteine ​​mit schwächeren Wechselwirkungen zu deckeln-bindende Proteine ​​von Interesse sind, kann man weniger Wäschen durchführen und Tris-gepufferte Salzlösung verwenden anstelle von Lysepuffer. 4) Es ist zwar wichtig, das Zell-Lysat mit unkonjugiertem Agarose zu Preclear Proteine ​​zu entfernen, die nicht spezifisch mit der Wulst zusammenwirken, einige cap-Bindungsproteine ​​können zwischen der wahren mRNA-Cap-Struktur, methylierte GTP (m nicht differenzieren⁷ GTP), und nicht-methylierten GTP. Ein solches Protein ist das Homolog eIF4E eIF4E3 ^44. die Perlen mit GTP Eluieren wird jedes Protein entfernen, die auch nicht-methylierte GTP erkennt, die von Interesse sein könnten. Die biologische Relevanz von Proteinen , die sowohl m ⁷ GTP erkennen und GTP ist noch nicht vollständig aufgeklärt werden. Dies wird durch die wenigen Publikationen hervorgehoben denen eIF4E3 (die eine bona fide cap-bindendes Protein mit einer konservierten cap-Bindungsdomäne) relativ zu den eIF4E und eIF4E2 Proteine, die aus nicht-methylierten GTP m ⁷ GTP erkennen tun.

Diese Technik, wie dargestellt wird , kann als ein zielgerichtetes Vorgehen durchgeführt werden , um m ⁷ GTP - Inter von Interesse oder als breiter Ansatz durch die Analyse der m ⁷ GTP Eluat über Massenspektrometrie identifizieren. Mehrere andere Techniken können physioxic Exposition (Protokoll 4) folgen cap-Bindungsaktivität wie subzellulärer Fraktionierung, Immunofluoreszenz, Coimmunpräzipitation, eine Analysend Polysoms Analyse. Translational Steuerung zeichnet sich als gleichberechtigter Beitrag zur Genexpression als Transkription. Schuppen Licht zu untersuchen, um die Aktivität und Zusammensetzung von Cap-Bindungskomplexe Verwendung dieser Technik, wie Cap-abhängige Translation Initiation in Reaktion auf die niedrigen Sauerstoff reguliert wird.

The authors declare that they have no competing financial interests.

This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada and the Ontario Ministry of Research and Innovation.