Un metodo semplice per Automated fase solida estrazione di campioni di acqua per l'analisi immunologiche di piccole inquinanti

A protocol for the extraction and pre-concentration of estradiol from water samples by using an automated and miniaturized system is presented.

Si propone un nuovo metodo per l'estrazione in fase solida (SPE) di campioni di acqua ambientale. Il prototipo sviluppato è conveniente e facile da usare, e consente di eseguire un rapido, automatizzato e semplice SPE. La soluzione pre-concentrata è compatibile con l'analisi mediante immunodosaggio, con un basso contenuto di solvente organico. Un metodo è descritto per l'estrazione e pre-concentrazione di ormone naturale 17β-estradiolo in 100 ml campioni di acqua. Fase inversa SPE viene eseguita con sorbente ottadecil-silice e eluizione avviene con 200 ml di metanolo al 50% v / v. Eluente viene diluito con l'aggiunta di acqua per abbassare la quantità di metanolo. Dopo aver preparato manualmente colonna SPE, la procedura generale viene eseguita automaticamente entro 1 ora. Al termine del processo, la concentrazione di estradiolo è misurato utilizzando un commerciale immuno-adsorbente assay enzimatico (ELISA). 100 volte pre-concentrazione si ottiene e il contenuto di metanolo in solo il 10% v / v. Recuperi completi della molecolavengono raggiunti con 1 ng / L spillo campioni deionizzata e sintetici acqua di mare.

La preparazione del campione è un passo importante in ogni processo di analisi. In particolare, la rimozione degli effetti matrice, diminuzione delle interferenze e arricchimento dell'analita sono necessari per ottenere risultati precisi e raggiungere limiti di rilevabilità. Sistema endocrino composti (IE) sono di particolare interesse per la loro azione su organismi viventi, anche quando presenti a livelli molto bassi per l'ambiente. L'ormone naturale 17β-estradiolo è presente sul inquinamento delle acque dell'UE selezione e soggetto ad essere aggiunto alla lista delle sostanze prioritarie disciplinati dalla direttiva quadro sulle acque europee. Estrazione in fase solida (SPE) è comunemente applicato per l'analisi di piccole inquinanti in acqua, sia chimica ^1-5 (cromatografia, spettrometria di massa) e immunologici ^6-9 metodi di rilevamento. Quest'ultimo ha guadagnato interesse nel campo del monitoraggio ambientale, come saggi immunologici sono disponibili in un'ampia varietà di formati, sono specifici per la taanalita rget, e raggiungere limiti di rilevabilità. ^{6, 7, 10, 11} Vari Enzyme Linked immunoassorbimento (ELISA) sono commercialmente disponibili e consentono di analizzare più campioni contemporaneamente su una piastra multi-pozzo. La procedura consiste in fasi successive di reazione che possono prendere un paio d'ore. Il prodotto finale di reazione può essere rilevato otticamente per determinare la concentrazione della molecola bersaglio sulla base di una curva di calibrazione.

Procedure SPE Classical includono sorbente pre-condizionamento, dell'estrazione del campione, lavaggio, eluizione e concentrazione per evaporazione dell'eluente. Il solvente utilizzato per la diluizione di questo estratto è scelto in funzione del metodo di rilevamento. Per i metodi immunologici, la quantità di solvente organico influenze fortemente la sensibilità del metodo. ¹²

Oltre al recupero e le prestazioni pre-concentrazione, il metodo deve anche essere semplice ed economicamente conveniente. Automazione dei SEGUIRE IL PROCEDIMENTOe aiuta a ridurre gli errori umani legati. Nel nostro lavoro precedente ¹³ abbiamo introdotto il nostro prototipo per SPE automatizzata, e il nostro metodo è stato applicato all'analisi della ormone naturale 17β-estradiolo in campioni di acqua di mare. Con la presente il video che vorremmo evidenziare i vantaggi tecnici del nostro metodo rispetto alle tradizionali off-line e on-line SPE, e la sua particolare compatibilità con rilevamento da immuno-reazioni. Descriviamo il protocollo applicato ai campioni di acqua per la rilevazione di 17β-estradiolo. SPE viene eseguita con octadecil-silice (C18) Fase sorbente e eluizione viene eseguita con metanolo diluito.

Nota: Il protocollo seguente descrive la SPE effettuato su 100 ml del campione d'acqua con C18 sorbente e eluizione con 50% v / v di metanolo. Il campione arricchito viene diluita a raggiungere il 10% v / v di metanolo prima analisi con un enzima linked immunosorbent assay (ELISA) Kit.

1. Preparazione dei reagenti

1. Preparare i campioni di acqua
   1. Prima di qualsiasi altro passo, filtrare ogni campione di 100 ml di acqua con filtri a 0,2 micron di dimensione dei pori.
   2. Additiva con concentrazione desiderata diluendo il volume appropriato di soluzione di riferimento in un volume di acqua. Ad esempio, preparare 100 ml di campione con 100 ng / L di E2 diluendo 3,3 ml di soluzione di riferimento E2 ad una concentrazione di 300 mg / L. Diluire questa soluzione dieci volte per ottenere un campione a spillo con 10 ng / L E2. Diluire quest'ultima altri dieci volte per ottenere un campione di 100 ml con 1 ng / L E2.
   3. Collocare il campione filtrato (non modificato o spillo) in una bottiglia di vetro con GFilo L45. Utilizzare l'esempio lo stesso giorno. Prendere una piccola frazione da analizzare con il test ELISA per stimare concentrazione iniziale.
2. Preparare 300 ml di eluente diluendo in metanolo (di-) acqua deionizzata al 50% v / v in un tubo stretto.

2. Preparazione della colonna SPE

1. Preparare a 20 mg / ml sospensione di particelle adsorbenti ottadecil-silice aggiungendo primi 1.600 ml di metanolo e poi 400 ml di acqua demineralizzata a 40 mg di sorbente in fase inversa. Strettamente chiudere il coperchio e agitare con un vortice.
2. Installazione della membrana inferiore della colonna
   1. Seleziona una membrana di nylon con dimensione dei pori 11 micron e metterlo su un doppio strato di tessuto anti-polvere. Con un diametro del punzone 3 mm, tagliare due piccole parti nella membrana.
   2. Afferrare una delle piccole membrane con TV a fascia pinza filtra e posizionarlo su un lato della colonna.
   3. Avvitare il connettore a fondo piatto con il tubo e stringere. La membrana è now nel luogo e l'assorbente può essere aggiunto in modo sicuro. Disegnare una freccia sul corpo della colonna di puntamento verso la fine dove è stata posta la membrana.
3. Preparazione della colonna assorbente imballato
   1. Fissare la colonna a supporto con la freccia rivolta verso il basso. La colonna deve essere impostato più verticale possibile.
   2. Attaccare un vuoto 10 ml siringa monouso all'estremità del tubo della colonna, utilizzando i connettori Luer-Lock.
   3. Preparare un micro-pipetta con una punta di 20-200 microlitri, impostare il volume di 100 l. Questo formato puntale viene adattata alle dimensioni della colonna sorbente essere preparati. La procedura sarebbe più difficile con punte per pipette più grandi, come quelli usati con 1 ml pipette.
   4. Agitare la sospensione sorbente con un vortice, e rapidamente pipettare 100 microlitri al centro della colonna. Mentre l'iniezione, aspirare delicatamente tutta la soluzione pipettato trogolo membrana utilizzando la siringa con l'altra mano. A questo stl'età, la soluzione di riempimento della siringa deve essere libera da particelle, e un letto particella può eventualmente essere osservata nella colonna.
   5. Ripetere questa operazione altre 2 volte agitando la sospensione di scorta tra tutti fasi di pipettamento per garantire la sospensione omogenea delle particelle nella soluzione. La colonna risultante contiene 6 mg di assorbente.
   6. Quando i 300 ml di sospensione sono stati caricati ed essiccato aspirando con la siringa, tenere la siringa in posizione e posizionare la seconda membrana di nylon sulla parte superiore usando le pinze con l'altra mano.
   7. Avvitare il secondo connettore con il tubo e smaltire la siringa. La colonna SPE è pronto all'uso.

3. Preparazione del sistema

1. Serrare colonna SPE il dispositivo utilizzando i connettori Luer-Lock. La freccia deve puntare nella stessa direzione come quella mostrata sul dispositivo.
2. Collegare la bottiglia contenente il campione al dispositivo avvitando ilprevisto tappo di sicurezza GL45 su di esso.
3. Carico 200 ml di eluente nel serbatoio 'Eluente'.
4. Carico 800 ml di di-acqua nel serbatoio 'diluizione'.
5. Posizionare una bottiglia all'uscita rifiuti per raccogliere l'acqua elaborati durante fase di estrazione. Il formato non è importante, ma il volume deve essere sufficientemente grande per quanto riguarda il volume del campione.
6. Mettere una piccola fiala all'uscita sensore con capacità minima volume di 1,5 ml. Un volume massimo di 1 ml sarà troppo piccolo come le bolle si formano in questo sbocco al momento del ritiro eluente arricchito e tampone di diluizione.
7. Verificare il regolatore di pressione è in posizione chiusa ruotando manualmente, reverse-orario fino ulteriore movimento non è possibile.

4. SPE con il Prototype

1. Accendere il prototipo premendo il pulsante sul retro.
2. Preparare l'interfaccia utente e selezionando il programma
   1. Aprire l'interfaccia utente. Selezionarela porta di comunicazione del computer a cui il dispositivo è collegato dalla lista, e fare clic sul pulsante 'Avanti'.
   2. Immettere i valori per 580 pset e 30 per dpset. La pompa regolerà per mantenere la pressione nel sistema di pressione e serbatoi a 580 ± 30 mbar durante l'esecuzione.
   3. Selezionare la modalità automatica.
   4. Nell'angolo modalità automatica, caricare il file di programma nel 'percorso del file di configurazione' scatola.
3. Regolazione del regolatore di pressione
   1. Avviare la pompa.
   2. Attivare manualmente il regolatore di pressione fino a quando il valore letto per preg è inferiore ma vicino a 320 mbar.
   3. Fermare la pompa.
4. Avvio della procedura di SPE
   1. Premere 'start' nell'angolo modalità automatica. La pompa si accenderà e le fasi di estrazione, eluizione e diluizione seguirà automaticamente l'un l'altro. L'intera procedura per un campione di 100 ml viene eseguita in 50 min.
   2. Verificare il valore di preg. Deve essere compreso nell'intervallo 320 - 350 mbar durante la fase di estrazione per garantire una portata ottimale.
   3. Chiudere la piccola fiala e conservare a 4-5 ° C al buio fino al momento dell'analisi. Effettuare analisi nella seguente 30 ore per impedire la degradazione dell'analita.
   4. Smaltire l'acqua trattata.
5. Pulizia del sistema
   Nota: Al termine di ogni procedura di estrazione del sistema deve essere pulito per evitare la contaminazione incrociata.
   1. Preparare una soluzione di 10 ml di metanolo 70% v / v in una bottiglia di vetro GL 45.
   2. Scollegare colonna SPE e collegare il tubo di connettori.
   3. In modalità automatica, selezionare il file 'pulizia' e avviarlo con impostazioni di pressione stessi.

5. Individuazione di Estradiolo Concentrazione con ELISA

1. Preparare i campioni di calibrazione con concentrazioni come indicato nel protocollo fornito con il kit ELISA utilizzato. Preparare uno calibrazione impostato con la stessa matrice del campione, e un set di calibrazione con metanolo 10% v / v.
2. Dispensare la quantità necessaria di campione nei pozzetti sulla piastra, secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare campioni di calibrazione, campioni di acqua non modificati e spillo che sono stati filtrati, ma non trattati con SPE, e arricchito i campioni in metanolo 10% v / v. Utilizzare 3 pozzetti per campione per ridurre l'errore associato con il test.
3. Seguire le indicazioni del protocollo fornito con il kit per l'aggiunta dei reagenti, tempo di incubazione, lavaggio e ulteriore reazione con l'enzima.
4. Leggere il segnale ottico in ogni pozzetto secondo le istruzioni del produttore corredo con uno strumento lettore di piastre e raccogliere i dati.
5. Utilizzare il software dello strumento lettore di piastre per adattarsi alle curve di calibrazione e determinare la concentrazione di E2 nel campione iniziale con stessa matrice, e nei campioni arricchiti con metanolo 10% v / v.

Riproducibilità dell'imballaggio sorbente è stata valutata con l'essiccazione e la ponderazione del sorbente pipettato in flaconcini di vetro ed il risultato è mostrato in Figura 1. Riproducibilità del tempo di iniezione è stato testato per 100 ml di campioni, come mostrato nella Figura 2. Concentrazione iniziale e pre concentrato spillo campioni sono stati determinati utilizzando un kit ELISA commerciale per 17β-estradiolo e sono mostrati in figura 3.

La procedura proposta comporta l'utente per la preparazione della fase sorbente (Figura 1). Le particelle assorbenti si svolgono tra due membrane per la stabilità meccanica e sono densamente dalla pressione applicata con la siringa mentre pipettando sospensione nella colonna. La colonna risultante contiene una quantità ottimale di 6 mg del sorbente scelto con errore solo il 6% da questo valore. Questo passo agisce anchecome assorbente condizionata, come la sospensione viene preparata in condizioni appropriate solvente.

Dopo la preparazione e l'installazione della colonna SPE sul sistema, e caricando le soluzioni nei serbatoi appropriati, il procedimento di pre-concentrazione è completamente automatizzato e richiede in totale meno di 1 ora per 100 ml di campione (Figura 2). L'estrazione viene eseguita in 40 ± 8 min. Solo due parametri sono ancora influenzati dall'utente, la preparazione del sorbente imballato e la regolazione della portata. Il primo sarebbe essere risolti mediante l'applicazione di metodi su larga scala per la colonna fabbricazione. Il secondo è legato alla regolazione manuale del regolatore di pressione, che determina il valore di pressione utilizzato per guidare le soluzioni attraverso il sistema. Questa fonte di errore verrebbe eliminato implementando un regolatore di pressione elettronico.

Per quanto riguarda le prestazioni, il prFattore e-concentrazione ottenuta è 100. In primo luogo, di 500 volte preconcentrazione avviene eluendo l'estratto del sorbente con il 50% v / v di metanolo. Poi una diluizione 5 volte viene eseguito aggiungendo acqua demineralizzata. Questa diluizione riduce il contenuto di solvente e preserva la sensibilità immunodosaggio. Osservando le curve di calibrazione del ELISA (Figura 3A), è evidente che il rapporto di metanolo nel campione arricchito non influenza la sensibilità del saggio immunologico. Un risultato rappresentativo di pre-concentrazione è illustrata in figura 3. Il metodo è stato applicato ai campioni di-acqua e acqua di mare artificiale addizionato di 1 ng / L di 17β-estradiolo. Mentre le concentrazioni di campione sono inferiori al limite di rivelazione, il metodo di pre-concentrazione porta con successo tali campioni nell'intervallo di dosaggio (30 - 30.000 ng / L). I recuperi sono stati ottenuti confrontando la concentrazione finale di concentrazione teorica spillo. Recuperi di 128% ± 22% e il 107% ±6% sono stati calcolati per di-acqua e acqua di mare artificiale rispettivamente (Figura 3B).

Figura 1. Illustrazione e riproducibilità del metodo per l'imballaggio sorbente. Ci sono tre fasi: fissaggio della prima membrana di nylon con il primo connettore, iniettando la sospensione assorbente, e chiusura colonna inserendo la seconda membrana e il connettore. La colonna risultante contiene 6 mg di assorbente con il 6% deviazione standard (n = 6 preparato e colonne ponderata). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Step-by-stepillustrazione della procedura con riproducibilità del tempo di iniezione del campione. Gli ingressi soluzione vengono caricati nei serbatoi o bottiglia. Le due uscite sono il campione trattato (rifiuti) e il campione arricchito, che è compatibile per l'analisi mediante immunodosaggio a basso contenuto di solvente. La procedura generale è automatizzato e richiede poco meno di 1 ora (n = 31 con deviazione standard). L'influenza degli utenti sulla portata è evidenziata con caratteri blu. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Risultati del pre-concentrazione di E2 e analisi mediante ELISA. (A) Le curve di calibrazione della ELISA e punti misurati per 1 ng / L spillo di-acqua (i) e acqua di mare artificiale (ii) dopo enrichment. (B) recuperi ottenuti per 1 ng / L spillo di-acqua (i) e acqua di mare artificiale (ii) campioni dopo arricchimento (n = 4). Le barre di errore sono deviazioni standard derivanti dal numero di repliche e le 3 pozzetti della piastra ELISA che sono stati utilizzati per determinare la concentrazione di ciascun campione. Questo dato è stato modificato da ^(13). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

È stato proposto un nuovo metodo per la preparazione dei campioni di acqua seguita da analisi mediante immunodosaggio. Lo strumento permette di eseguire l'estrazione in fase solida in modo automatizzato e facile da usare.

La filtrazione del campione di acqua prima della sua iniezione nel sistema è critica. Eventuali particelle ancora presenti nella soluzione potrebbe potenzialmente causare l'intasamento della rete fluidica e ostacolare colonna SPE. Un altro passo importante è la preparazione della colonna SPE. La quantità di particelle nella colonna è critica per ottenere le migliori prestazioni possibili. Particolare cura deve essere presa quando si prepara la sospensione di particelle assorbenti, per evitare l'agglomerazione delle particelle. Questo si ottiene aggiungendo prima frazione solvente al sorbente secco, e quindi la frazione di acqua. Poi, durante la fase di confezionamento, è importante mescolare bene la sospensione mentre aspirazione dei 100 microlitri con la pipetta. Alla fine del pro SPEprocedura, pulizia correttamente il sistema è critica. In primo luogo, esso impedisce la contaminazione incrociata quando si lavora con diversi campioni, e dall'altro evita il rischio di biocontaminazione dello strumento quando non è utilizzato.

Come accennato nell'introduzione, l'uso di metodi immuno-rilevazione per l'analisi di piccole molecole inquinanti nell'ambiente è in espansione. Tali metodi raggiungere limiti delle rilevazioni dei bassi livelli ng / L ^{7, 11} e hanno il vantaggio di essere molto preciso. Tali metodi sono utilizzati in combinazione con metodi chimici, per lo più tecniche relative-spettrometria di massa. ^{14, 15} Quest'ultimo non limitano l'uso di solventi organici e di beneficiare di sistemi automatizzati SPE che consentono di raggiungere i fattori pre-concentrazione elevate richieste. In confronto, gli immunodosaggi sono più sensibili alla composizione tampone e la mancanza adattati tecniche di preparazione del campione per facilitare il processo. Il nostro modulo è dedicato all'analisi di smolecole centro commerciale di immunodosaggio.

Con il nostro metodo automatizzato 100 volte arricchimento del campione viene ottenuto e permette di rilevare l'analita in un intervallo di concentrazione ELISA. Se quelle prestazioni pre-concentrazione sembrano bassi rispetto ai tradizionali SPE, corrispondono perfettamente ai requisiti per immuno-rilevamento. Inoltre, lo strumento ha un ingombro ridotto (25 cm x 15 cm x 10 cm) e basso costo rispetto alle tipiche configurazioni SPE manuali o automatici. ¹³ Se necessario, il throughput per l'analisi del campione multiplo può quindi essere aumentato utilizzando pochi dispositivi in parallelo. Un'altra possibilità sarebbe quella di progettare un metodo per piccoli volumi di campione e eluente, che ridurrebbe i tempi necessari per la procedura. Alcune altre limitazioni sono state discusse attraverso la descrizione dei risultati. Ci sono ancora due passaggi in cui è coinvolto l'utente, sia collegata al grado di sviluppo di questo prototipo e sarebbe risolto facendo un ulteriore passo avanti verso l'acdispositivo ommercial. L'imballaggio della fase sorbente viene effettuata manualmente. Il metodo è stato tuttavia dimostrato di essere semplice e riproducibile. Siamo sicuri che le colonne getta potrebbero essere prodotti se il sistema sono stati prodotti su una scala più alta.

In sintesi, abbiamo descritto un nuovo metodo per eseguire SPE su un dispositivo automatizzato compatto. Abbiamo dimostrato il potenziale per l'analisi di campioni di acqua mediante immunodosaggio mediante la descrizione di un metodo di estrazione e pre-concentrazione applicata al rilevamento di 17β-estradiolo da un kit ELISA commerciale. Il metodo è facile da usare e conveniente, e potrebbe in futuro essere applicata in linea con biosensori (lavori in corso). Ci aspettiamo che la nostra piattaforma consentirà di eseguire simili procedure di estrazione in fase solida su matrici complesse di campioni di grande rilevanza per il monitoraggio di EDC, come il cibo o nelle urine. Siamo convinti il ​​nostro sistema supporta l'applicazione di metodi immuno-rivelazione consolidati ed emergenti incampo dell'analisi ambientale.

The authors have nothing to disclose.

This work was funded by the European Union Seventh Framework Program FP7/2007-2013 under grant agreement no. 265721. The authors thank the RIKILT Institute for Food Safety (NL) for their support in this project.