طريقة بسيطة لالآلي المرحلة الصلبة استخراج عينات المياه للتحليل المناعية من الملوثات الصغيرة

A protocol for the extraction and pre-concentration of estradiol from water samples by using an automated and miniaturized system is presented.

ويقترح طريقة جديدة لاستخراج المرحلة الصلبة (SPE) من العينات البيئية للمياه. النموذج المتقدمة ودية فعالة من حيث التكلفة وسهلة، ويمكن أن تؤدي SPE السريع، والآلي وبسيط. الحل قبل المركز متوافق مع تحليلها من قبل المناعية، مع نسبة منخفضة من المذيبات العضوية. وصفت طريقة لاستخراج وقبل تركيز الهرمون الطبيعي 17β استراديول في 100 مل عينات المياه. يتم تنفيذ المرحلة العكسية SPE مع octadecyl السيليكا المواد الماصة ويتم شطف مع 200 ميكرولتر من الميثانول 50٪ ت / ت. غير المخفف شاطف بإضافة مياه دي لخفض كمية من الميثانول. بعد إعداد يدويا العمود SPE، يتم تنفيذ الإجراء الشامل تلقائيا في غضون 1 ساعة. في نهاية هذه العملية، يتم قياس تركيز الاستراديول باستخدام انزيم مرتبط التجاري المناعية بالأنزيم (ELISA). ويتحقق 100 أضعاف ما قبل التركيز ومحتوى الميثانول في 10٪ فقط ت / ت. المبالغ المستردة كامل للجزيءتتحقق مع 1 نانوغرام / L ارتفعت عينات مياه البحر غير المتأينة والاصطناعية.

إعداد نموذج يمثل خطوة مهمة في أي عملية التحليل. على وجه الخصوص، وإزالة آثار مصفوفة، انتقاص من تدخلات، وإثراء الحليلة ضرورية للحصول على نتائج دقيقة وتصل إلى حدود منخفضة من الكشف. الغدد الصماء المركبات (EDCs) تثير القلق بشكل خاص نظرا لعملها على الكائنات الحية حتى عندما الحالية في مستويات منخفضة جدا في البيئة. هرمون الطبيعي 17β استراديول موجود على تلوث المياه الاتحاد الأوروبي قائمة المراقبة وعرضة لتضاف إلى قائمة المواد ذات الأولوية تنظيمها بموجب الإطار التوجيهي للمياه الأوروبي. يتم تطبيق المرحلة الصلبة استخراج (SPE) عادة لتحليل الملوثات الصغيرة في الماء، مع كل الكيميائي ^1-5 (اللوني، مطياف الكتلة) والمناعية ^6-9 طرق الكشف. اكتسب هذا الأخير مصلحة في مجال الرصد البيئي، كما هي المناعية المتاحة في مجموعة كبيرة ومتنوعة من الأشكال، هي محددة لتاالحليلة r يمكنك الحصول، والوصول إلى حدود منخفضة من الكشف. ^6، هي ^{7 و 10 و 11} مختلفة انزيم مرتبط المقايسات المناعي (ELISA) المتاحة تجاريا وتمكن لتحليل عينات متعددة في وقت واحد على لوحة متعددة أيضا. يتكون الإجراء في خطوات التفاعل المتعاقبة التي يمكن أن يستغرق بضع ساعات. ويمكن الكشف عن المنتج النهائي من ردود الفعل البصري لتحديد تركيز جزيء الهدف على أساس منحنى المعايرة.

وتشمل الإجراءات SPE الكلاسيكية الماصة قبل تكييف، واستخراج عينة والغسيل والشطف، والتركيز عن طريق التبخر من شاطف. المذيبات المستخدمة للتخفيف من هذا المستخلص يتم اختياره تبعا لطريقة الكشف. للحصول على طرق المناعية، وكمية من المذيبات العضوية التأثيرات بشدة حساسية هذه الطريقة. ¹²

بالإضافة إلى الانتعاش والأداء ما قبل الاعتقال، يحتاج الأسلوب أيضا أن تكون بسيطة وفعالة من حيث التكلفة. أتمتة الاجراءه يساعد على الحد من الأخطاء المتعلقة البشرية. في عملنا السابق ¹³ قدمنا ​​النموذج من أجل SPE الآلي، وتطبيق أسلوبنا في تحليل الهرمون الطبيعي 17β استراديول في عينات مياه البحر. مع الفيديو الحالي نود تسليط الضوء على المزايا التقنية من أسلوبنا مقارنة مع التقليدية خارج الخط وعلى الخط SPE، والتوافق خاص مع الكشف عن طريق تفاعلات المناعية. وصفنا بروتوكول تطبيقها على عينات المياه للكشف عن 17β استراديول. يتم تنفيذ SPE مع يتم تنفيذ octadecyl السيليكا (C18) المرحلة الماصة وشطف مع الميثانول المخفف.

ملاحظة: يصف بروتوكول التالية إجراء SPE على 100 عينة مل من الماء مع C18 الماصة وشطف مع 50٪ ت / ت الميثانول. يتم تخفيف العينة المخصب لتصل الى 10٪ ت / ت الميثانول قبل التحليل مع انزيم مرتبط المناعي مقايسة (ELISA) عدة.

1. إعداد الكواشف

1. تحضير عينات المياه
   1. قبل أي خطوة أخرى، تصفية كل عينة 100 مل من الماء مع مرشحات حجم 0.2 ميكرون المسام.
   2. ارتفاع العينة مع التركيز المطلوب عن طريق تمييع حجم مناسب من حل إشارة إلى حجم المياه. على سبيل المثال، وإعداد 100 مل من عينة المياه مع 100 نانوغرام / L من E2 عن طريق تمييع 3.3 ميكرولتر من محلول إشارة E2 بتركيز 300 ميكروغرام / لتر. تمييع هذا الحل عشر مرات للحصول ارتفعت عينة مع 10 نانوغرام / L E2. تمييع هذا الأخير مرة أخرى العشر للحصول على عينة من 100 مل مع 1 نانوغرام / L E2.
   3. ضع العينة التي تمت تصفيتها (معدلة أو ارتفعت) في زجاجة مع GL45 الموضوع. استخدام عينة في نفس اليوم. أخذ جزء صغير ليتم تحليلها مع ELISA لتقدير تركيز الأولي.
2. إعداد 300 ميكرولتر من شاطف عن طريق تمييع الميثانول في دي المتأينة (DI-) المياه إلى 50٪ ت / ت في أنبوب ضيق.

2. إعداد العمود SPE

1. إعداد 20 ملغ / مل تعليق من الجسيمات octadecyl السيليكا المواد الماصة عن طريق إضافة ميكرولتر 1600 الأولى من الميثانول ثم 400 ميكرولتر من مياه دي إلى 40 ملغ من العكسي المرحلة الماصة. بإحكام إغلاق الغطاء وتستنهض الهمم مع دوامة.
2. تركيب غشاء أسفل في العمود
   1. اختر واحدا غشاء نايلون مع حجم المسام 11 ميكرون ووضعه على طبقة مزدوجة من النسيج مكافحة الغبار. مع 3 مم لكمة، وقطع اثنين من أجزاء صغيرة في الغشاء.
   2. انتزاع واحدة من الأغشية صغيرة مع نهاية مسطحة ملقط مرشح ووضعه على جانب واحد من العمود.
   3. المسمار الموصل مسطحة القاع مع أنبوب وتشديد. الغشاء هو نآه في المكان والمواد الماصة ويمكن أن يضاف بشكل آمن. رسم السهم على جثة لافتا عمود في نهاية حيث وضعت الغشاء.
3. إعداد العمود الماصة معبأة
   1. تأمين العمود على حامل مع سهم يشير نحو القاع. يجب تعيين العمود رأسيا وقت ممكن.
   2. إرفاق فارغة 10 مل حقنة القابل للتصرف في نهاية الأنبوب العمود، باستخدام موصلات لور للقفل.
   3. إعداد ماصة صغيرة مع طرف 20-200 ميكرولتر، ضبط مستوى الصوت إلى 100 ميكرولتر. ويتم تكييف هذا الشكل طرف ماصة لحجم العمود الماصة لتكون مستعدة. فإن الإجراء سيكون أكثر صعوبة مع نصائح ماصة أكبر مثل تلك التي استخدمت مع 1 مل الماصات.
   4. تستنهض الهمم تعليق الماصة مع دوامة، والماصة بسرعة 100 ميكرولتر في المركز على العمود. في حين حقن، نضح بلطف عن الحل pipetted الحوض الصغير الغشاء باستخدام الحقنة باليد الأخرى. في هذه الحاديالعمر، ويجب أن يكون الحل ملء الحقنة واضح من الجسيمات، ويمكن في نهاية المطاف أن تراعى سرير الجسيمات في العمود.
   5. كرر هذه العملية 2 مرات أكثر من تهييج تعليق الأسهم بين جميع الخطوات pipetting للضمان وقف متجانس من الجزيئات في الحل. العمود الناتج يحتوي على 6 ملغ من المواد الماصة.
   6. عندما تم تحميل 300 ميكرولتر من تعليق وتجفيفها بواسطة الشفط مع حقنة، والحفاظ على حقنة في موقف ووضع غشاء نايلون الثاني على رأس باستخدام ملقط مع جهة أخرى.
   7. برغي أسفل موصل الثاني مع أنبوب والتخلص الحقنة. العمود SPE جاهزا للاستخدام.

3. إعداد النظام

1. تشديد العمود SPE على الجهاز باستخدام موصلات لور للقفل. يجب أن يكون السهم الذي يشير إلى نفس اتجاه واحد هو مبين على الجهاز.
2. ربط زجاجة تحتوي العينة إلى الجهاز عن طريق الشدقدمت GL45 سلامة غطاء على ذلك.
3. تحميل 200 ميكرولتر من شاطف في الخزان "شاطف".
4. تحميل 800 ميكرولتر من مياه دي في الخزان "التخفيف".
5. ضع زجاجة عند مخرج النفايات لجمع المياه المعالجة خلال خطوة الاستخراج. الشكل ليس مهما ولكن يحتاج إلى أن تكون كبيرة الحجم بما فيه الكفاية فيما يتعلق حجم العينة.
6. ضع قارورة صغيرة عند مخرج الاستشعار لديها القدرة حجم الحد الأدنى من 1.5 مل. وهناك أقصى حجم 1 مل تكون صغيرة جدا كما فقاعات ستشكل في هذا المنفذ عند جمع شاطف المخصب وعازلة التخفيف.
7. تحقق من منظم الضغط هو في موقف مغلقة بتحويلها يدويا، عكس اتجاه عقارب الساعة حتى مزيد من الحركة ليست ممكنة.

4. SPE مع النموذج

1. تشغيل النموذج عن طريق الضغط على زر على ظهره.
2. إعداد واجهة المستخدم واختيار البرنامج
   1. فتح واجهة المستخدم. اختارمنفذ الاتصال من الكمبيوتر الذي يتم توصيل الجهاز من القائمة، ثم انقر على زر "التالي".
   2. أدخل القيم 580 PSET و 30 لdpset. والمضخة ضبط للحفاظ على الضغط في نظام الضغط والخزانات في 580 ± 30 مليبار عند تشغيل.
   3. تحديد وضع الآلية.
   4. في الزاوية وضع الآلي، تحميل ملف البرنامج في "مسار ملف التكوين" مربع.
3. ضبط منظم ضغط
   1. بدء تشغيل المضخة.
   2. تحويل يدويا منظم الضغط حتى قيمة القراءة لPREG هو أدنى ولكن قريبة من 320 مليبار.
   3. إيقاف المضخة.
4. البدء في إجراء SPE
   1. اضغط على "بدء" في وضع زاوية الآلي. ومضخة التبديل على وسوف الاستخراج، وشطف وتخفيف الخطوات تتبع تلقائيا بعضها البعض. يتم تنفيذ الإجراء بأكمله لعينة 100 مل في 50 دقيقة.
   2. تحقق من قيمة PREG. يجب أن تكون في حدود 320-350 مليبار خلال خطوة الاستخراج لضمان معدل التدفق الأمثل.
   3. إغلاق قارورة صغيرة وتخزينها في 4-5 درجة مئوية في الظلام حتى تحليل. تحليل أداء في 30 ساعة التالية لمنع تدهور الحليلة.
   4. التخلص من المياه المعالجة.
5. تنظيف النظام
   ملاحظة: بعد كل إجراء استخراج النظام يحتاج إلى تنظيفها لمنع انتقال التلوث.
   1. إعداد 10 مل من محلول الميثانول 70٪ ت / ت في زجاجة GL 45.
   2. افصل العمود SPE وتوصيل الأنابيب مع الموصلات.
   3. في وضع الآلي، حدد "تنظيف" الملف وتشغيله مع ضبط ضغط نفسها.

5. الكشف عن استراديول تركيز مع ELISA

1. إعداد العينات المعايرة مع تركيز على النحو المبين في بروتوكول المتوفرة مع عدة ELISA الذي يتم استخدامه. إعداد calibra واحدنشوئها مع مجموعة نفس المصفوفة كما العينة، ومعايرة مجموعة واحدة مع الميثانول 10٪ ت / ت.
2. الاستغناء عن المبلغ اللازم للعينة في الآبار على لوحة، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. استخدام عينات المعايرة، وعينات المياه غير المعدلة وارتفعت التي تم تصفيتها لكن لم تتم معالجتها مع SPE، وإثراء العينات في الميثانول 10٪ ت / ت. استخدام 3 آبار في عينة للحد من الخطأ المرتبط الفحص.
3. اتبع مؤشرات على البروتوكول الذي يتم توفيرها مع عدة لإضافة المواد المتفاعلة، فترة حضانة والغسيل ومزيد من التفاعل مع الإنزيم.
4. قراءة إشارة ضوئية في كل بئر وفقا لتعليمات الشركة الصانعة عدة مع أداة قارئ لوحة وجمع البيانات.
5. استخدام البرنامج للصك قارئ لوحة لتناسب منحنيات المعايرة وتحديد تركيز E2 في العينة الأولية مع نفس المصفوفة، والعينات المخصب مع الميثانول 10٪ ت / ت.

تم تقييم استنساخ المواد الماصة التعبئة من قبل التجفيف والترجيح والمواد الماصة pipetted في قوارير زجاجية ويتم إظهار النتيجة في الشكل 1. استنساخ وقت الحقن تم اختباره لمدة 100 مل العينات، كما هو مبين في الشكل 2. التركيز في البداية ومرحلة ما قبل ارتفعت المركزة تم تحديد العينات باستخدام مجموعة ELISA التجارية ل17β استراديول وتظهر في الشكل 3.

ويشمل الإجراء المقترح المستخدم لإعداد المرحلة الماصة (الشكل 1). وتعقد جزيئات المواد الماصة بين اثنين من الأغشية لتحقيق الاستقرار الميكانيكي ومكتظة الضغوط التي مورست مع حقنة في حين pipetting لتعليق في العمود. العمود الناتج على مبلغ الأمثل من 6 ملغ من المواد الماصة المختار مع خطأ 6٪ فقط على هذه القيمة. يعمل هذه الخطوة أيضاكما تكييف المواد الماصة، كما يتم إعداد تعليق في ظروف المذيبات المعتمد.

بعد إعداد وتثبيت العمود SPE على النظام، وتحميل حلول في الخزانات المناسبة، ومؤتمتة بالكامل الإجراء قبل التركيز ويتطلب في مجموع أقل من 1 ساعة ل100 مل العينة (الشكل 2). يتم تنفيذ الاستخراج في 40 ± 8 دقيقة. لا تزال تتأثر المعلمتين فقط من قبل المستخدم، وإعداد المواد الماصة معبأة وتحديد معدل التدفق. أول سيتم حلها عن طريق تطبيق أساليب واسعة النطاق للعمود تلفيق. ويرتبط الثاني إلى دليل التكيف من منظم الضغط، والذي يحدد قيمة الضغط تستخدم لدفع الحلول من خلال النظام. سوف يتم القضاء على هذا المصدر من الخطأ من خلال تنفيذ منظم ضغط الإلكترونية.

وفيما يتعلق العروض، والعلاقات العامةعامل الإلكترونية تركيز يتحقق هو 100. الأولى، ويتم ذلك 500 أضعاف ما قبل الاعتقال التي يبلغ حجمه مستخلص من مواد ماصة مع 50٪ ت / ت الميثانول. ثم يتم تنفيذ 5 مرات التخفيف عن طريق إضافة مياه دي. هذا التخفيف يقلل من محتوى المذيبات ويحافظ على الحساسية المناعية. عند النظر في منحنيات المعايرة للELISA (الشكل 3A)، فمن الواضح أن نسبة الميثانول في عينة غنية لا يؤثر على حساسية المناعية. ويرد نتيجة ممثل من قبل التركيز في الشكل (3). تم تطبيق أسلوب لعينات دى المياه ومياه البحر الاصطناعي ارتفعت مع 1 نانوغرام / لتر من 17β استراديول. في حين أن تركيزات عينة هي أقل من الحد من الكشف، وأسلوب ما قبل التركيز يجلب بنجاح تلك العينات في نطاق مقايسة (30 - 30،000 نانوغرام / L). وقد تم الحصول على المبالغ المستردة من خلال مقارنة التركيز النهائي مع تركيز ارتفعت النظري. المبالغ المستردة من 128٪ ± 22٪ و 107٪ ±حسبت 6٪ لدى المياه ومياه البحر الاصطناعي على التوالي (الشكل 3B).

الشكل 1. توضيحات واستنساخ أسلوب الماصة التعبئة. هناك ثلاث خطوات: تأمين غشاء نايلون الأول مع موصل الأول، عن طريق الحقن تعليق الماصة، وإغلاق العمود عن طريق إدخال غشاء الثاني والموصل. العمود الناتج يحتوي على 6 ملغ من المواد الماصة مع الانحراف 6٪ القياسي (ن = 6 إعداد والأعمدة مرجح). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. الخطوة بخطوةتوضيح الإجراء مع استنساخ من الوقت لحقن العينة. يتم تحميل مدخلات الحل في الخزانات أو زجاجة. مخرجات هما العينة المجهزة (النفايات) وعينة غنية، وهو متوافق لتحليلها من قبل المناعية مع محتوى المذيب منخفضة. آليا الإجراء الشامل، ويأخذ أقل قليلا من 1 ساعة (ن = 31 بانحراف معياري). وسلط الضوء على تأثير المستخدم على معدل التدفق مع شخصيات الزرقاء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. نتائج ما قبل تركيز E2 وتحليلها من قبل ELISA. (A) منحنيات المعايرة للELISA ونقاط قياس ل1 نانوغرام / L ارتفعت مياه دي (ط) ومياه البحر الاصطناعي (ب) بعد السكة الحديدichment. (B) الاسترداد التي تم الحصول عليها عن 1 نانوغرام / L ارتفعت مياه دي (ط) ومياه البحر الاصطناعي (ب) عينات بعد التخصيب (ن = 4). أشرطة الخطأ الانحرافات المعيارية الناشئة عن عدد من مكررات والآبار 3 على لوحة ELISA التي استخدمت لتحديد تركيز في كل عينة. تم تعديل هذا الرقم من ^(13). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

واقترح طريقة جديدة لإعداد عينات من المياه تليها التحليل باستخدام المناعية. تمكن أداة لتنفيذ استخراج المرحلة الصلبة بطريقة مؤتمتة وسهلة الاستعمال.

الترشيح من عينة المياه قبل الحقن لها في النظام أمر بالغ الأهمية. فإن أي الجسيمات التي لا تزال موجودة في الحل أن يسبب انسداد في الشبكة الموائعية وعرقلة العمود SPE. خطوة هامة أخرى هي إعداد العمود SPE. كمية من الجسيمات في العمود أمر بالغ الأهمية لتحقيق أفضل أداء ممكن. يجب توخي الحذر خاصة عند إعداد تعليق جسيمات المواد الماصة، لتجنب التكتل من الجسيمات. ويتحقق ذلك عن طريق إضافة لأول مرة جزء المذيبات إلى الماصة الجافة، ثم الكسر مياه دي. ثم، خلال خطوة التعبئة، من المهم أن خلط تعليق بشكل جيد في حين الشفط 100 ميكرولتر مع ماصة. في نهاية الموالية SPEالتعريف الشخصي إجراءات، وتنظيف بشكل صحيح النظام أمر بالغ الأهمية. أولا، فإنه يمنع انتقال التلوث عند العمل مع عينات مختلفة، وثانيا أنه يتجنب مخاطر التلوث الحيوي الصك عندما لا يتم استخدامها.

كما نوقش في المقدمة، واستخدام أساليب المناعية للكشف عن لتحليل جزيئات الملوثات صغيرة في بيئة آخذ في التوسع. تلك الأساليب تصل إلى حدود المكتشفة في انخفاض مستويات نانوغرام / L ^{7 و 11 و} لديها ميزة كونها محددة جدا. وتستخدم هذه الأساليب في تركيبة مع الطرق الكيميائية، ومعظمهم من التقنيات ذات الصلة مطياف الكتلة. ^{14، 15} هذا الأخير لا تقييد استخدام المذيبات العضوية والاستفادة من أنظمة SPE الآلية التي تمكن من الوصول إلى العوامل قبل التركيز المطلوب العالية. في المقابل، المناعية هي أكثر حساسية لفحص تكوين العازلة وعدم تكييفها تقنيات إعداد نموذج لتسهيل هذه العملية. وتكرس وحدة جهدنا لتحليل الصورةجزيئات مول من قبل المناعية.

مع أسلوبنا الآلي، يتم التوصل إلى تخصيب 100 أضعاف من العينة وتصاريح للكشف عن تحليلها في نطاق تركيز ELISA. إذا كانت تلك العروض قبل التركيز تبدو منخفضة مقارنة SPE التقليدية، أنها تطابق تماما متطلبات المناعية الكشف. وعلاوة على ذلك، من أداة لديها حجم صغير (25 سم × 15 سم × 10 سم) ومنخفضة التكلفة مقارنة نموذجية الاجهزة SPE اليدوية أو الآلية. ¹³ إذا لزم الأمر، يمكن بالتالي زيادة الإنتاجية لتحليل عينة متعددة باستخدام عدد قليل من الأجهزة بالتوازي. وهناك إمكانية أخرى تتمثل في تصميم طريقة لكميات صغيرة من عينة وشاطف، الذي من شأنه أن يقلل من الوقت اللازم لإجراء العملية. وقد نوقشت بعض القيود الأخرى من خلال وصف النتائج. لا تزال هناك خطوتين التي يشارك فيها المستخدم، كلاهما مرتبط إلى درجة تطور هذا النموذج وسوف يتم حلها عن طريق اتخاذ خطوة أخرى نحو ميلانجهاز ommercial. تتم التعبئة للمرحلة الماصة يدويا. ولكن طريقة وثبت أن تكون سهلة وقابلة للتكرار. ونحن واثقون من أن الأعمدة يمكن التخلص منها يمكن أن تنتج إذا تم إنتاج هذا النظام على نطاق والعالي.

باختصار، لقد وصفنا طريقة جديدة لأداء SPE على، الجهاز الآلي المضغوط. لقد أثبتنا قدرته على تحليل عينات المياه من خلال المناعية من خلال وصف طريقة استخراج وقبل تركيز تطبيقها على الكشف عن 17β استراديول من قبل ELISA عدة التجارية. طريقة سهلة الاستعمال وفعالة من حيث التكلفة، ويمكن في المستقبل أن تطبق في خط مع أجهزة الاستشعار (التقدم في العمل). نتوقع أن برنامجنا تمكين لإجراء عمليات استخراج المرحلة الصلبة مماثلة على عينة المصفوفات أكثر تعقيدا من أهمية عالية لرصد EDCs، مثل الغذاء أو البول. ونحن مقتنعون سيكون لدينا نظام دعم تطبيق أساليب المناعية الكشف عن المنشأة والقادمة فيمجال التحليل البيئي.

The authors have nothing to disclose.

This work was funded by the European Union Seventh Framework Program FP7/2007-2013 under grant agreement no. 265721. The authors thank the RIKILT Institute for Food Safety (NL) for their support in this project.