Un nuovo approccio che elimina la gestione per lo studio Aggressione e l'effetto "Loser" in

Durante mosca della frutta lotte, i modelli comportamentali osservati, combattere la dinamica e l'apprendimento e la memoria associata sono influenzate dalle condizioni sperimentali. Il protocollo presentato qui descrive una nuova procedura che elimina del tutto la gestione di mosche durante gli esperimenti. Questo migliora la dinamica di lotta e consente la formazione di forti effetti "perdente".

Il comportamento aggressivo in Drosophila melanogaster è composto l'espressione sequenziale di modelli di comportamento stereotipati (per l'analisi vedi ^1). Questo comportamento complesso è influenzata da fattori genetici, ormonali e ambientali. Come in molti organismi, precedente esperienza di combattimento influenza la strategia di combattimento di mosche e l'esito dei concorsi successivi: perdere una lotta aumenta la probabilità di perdere gare successive, rivelando effetti "perdente", che probabilmente coinvolgono apprendimento e la memoria ^2-4. L'apprendimento e la memoria che accompagna l'espressione di comportamenti sociali complessi come l'aggressione, è sensibile al pre-test gestione degli animali ^5,6. Molte procedure sperimentali sono utilizzati in diversi laboratori per studiare aggressione ^7-9, tuttavia, non abitualmente protocollo utilizzato che esclude movimentazione di linea è attualmente disponibile. Qui, segnaliamo un nuovo apparato comportamentale che elimina la manipolazione di mosche, con instead loro innate risposte geotactic negative per spostare gli animali all'interno o all'esterno delle camere di combattimento. In questo protocollo, le piccole arene di combattimento circolari contenenti una tazza di cibo sono divise in due metà uguali da un cursore in plastica estraibile prima dell'introduzione di mosche. Le mosche entrano camere dai loro flaconi di isolamento a casa via porte scorrevoli da camera e geotassi. Dopo la rimozione di cursori di plastica, le mosche sono liberi di interagire. Dopo periodi di tempo specificati, le mosche sono separati di nuovo slider per la successiva sperimentazione. Tutto questo è fatto facilmente senza la manipolazione di singoli mosche. Questo apparecchio offre un nuovo approccio per studiare l'aggressione e l'apprendimento e la memoria associata, compresa la formazione di effetti "perdente" nei combattimenti mosca. Inoltre, questo nuovo apparato comportamentale generico può essere impiegato per studiare altri comportamenti sociali di mosche e dovrebbe, in generale, essere di interesse per investigare esperienza cambia legati a processi comportamentali fondamentali.

Aggressione in sistemi animali è fortemente associato con l'acquisizione e la detenzione di risorse come il cibo, il territorio e compagni. Dato il ruolo importante questo svolge nella forma fisica degli individui, non è sorprendente che l'aggressione si è evoluta in tutto il regno animale. Come tratto adattivo che avvantaggia direttamente gli individui, una forte componente di apprendimento e la memoria è associata con l'aggressività. In concorso per rango sociale, precedente esperienza di combattimento influenza l'esito dei concorsi successivi. In generale, prima aumenta l'esperienza di perdere, e l'esperienza vincente diminuisce, la probabilità di perdere concorsi successivi (chiamati "perdente" e "vincitore" effetti). Effetti "Loser" sono state osservate in una vasta gamma di specie, e alcuni rapporti suggeriscono che queste possono durare per diversi giorni mentre "winner" effetti di solito sono di durata più breve ^2,10,11.

La prima relazione di comportamento aggressivonei moscerini della frutta (D. ampelophila) era di Sturtevant nel 1915 in un documento in questione con il riconoscimento del sesso e selezione sessuale ^12. Mezzo secolo più tardi, esami più completi di frutta Male vola aggressione sono state fatte, che descriveva la maggior parte dei modelli comportamentali osservati durante i combattimenti mosca della frutta. Questi esperimenti sono stati condotti per lo più in piccoli gruppi di mosche maschio e femmina osservati nel giro di ore ^13-15. Recentemente, con l'aggiunta di potenti strumenti genetici, diadiche singole configurazioni lotta sesso e tempi più brevi di osservazione, D. melanogaster è emerso come un importante sistema modello per lo studio della biologia di aggressione ^1,16. Analisi di scontri tra stesse coppie sesso di mosche maschio e femmina dimostrato che l'aggressione coinvolge comportamenti stereotipati che la transizione da una all'altra in modo statisticamente affidabile ^1,17. Alcuni dei modelli comportamentali osservati sono sesso-specifico, mentre altri si osservano in lottas in entrambi i sessi. Combatte Maschio Vai livelli di intensità più elevate rispetto lotte femminili e risultato nella formazione di rapporti di dominanza con chiare "vincitori" e "vinti". Allo stato attuale, molti laboratori hanno iniziato a indagare il biochimico ^18, neurali ^7,19-21, e genetici ^{di 22} basi di aggressione. Purtroppo, una meta-analisi di studi al fine di conoscere le dinamiche di lotta e la formazione e il mantenimento di rapporti di dominanza è problematico a causa dell'uso di una molteplicità di procedure sperimentali in diversi laboratori. Essenzialmente tutte le tecniche descritte in letteratura coinvolgono movimentazione e manipolazione di mosche per introdurli in arene ^19,23,24 e durante l'esperimento comportamentale ^3,4 trasferire mosche fuori arene. Gentle aspirazione è il modo più comune per manipolare le mosche ^3,4,23-25, ma freddo o _di CO 2 anestesia sono utilizzati anche ^9,26, anche se pstudi revious già hanno segnalato che queste procedure hanno effetti deleteri sul comportamento fly ^27,28. Un periodo di almeno 24 ore è suggerita dopo l'uso di anestetici per ridurre al minimo gli effetti sul comportamento ^29,30.

Mosche imparare dalle precedenti esperienze di combattimento e modificano il loro utilizzo di schemi comportamentali in situazioni nuove, il che suggerisce che apprendimento e la memoria accompagnano e sono conseguenze di incontri agonistici. In questo senso, volano combattimenti assomigliano a situazioni di apprendimento condizionamento operante in cui vola a sapere che una strategia ha funzionato e quindi utilizzare sempre più spesso durante gli incontri successivi. Mosche cambiare le loro strategie di combattimento dopo rapporti di dominanza sono stati stabiliti durante i combattimenti, con i vincitori affondo sempre di più e vinti sempre meno. Dopo un periodo di separazione, perdenti precedenti mostrano un comportamento molto più remissivo e sono altamente probabile perdere ² ° combatte se abbinato con fl ingenuai precedenti vincitori o ^3,4. Tuttavia, l'assenza di una procedura sperimentale che esclude la gestione di mosche ha fatto studi approfonditi di effetti "perdente" difficili. In un recente studio, abbiamo confrontato due procedure sperimentali comunemente impiegati nei laboratori (aspirazione e freddo-anestesia) per introdurre le mosche nelle camere di comportamento alla nuova procedura che elimina la manipolazione. I risultati hanno mostrato che a freddo anestesia avuto molto maggiori effetti negativi sulla aggressione di aspirazione, ma anche l'aspirazione ridotto il livello di aggressività da mosche. Aspirazione, tuttavia, ha causare effetti altamente significativi sulla apprendimento e la memoria che accompagnano l'aggressione. A seguito di protocollo identici con due procedure sperimentali (aspirazione e senza manipolazione), un effetto robusto "perdente" è stato osservato solo quando la gestione di mosche è stato eliminato dalla procedura ^5,6 sperimentale.

Idealmente, studi di Drosophila aggressione in labolabo- dovrebbero includere situazioni ambientali che vola normalmente incontrano in natura (competizione per le risorse, il territorio a difesa e lo spazio di fuga). Inoltre, le condizioni sperimentali devono essere ottimizzate per indurre in modo affidabile, osservare e interpretare il comportamento in esame (cercano di minimizzare la movimentazione degli animali, limitare l'uso di CO ₂ come anestetico, e standardizzare le procedure sperimentali). Nel tentativo di affrontare la maggior parte o tutti questi problemi, abbiamo progettato un nuovo apparato comportamentale che elimina la manipolazione di mosche prima, durante e dopo la loro introduzione in arene comportamentali. Con questi apparecchi, le mosche usano i loro geotassi negative innate per essere spostati e trasferiti all'interno e all'esterno delle camere di lotta. Eliminando la manipolazione di mosche, il protocollo mira a: (a) ridurre la variabilità comportamentale tra individui; (b) ridurre il tempo necessario per mosche di interagire e generare rapporti di dominanza chiare (maschi); e (c) indurre affidabile forte behavio abbastanzamodifiche ral per consentire la formazione di effetti "perdente".

Questo protocollo descrive un nuovo apparato sperimentale e una procedura passo passo per analizzare aggressione e per consentire la formazione di un forte effetto "perdente" in D. melanogaster. Ci aspettiamo che questo apparato comportamentale può essere facilmente adattato per lo studio di altri comportamenti sociali esibiti dai moscerini della frutta.

Nota: La seguente è una descrizione passo-passo del protocollo sperimentale che usiamo per permettere affidabile attivazione di aggressione tra coppie di moscerini della frutta maschi (D. melanogaster). Questa procedura induce la formazione di un effetto "perdente". Usando questo protocollo, a breve termine effetto "vincitore" è stato anche recentemente riportato ^5,6. Figura 1 mostra la sequenza temporale degli esperimenti comportamentali.

Figura 1. Timeline dell'esperimento aggressione. Il giorno 1, pupe maschio in fase avanzata (quando le ali diventano nere) sono isolati in flaconi di isolamento preparate al momento. Il giorno 5 dopo emergendo come gli adulti, 4 giorni di età mosche di sesso maschile sono anestetizzati con _CO 2 e dipinte con colori diversi per scopi di identificazione. Il giorno 7, tazze di cibo e le camere di combattimento sonopronti a configurare gli esperimenti comportamentali. Due 6-7 maschi adulti di un giorno vengono caricati nelle camere e sono in grado di interagire. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

1. Giorno 1: Isolamento sociale della Pupe

1. Sollevare e mantenere scorte volare in un 12 ore luce / 12 ore buio ciclo incubatore ambiente controllato a 25 ° C e 50% di umidità relativa.
2. Preparare fiale di isolamento: Scaldare alimento fly fresco fino a quando fuso. Usando una pipetta Pasteur, trasferire circa 1,5 ml di cibo mosca fuso in tubi vuoti prova vetro singoli (1,6 x 10 cm). Lasciare che il cibo a solidificare.
3. Isolare pupe: Con un pennello fine, rimuovere delicatamente una pupa maschile all'ultimo stadio (quando le ali diventano nero) dal magazzino flaconcino e posizionarlo sul lato di un alimento contenente provetta preparati al momento. Chiudi fiale di isolamento in cotone (Figura 2).
4. fiale Luogo isolamento contenenti pupe nella luce 12 ore / 12 hr incubatore buio a 25 ° C e 50% di umidità relativa.

Figura 2. Isolamento sociale. Una pupa maschio in fase avanzata è posto sul lato su una fiala isolamento preparati al momento. Fiale di isolamento contenenti pupa vengono inseriti nella luce 12 ore / 12 ore incubatore buio a 25 ° C e 50% di umidità relativa. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

2. Giorno 5: Pittura mosche per singoli scopi di identificazione

1. Eseguire questo passaggio al giorno 5 con 4 mosche di sesso maschile di un giorno e due giorni prima degli esperimenti comportamentali per ridurre al minimo l'effetto negativo di CO ₂ anestesia.
2. Anestetizzare mosca con CO _2.
3. Con un bel stuzzicadenti, mettere un piccolo punto di vernice acrilica sul torace. Evitare di posizionare vernice sulla testa, ali, addome o gambe (Figura 3).
4. Lasciate asciugare la vernice per circa 10 secondi, e trasferire delicatamente le mosche di nuovo ai loro flaconi di isolamento originali.
5. Ritorno fiale isolamento alla luce 12 ore / 12 hr incubatore buio a 25 ° C e 50% di umidità relativa.

Figura 3. L'identificazione individuale. Dopo anestetizzare una mosca con CO _2, una piccola goccia di vernice acrilica viene applicata sul torace. A scopo di identificazione individuale, diversi colori sono utilizzati (bianco e blu qui). Consultare quanto detto su uso di _CO 2 in questa fase. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questo figuri.

3. giorno 7: Preparazione del Apparatus

1. Preparare Coppe alimentari:
   1. Riscaldare il cibo volare fresco fino a quando non si scioglie.
   2. Usando una pipetta Pasteur, trasferire circa 0,8 ml cibo al coperchio di una fiala tappo a vite (1.5 cm di diametro, altezza 1 cm) e si lascia raffreddare. Evitare di bolle d'aria.
   3. Fai la pasta di lievito fresco miscelando lievito secco con qualche goccia d'acqua. Quando spessore, applicare una piccola goccia di lievito in pasta al centro della superficie tazza dell'alimento con uno stuzzicadenti (Figura 4).

Figura 4. Preparare la coppa cibo. Una tazza cibo è preparato con il cibo fresco mosca. Dopo le solidifica alimentari, un punto di lievito in pasta si trova nel centro della superficie tazza cibo. Clicca qui per view una versione più grande di questa figura.

2. Preparare singole camere di combattimento:
   1. Lavare accuratamente le camere di apparecchi e di combattimento individuale con acqua prima dell'utilizzo ogni volta. Asciugare con un tovagliolo di carta prima dell'uso.
   2. Collocare una tazza di cibo al centro di ciascuna camera lotta e fissare con una goccia di stucco.
   3. Coprire camere di combattimento con il coperchio dell'apparecchio (Figura 5).
   4. Posizionare l'apparecchio in un ambiente ad alta umidità (60%) a 25 ° C.
   5. Posizionare una sorgente luminosa sopra l'apparecchio per illuminare le camere di combattimento e impostare una videocamera per registrare dall'alto.

Figura 5. Preparazione della camera di combattimento individuale. La coppa cibi preparati al momento con un punto di lievito in pasta sulla superficie è fissato in lavato fi individualecombattendo camere. Chambers sono chiusi con il coperchio a due pezzi che permette l'inserimento di un divisorio in plastica opaca in diversi alloggiamenti di combattimento. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

4. Giorno 7: Esperimento comportamentale

1. Eseguire gli esperimenti comportamentali con 6-7 giorni di età mosche di sesso maschile.
2. Inserire divisori di plastica in ogni camera di combattimento.
3. Rimuovere il tappo di cotone dal tubo di isolamento e posizionare il tubo sotto un foro aperto sul lato dell'apparecchio.
4. Lasciate che la mosca entra nella camera di combattimento da geotassi negativi, di solito nel giro di pochi secondi.
5. Chiudere la parete scorrevole dopo la mosca ha lasciato il tubo ed è entrato nella camera.
6. Ripetere la procedura per introdurre il secondo mosca nella camera lotta sull'altro lato del dispositivo.
7. Collocare l'apparecchio torna in videotapi illuminatoPosizione ng.
8. Iniziare la registrazione di video e rimuovere il divisorio in plastica per consentire le mosche di interagire.
   1. Per gli esperimenti Aggressione:
      1. In questi esperimenti, registrare combatte per almeno 20 minuti al fine di garantire la formazione di forti rapporti di dominanza.
      2. Dopo il tempo desiderato, interrompere la registrazione video.
      3. Rimuovere le mosche dalle camere di combattimento invertendo la procedura descritta sopra.
      4. Lavare accuratamente l'apparato comportamentale con detergente delicato e acqua dopo ogni uso e risciacquo.
   2. Per "Loser" Esperimenti Effetto:
      Nota: In questi esperimenti, primi scontri sono considerati come la fase di condizionamento e secondo combatte come la fase di test. Il periodo di riposo tra i combattimenti possono differire, ma 10 minuti permette la formazione di un forte effetto "perdente".
      1. Seguire la procedura sopra descritta per eseguire un primo incontro.
      2. PUNTO CRITICO: per indurre la formazione di un "perdente" mentalità, eNsure che primi scontri sono almeno 20 minuti lungo al fine di stabilire forti relazioni di dominanza. Dopo 20 minuti, reinserire il divisorio in plastica nelle camere di combattimento per separare le mosche.
      3. Dopo un periodo di 10 minuti di riposo, rimuovere delicatamente il divisorio in plastica per consentire le mosche di interagire per la seconda combattimenti.
      4. Alla fine del secondo 20 min lotta, arrestare la registrazione video.
      5. Rimuovere le mosche delle camere a comportamentali come sopra.
      6. Ancora una volta, pulire accuratamente l'apparato comportamentale.

5. Analisi Comportamentale

1. Trasferimento Film
   1. Collegare le telecamere al computer.
   2. Convertire mosche .MTS .Mov mosche e unire clip filmati insieme, utilizzando il video software di conversione e l'opzione "join clip selezionati".
   3. Osservare e analizzare ogni film con software di lettura video.
2. Segnando Comportamento
   Nota: questo può essere fatto manualmente o noiing comportamentale software programma di analisi, se disponibile. L'illustrazione che segue descrive una possibile analisi manuale per un effetto "perdente".
   1. Punteggio ottenuto il tempo del primo incontro tra le mosche sul tazza cibo (incontri sono interazioni tra coppie di mosche che durano almeno 2 sec) e il tempo di comparsa del primo affondo (un modello di comportamento in cui una mosca erge alto sulla sua zampe posteriori e scatta verso il basso e tenta di afferrare l'avversario). Quindi, segnare la latenza di affondo (l'intervallo tra il primo incontro e il primo affondo).
   2. Contare il numero totale di incontri e affondi durante un combattimento.
      Nota: Se si desidera, si può anche segnare altri modelli comportamentali, come minaccia ala, boxe, scherma, ritiro o il numero di incontri prima del primo affondo, per esempio.
   3. Punteggio momento della creazione di una posizione dominante (tempo che intercorre tra il primo incontro e il momento in cui una mosca ritiri per tre volte consecutive al largo della tazza cibo poppaer la ricezione di affondi). Nota che volare è il vincitore, e che il perdente della lotta.
3. Calcolo di un effetto "Loser"
   1. Dividere il numero di combattimenti in cui perdenti precedenti perdono 2 combattimenti ^nd (Losers che perdono: LL) per il numero totale di scontri, e moltiplicare per 100. La percentuale ottenuta rappresenta l'effetto "perdente":
      [(# Vola LL) / (# lotta totale)] x 100
   2. Utilizzare un test chi-quadrato per confrontare se l'effetto "perdente" è statisticamente diverso dal valore atteso del 50%.

Questa sezione presenta la forma della camera comportamentale e l'analisi di un tipico insieme di esperimenti comportamentali secondo il protocollo descritto sopra misurazione aggressività e la formazione di un effetto "perdente". Illustrato sono anche esempi di altri comportamenti che possono essere misurati con questo apparecchio.

La figura 6 mostra una rappresentazione schematica del nuovo apparecchio. L'apparecchiatura è composta da tre pozzi cilindrici (dimensione: 22,86 mm di diametro, 17 mm di altezza), che sono le camere di combattimento. Il coperchio in due pezzi chiude le camere combattimento sulla parte superiore e permette l'inserimento di un divisore plastica opaca sottile che divide le camere in due sezioni uguali. Su ogni lato dell'apparecchiatura, pareti scorrevoli con tre fori (diametro 15.88 mm) consentire il caricamento delle mosche nelle camere di combattimento di geotassi negative direttamente dai flaconi isolamento. Dopo le mosche entrano nelle camere di combattimento, le pareti scorrevoli sono l'usod per chiudere i lati delle tutte le camere. A questo punto, i due mosche sono all'interno delle arene di combattimento, ma non possono interagire causa dei divisori. Rimuovendo questi, le mosche sono liberi di interagire e i modelli comportamentali successive possono essere osservate e registrate.

Esperimenti Aggressività: 38 lotte tra coppie di wild type CS maschi sono stati eseguiti. Parametri comportamentali diversi sono stati segnati mentre mosche erano sulle tazze di cibo e le dinamiche di lotte sono stati analizzati (tabella 1). Una media di 24 incontri (brevi incontri tra mosche), 54 affondi (un indicatore di combattimento più alta intensità) è stato osservato nel corso di un periodo di tempo di 20 minuti, con il primo affondo di solito consegnato durante l'incontro ² °. In media, il ¹ ° incontro, il ¹ ° affondo e il tempo necessario per stabilire una posizione dominante sono stati osservati 2, 4 e 8 minuti dopo l'inizio della registrazione. Nella maggior parte dei casi, gli ultimi 12 min di lotte consistono di sequenze ripetitive di elevata intensità EncoUnters con gli animali subordinati si avvicina, viene attaccato e ritirandosi, rafforzare la posizione dominante o lo stato di sottomissione di ogni animale.

"Loser" esperimenti effetto: Per cercare per la formazione di un effetto di "perdente", 21 1 ^st lotte 20 Durata min sono state effettuate tra coppie di wild type CS maschi. Il divisore camera di scorrimento quindi è stato inserito per separare le mosche. Dopo 10 minuti, ² ° 20 min scontri sono stati eseguiti tra (a) precedenti vinti e vincitori familiari o (b) vinti e vincitori precedenti sconosciute e questi sono stati analizzati come sopra (Figura 7). In entrambe le condizioni, 20 perdenti precedenti hanno perso la 2 combattimenti ^nd (95,5%), dimostrando un effetto robusto "perdente". I risultati sono stati confrontati lotta al valore atteso di 50-50 con un due code analisi Chi-quadrato e un effetto altamente significativo "perdente" è stato trovato. Altri cambiamenti comportamentali sono stati osservati in soggetti perderetra il 1 ^{° e 2 °} combatte accompagna la formazione dell'effetto "perdenti" ^5.

Altri comportamenti di aggressività possono essere studiati nel dispositivo: per illustrare, corteggiamento e locomozione esperimenti sono stati eseguiti (T grado 2). Per il corteggiamento, le mosche maschio e femmina sono stati caricati da geotassi negativi nelle camere di comportamento, divisori sono stati rimossi e modelli di comportamento di corteggiamento sono stati segnati. 34 esperimenti sono stati eseguiti e le latenze in tribunale (di tempo tra il primo incontro e il primo corteggiamento = 7 sec) e di accoppiarsi (tempo che intercorre tra il primo incontro e copula = 4 min) sono stati analizzati. Solo 2 i maschi non sono riusciti a copulare durante il tempo 15 minuti di osservazione. Il corteggiamento Vigor Index (la frazione di tempo in cui i maschi trascorso corteggiare femmine durante un periodo di 15 minuti dopo il primo modello di comportamento di corteggiamento) è stato segnato al 75% (Tabella 2). Per locomozione sia il peccatogle mosche o gruppo di 10 mosche sono stati introdotti nelle camere e il numero totale di incroci della linea mediana durante 5 minuti sono stati contati. Mosche singole attraversare la linea mediana della camera in media 73 volte durante 5 minuti, mentre i singoli mosche in gruppi attraversare la linea mediana, in media, 45 volte / 5 min (Tabella 2). Questa diminuzione osservata quando le mosche sono in gruppi può essere spiegato con il ridotto spazio a disposizione per fly e dal tempo che impiegano per interagire con l'altro invece di esplorare il territorio.

Figura 6. Rappresentazione schematica della camera comportamentale. (A) Vista laterale dell'apparecchiatura. La nuova apparecchiatura si compone di tre parti distinte: (a) un blocco di plastica contenente tre individui combattono camere; (b) due pareti scorrevoli con tre fori (15,88 millimetri di diametro) in ciascuno; e (c) il coperchio due pezzi in alto. (B) Topvista dell'apparecchiatura. Le dimensioni del blocco di plastica (a) sono 36.83 mm x 123.19 mm. Ogni camera di combattimento individuo ha un diametro di 22.86 mm ed un'altezza di 17 mm. Fori sul lato che permettono il caricamento delle mosche hanno un diametro di 15,88 millimetri. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7. La formazione di un effetto robusto "perdente". Un effetto significativo "perdente" (percentuale di perdenti che perdono ² ° combatte si osserva quando sono stati associati perdenti precedenti (a) con i vincitori familiari (n = 21, p *** <0.0001) o (b) con i vincitori non familiari per i loro 2 combattimenti ^nd (n = 21, *** p <0,0001) (Lose: 95,5%, Win:. 4,5%, No pareggi) Plfacilità clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tabella 1:. Dinamiche delle interazioni agonistiche tra coppie di mosche maschio media valori ± SEM sono calcolati per ogni parametro segnato come indicatori di aggressività. Il numero totale di incontri e affondi, e il numerodi incontri prima del 1 ° affondo sono stati segnati. Tempi del primo incontro, primo affondo e il dominio, e le latenze di affondo e ad una posizione dominante sono presentati in sec ± SEM (n> 34).

Tabella 2:. Analisi del comportamento di corteggiamento e di locomozione valori medi ± SEM sono calcolati per le latenze in tribunale e copulare (in secondi). Un indice di corteggiamento vigore(in% del tempo speso corteggiare dopo il 1 corteggiamento) è stato segnato dopo maschi e femmine sono stati caricati in camere di comportamento da geotassi negativi (n> 32). Locomozione, quando singoli mosche o gruppi di 10 mosche stati caricati in camere, è stato ottenuto contando il numero totale di incroci della linea mediana durante 5 min (n = 48 e 20).

L'era moderna di usare Drosophila con le sue potenti metodi genetici come organismo modello per lo studio di aggressione iniziata circa una dozzina di anni fa, con l'introduzione di nuove arene sperimentali in cui il comportamento di combattimento affidabile potrebbe essere ottenuto con singole coppie di mosche ^{1,7, 8,17,19.} Queste arene comprese le risorse desiderate (una tazza di cibo, potenziali compagni) e uno spazio per perdente vola a ritirarsi in. Quando i risultati ottenuti con queste arene sono stati aggiunti alla conoscenza sul comportamento lotta moscerino della frutta, Drosophila melanogaster è saldamente affermata come un sistema modello altamente desiderabile per l'esame di un comportamento complesso come l'aggressione ed è usato in molti laboratori. I risultati ottenuti hanno rivelato che sommati: (a) vola mostra aggressività in competizione per le risorse alimentari, l'accesso a compagni o per difesa del territorio ^14,15; (b) i combattimenti sono composti da una serie sequenziale di modelli comportamentali stereotipati ^1; (c)mosche maschio e femmina combattono in abbinamenti stesso sesso (alcuni modelli sono specifici di sesso maschile, alcuni sono di sesso femminile specifica e alcuni sono condivisi da entrambi i sessi) ^17; (d) solo combatte maschi vanno ad elevati livelli di intensità e causare la formazione di rapporti gerarchici con un chiaro «vincitore» e «loser» mosche ^17; (e) un singolo gene infruttuose, della gerarchia di determinazione del sesso, determina se le mosche combattono come maschi o femmine ^{16 e} (f) multiple sostanze ormonali tra cui le ammine e peptidi influenzano l'aggressività nei moscerini della frutta ^7,8,19,20.

Qui, un nuovo approccio è descritto per lo studio della mosca della frutta aggressione in cui la movimentazione delle mosche durante gli esperimenti è eliminato. Questo offre un miglioramento significativo nel protocollo sperimentale tutte le misurazioni comportamentali sono migliorate ^5,6, nuove informazioni relative al comportamento è stato acquisito e l'apprendimento e memoria che accompagnalotte moscerino maschio è notevolmente migliorata. Per illustrare, solo due studi precedenti hanno riportato la formazione di effetti "perdente" in questo ^3,4 sistema modello. In entrambi questi, sono stati utilizzati camere più grandi rispetto a quelli descritti in questo protocollo, le mosche sono stati trasferiti dentro e fuori delle arene di combattimento per aspirazione, e tempi di lotta più lunghi e tempi di intervallo tra i combattimenti sono stati necessari per creare effetti di chiaro "perdente". Il nostro recente studio ha dimostrato che eliminando la movimentazione dal protocollo sperimentale, chiari rapporti di dominanza tra coppie di D. mosche melanogaster maschili sono osservati dopo soli 20 minuti di interazione. Questa quantità di tempo è sufficiente per indurre cambiamenti significativi nella strategie di combattimento in entrambe le mosche durante i combattimenti 1 ^st e di osservare in modo affidabile la formazione di forti "perdente" effetti in 2 scontri ^nd. Inoltre, per la prima volta, chiaro a breve termine "winner" effetti anche stati osservati durante ² °combatte ^5,6.

Per il successo utilizzando questo protocollo, alcuni punti critici devono essere notato. Per indurre e osservare comportamenti aggressivi robusti si consiglia di utilizzare 6-7 mosche maschio di un giorno che si sono tenuti in isolamento sociale in quanto la fase tardiva di pupa. In generale, la disponibilità di risorse che vola sono disposti a competere su (cibo, compagni) è altamente auspicabile al fine di ottenere una forte comportamento di combattimento e la creazione di rapporti di dominanza. Nel corso di questo protocollo, le mosche sono dipinte dopo l'anestesia con CO _2, e che può essere di interesse come il nostro studio pubblicato di recente dimostra che anestetizzante mosche interferisce seriamente con conseguente comportamento ^5. Possibili modi per evitare l'anestesia potrebbe essere quella di non dipingere gli animali se non è importante tenere traccia degli individui. Se la pittura è necessario, tuttavia, l'anestesia dovrebbe essere utilizzata 48 ore prima che gli animali vengono utilizzati in esperimenti o approcci alternativi per l'identificazioneindividui potrebbero anche essere utilizzati ^31. Per indurre forte "perdente" ed effetti "vincitore", è fondamentale che le mosche stabilire e mantenere un rapporto di dominanza durante i primi combattimenti. Nel protocollo qui presentata, utilizzando il ceppo selvatico CS a 25 ° C, 20 min di interazione è sufficiente a generare chiare "vincitori" e "perdenti" e di osservare cambiamenti nelle strategie lotta di individui. In esperimenti effettuati a temperature diverse da 25 ° C o con altri genotipi di CS, tuttavia, il tempo medio per stabilire un rapporto dominanza robusta potrebbe essere diverso. Di conseguenza, il periodo di combattimenti deve essere regolato eseguendo serie di esperimenti preliminari. Infine, come coppie di mosche sono separati dopo i loro primi scontri potrebbe essere importante nel preservare la memoria dei risultati di combattimento. Probabilmente è importante ridurre il movimento del dispositivo e di essere gentile durante l'introduzione del divisore di plastica al fineper minimizzare il disturbo degli animali.

Il design del dispositivo e la copertura a due pezzi che permette la separazione delle camere comportamentali in due scomparti uguali, lo rendono facile da separare le due mosche dopo le prime lotte e di introdurre nuovi avversari in 2 scontri ^nd. Inoltre, come mostrato nella tabella 2, con piccoli aggiustamenti del protocollo sperimentale, la stessa apparecchiatura può essere usato per studiare corteggiamento, locomozione o addirittura maggior parte dei comportamenti mosca della frutta in quello che dovrebbe essere condizioni meno stressante per gli animali da esperimento. Possibili ulteriori miglioramenti sulla procedura potrebbero essere di introdurre una qualche forma di controllo termostatico nell'apparecchio (elemento piezoelettrico o una serpentina per far circolare il fluido a temperatura controllata) per consentire un facile utilizzo di reagenti sensibili alla temperatura (shibire ^TS1, canale dTRPA1).

In sintesi, abbiamo ideato un nuovo apparato che offre una nuova strategia per lo studio dell'aggressività in moscerini della frutta in cui la manipolazione di mosche prima, durante e dopo gli esperimenti è stato eliminato. Tutte le misure comportamentali sono migliorate con la nuova apparecchiatura rispetto a molti altri modi comuni di gestire mosche. Forse un commento più generale di fare è che in sostanza tutti gli esperimenti comportamentali in ambienti di laboratorio prevedono sperimentatori far salire o in altri modi, che accudisce gli animali. Nonostante gli sforzi per essere delicata in questo trattamento, è probabile che sia stressante per gli animali. Potrebbe essere opportuno concepire metodi per eliminare questo trattamento, quando possibile, in modo che gli animali possano essere osservati in condizioni leggermente più normali.

The authors have nothing to disclose.

Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni dal National Institute of scienze mediche generali (GM099883 e GM074675) per Eak I finanziatori non hanno avuti ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto. Ringraziamo il popolo dalla nostra officina alla Harvard Medical School per la progettazione dell'apparato comportamentale (contatto: http://mikesmachine.com).

Contributi Autore: ST, BC progettato l'apparato comportamentale. ST progettato e ottimizzato il protocollo sperimentale. ST e BC eseguiti e analizzati gli esperimenti. ST, EAK e BC ha scritto il giornale.