一种新的方法，省去了处理的研究侵略和"失败者"的影响

在果蝇打架的行为模式观察，争取动态，以及相关的学习和记忆都是通过实验条件的影响。这里介绍的协议描述了一种新的程序，完全消除了在实验操作苍蝇。这提高了战斗的动态，并允许形成强大的"失败者"的效果。

果蝇攻击行为是由刻板行为模式的顺序表达（分析^参见图1）。这种复杂的行为是由遗传，荷尔蒙和环境因素的影响。正如在许多生物，以往的战斗体验影响果蝇的战斗策略和以后比赛的结果:失去的斗争增加了失去以后的比赛的可能性，揭示了"失败者"效应可能涉及学习和记忆^2-4。伴随像侵略复杂的社会行为表达的学习和记忆，是敏感的前期试验动物^5,6的处理。许多实验程序被用在不同的实验室研究侵略^7-9，然而，没有常规使用的协议，排除处理苍蝇当前可用。在这里，我们报告说，省去了处理果蝇的一个新的行为装置，使用insteað他们与生俱来的负面geotactic响应移动的动物进入或退出战斗室。在这个协议中，含有食品杯小圆形斗争领域被引入之前苍蝇分成相等的两半通过一个可移动的塑料滑块。苍蝇通过推拉房门及趋地进入他们的家庭隔离小瓶室。在去除塑料滑块，苍蝇可以自由交互。经过指定的时间段，苍蝇是通过滑块进行后续实验再次分离。所有这一切都没有办理个人苍蝇容易。该设备提供了一种新的方法来研究的侵略和相关的学习和记忆，其中包括在飞行战斗"失败者"效应的形成。此外，这种新的通用行为装置可以被用来研究苍蝇等社会行为和应，在一般情况下，是用于调查在基本行为过程经验相关的变化的兴趣。

侵略在动物系统是紧密联系在一起的采集和如食物，领地和配偶的资源控股关联。鉴于这种起着个人健身的重要作用，这是不奇怪的侵略整个动物王国中发展而来的。作为一个自适应的特点是直接受益的个体，较强的学习和记忆组件与侵略有关 。在对社会地位的竞争，以往的战斗体验影响了后来的比赛结果。在一般情况下，以前输球阅历的增加，​​并赢得经验减少，失去以后的比赛的可能性（被称为"输家"和"赢家"的影响）。 "失败者"的影响已经在广泛的物种中观察到，一些报告表明，这些都可以持续数天，而"赢家"的影响通常是持续时间较短^2,10,11的。

攻击行为的第一次报告在果蝇（D. ampelophila）是由斯特蒂文特于1915年在涉及性别认同和性别选择¹²纸。半个世纪后的今天，男性的水果更完整的检查飞行侵略所做，所描述的大多数在果蝇打架观察到的行为模式。这些实验主要是进行了小团体的男性和女性的苍蝇观察到小时^，13-15。近来，通过加入强大的遗传工具，二进单一性别的战斗的设置和观测，D。更短的时间果蝇已成为侵略^1,16的生物学研究的重要模式系统。同性对雄性和雌性果蝇的打架分析表明，侵略涉及刻板的行为模式，从一个到另一个在统计学上可靠的方式^1,17过渡。一些观察到的行为模式是性别特异性，而其他人在战斗观察S在男女双方。男打架去更高强度级别比女性打架，结果有明确的"赢家"和"输家"的主导地位关系的形成。目前，许多实验室已经开始调查了生化^18，神经^7,19-21，和遗传²²基础侵略。不幸的是，一元分析的研究深入了解拼动力学和的形成和维持支配关系是有问题的，由于使用的实验程序在不同实验室的多重的。基本上所有的文献中所描述的技术涉及处理苍蝇和操纵，导入到舞台^19,23,24和行为实验^3,4中转移出来的苍蝇的竞技场。轻柔抽吸是操纵苍蝇^3,4,23-25 ​​最常见的方式，但冷或CO ₂麻醉也使用^9,26，即使previous研究已经报告说，这些程序都有飞的行为^27,28有害影响。持续至少24小时的使用任何麻醉剂后，建议尽量减少其对行为的影响^29,30。

苍蝇从以前的战斗经验和修改他们的行为模式的使用在新的情况下，这意味着学习和记忆陪伴，并激动遭遇的后果。在这个意义上，飞打架就像在其中飞得知一个战略工作，然后在随后的遭遇越来越多的时候使用它操作条件反射的学习情况。苍蝇改变自己的战斗策略后主导地位的关系都在打架成立至今，凭借赢家冲刺越来越多，失败者越来越少。经过一段时间的分离的，以往的失败者显示更顺从的行为和非常可能失去2与幼稚FL成对^第二战斗IES或往届获奖者^3,4。然而，由于缺乏一个实验的过程，不包括装卸苍蝇的取得了"失败者"的效果很难详尽的研究。在最近的研究中，我们比较常规用于实验室（吸入和冷麻醉）引入飞进行为室新方法，消除了处理两个实验程序。结果表明，冷麻醉有更大的负面影响侵略不是愿望，但即使抽吸苍蝇减少攻击性的水平。吸入没有，但是，造成伴随侵略的学习和记忆非常显著的影​​响。继相同的协议有两个实验程序（愿望，也没有处理），当苍蝇的处理是从实验过程^5,6消除只观察到一个强大的"失败者"的效果。

理想情况下， 果蝇的侵略在Labo研究ratories应包括苍蝇通常在野外遇到（对资源的争夺，领土保卫和空间来逃脱）环境状况。此外，实验条件应进行优化，以可靠地诱导，观察和解释所检查的行为（尽量减少动物的处理，限制使用_二氧化碳作为麻醉剂，规范的实验程序）。在试图解决大多数或所有这些问题，我们设计了消除处理苍蝇前，中，向他们介绍行为赛场后，新的行为装置。与这些设备中，蝇使用其固有负趋地性，以被移动，并转移进和移出的斗争​​腔室。通过消除处理苍蝇，该协议的目的是:（1）降低个体之间的变异性的行为; （二）减少所需的时间苍蝇相互作用并产生清晰显性关系（男性）; （三）可靠地诱发足够强大behavio拉尔发生变化，允许组建"失败者"的效果。

本协议描述一个新的实验设备和一步一步的过程来分析的侵略，并允许在D.强烈的"失败者"效应的形成果蝇。我们期望这一行为装置，可以很容易地适用于通过果蝇表现出其他社会行为的研究。

注:以下是实验性的协议，我们用它来 ​​允许可靠触发侵略对雄性果蝇之间（果蝇）的一步一步的说明。这个过程导致的"失败者"效应的形成。使用该协议，一个短期的"胜利者"效果也已被最近报道^5,6-，图1示出了行为实验的时间线。

图1.时间线侵略的实验。第1天，后期雄蜂蛹（当翅膀变成黑色）被隔离在新配制的隔离小瓶。在新兴的成人后的5当日4日龄雄性果蝇麻醉与CO ₂和涂上不同的颜色标识。第7天，食品杯和战斗室是准备设立的行为实验。两个6-7日龄成年男性被装入室，并能互动。 请点击此处查看该图的放大版本。

1.第一天:蛹的社会隔离

1. 提高，在25℃，50％相对湿度保持苍蝇股环境控制12小时光照/ 12小时黑暗周期的孵化器。
2. 准备隔离瓶:热鲜飞食品，直到融化。使用巴斯德吸管，转移大约的熔化飞食品1.5 ml的成单空玻璃试管（1.6×10厘米）。让食物凝固。
3. 隔离蛹:用细的画笔，轻轻地从股票瓶中取出后期雄蛹（当翅膀变成黑色），并把它放在一个新鲜烹制的食品含有试管的一侧。关闭隔离小瓶棉（ 图2）。
4. 含有蛹到12小时光照/ 12小时黑暗培养箱中在25℃和相对湿度50％放置隔离小瓶中。

图2.社会隔离，一个后期男性蛹被放置在侧上新鲜制备的隔离管中。含蛹隔离瓶放置在12小时光照/ 12小时黑暗的孵化器在25℃，相对湿度50％。 请点击此处查看该图的放大版本。

2.第5天:绘画蝇的个人识别目的

1. 用4日龄雄性苍蝇和现有的行为实验2天执行此步骤在第5天，以减少_的 CO 2麻醉的负面影响。
2. 麻醉蝇用CO _2。
3. 用细牙签，放置一个小点上胸部丙烯酸涂料。避免将油漆的头，翅膀，腹部或腿部（ 图3）。
4. 让油漆干燥大约10秒钟，然后轻轻地传回苍蝇到原来孤立的小瓶。
5. 返回隔离小瓶于12小时光照/ 12小时黑暗培养箱中在25℃和相对湿度50％。

图3.个体识别。麻醉带有CO _2，一小滴丙烯酸漆飞后涂抹在胸部。对于个体识别的目的，不同的颜色时（白色和蓝色在这里）。请参阅以下有关使用_二氧化碳在这一步的讨论。 请点击此处查看本figu的放大版本。回覆。

3，第7天:准备设备

1. 准备食物杯:
   1. 热火新鲜飞食品，直到它融化。
   2. 使用巴斯德吸管，转移大约0.8 ml的食物到螺旋盖小瓶（1.5厘米直径，1厘米高）的盖子，并允许冷却。避免气泡。
   3. 通过混合干酵母几滴之水鲜酵母膏。当厚，应用一小滴酵母膏到食品杯表面的用牙签（图4）的中心。

图4.准备食物的杯子。一种食品杯新鲜飞食品准备。食品凝固后，酵母膏点放置在食用杯面的中心。 请速到vIEW这个图的放大版本。

2. 准备个人战斗钱伯斯:
   1. 使用前用水每次彻底清洗装置和个人战斗腔室。干燥，使用前纸巾。
   2. 将食物杯在每个战斗室的中心和地方解决了一滴腻子。
   3. 覆盖战斗腔室与该装置的盖子（图5）。
   4. 放置装置成高湿度环境（60％），在25℃。
   5. 放置装置之上的光源以照亮战斗腔室，并设置一台摄像机用于从上方的记录。

图5.准备个别战斗室中。将新鲜制备的食品杯用酵母膏的表面上的点被固定到洗涤个人音响ghting室。钱伯斯被关闭的两片盖允许插入一个不透明的塑料分隔成单个的战斗室。 请点击此处查看该图的放大版本。

4，第7天:行为实验

1. 执行行为实验用6-7日龄雄蝇。
2. 将塑料分隔成各个作战室。
3. 从隔离管中取出棉塞和定位下方开放孔的管在装置的一侧。
4. 让飞进入战斗室由负趋地性，通常在几秒钟之内。
5. 关闭滑动壁飞已经离开所述管并进入该腔室后。
6. 重复此过程，介绍第二蝇进入战斗室的设备的另一端。
7. 放置装置背面被照明videotapiNG的位置。
8. 开始录像并取下塑料分隔，让苍蝇进行互动。
   1. 侵略实验:
      1. 在这些实验中，记录打架至少20分钟，以确保强支配关系的形成。
      2. 后所需的时间，停止录像。
      3. 通过反转上述步骤卸下苍蝇战斗室。
      4. 彻底用温和的清洁剂和水每次使用和清洗后清洗行为装置。
   2. 对于"失败者"的试验研究:
      注意:在这些实验中，第一打架被认为是调节阶段和第二打斗作为测试阶段。休息之间的战斗的时间可能有所不同，但10分钟可形成强大的"失败者"的效果。
      1. 按照上述执行的第一次战斗的过程。
      2. 关键的一步:为了诱导的"失败者"的心态，E的​​形成nsure首先打架至少有20分钟长，以建立强大的统治地位的关系。 20分钟后，重新插入塑料分隔成战斗室的苍蝇分离。
      3. 经过10分钟休息时间，轻轻地撕下塑料分隔，让苍蝇进行交互的第二战。
      4. 在第二个20分钟战斗结束，停止录像。
      5. 删除苍蝇作为上述行为室。
      6. 再次，彻底清洁行为装置。

5.行为分析

1. 传输影片
   1. 连接照相机到计算机。
   2. 转换苍蝇.MTS为.mov格式的​​苍蝇，并加入电影剪辑在一起，使用的视频转换软件，并选择"加入所选的剪辑"。
   3. 观察和分析每部电影与视频阅读器软件。
2. 计分行为
   注:这可以手动执行，我们荷兰国际集团的行为分析程序软件（如果可用）。下图描述了一个"失败者"的效果可能的人工分析。
   1. 得分苍蝇上的食物杯之间的第一次遭遇的时间（遭遇是对苍蝇至少持续2秒之间的相互作用）和外观第一刺的时间（一种行为模式，其中一个飞升至高它的后腿和捕捉下来，并试图抓住对手）。随后，比分延迟弓步（首先遇到的与第一弓步之间的间隔）。
   2. 在战斗中遭遇数和箭步蹲的总数。
      注意:如果需要，也可以得分等行为模式，如翼的威胁，拳击，击剑，撤退或遇到的第一个冲刺前的数字，例如。
   3. 分数建立霸主地位（第一次遇到，当一只苍蝇务虚连续三次断食杯前后的时间之间的时间的时间呃接收弓步）。注意这飞是赢家，哪些战斗的失败者。
3. 计算一个"失败者"的影响
   1. 划分战斗在前面的失败者失去^第二次战斗（失败者的损失:LL）的数量由打架的总数，由100所获得的比例代表"失败者"的效果倍增:
      [（＃苍蝇LL）/（＃总拼）]×100
   2. 使用卡方检验来比较"失败者"效应是否是从50％的预期值统计学差异。

本节介绍行为腔室的设计和一组典型的按照以上测定侵略和的"失败者"效应的形成描述的协议行为实验的分析。还示出的其他行为的样品，可以使用该装置来测量。

图6示出了新装置的示意图。该装置由三个圆筒形孔（尺寸:22.86毫米直径17毫米的高度），这些战斗的腔室。两片盖关闭顶部的战斗室和允许插入的薄不透明的塑料分频器，分割室分成相等的两部分。在装置的每一侧，具有三个孔（15.88毫米直径）滑动壁允许装载苍蝇进战斗腔室通过直接负趋地性，从他们的隔离小瓶中。苍蝇后进入战斗室，滑动墙壁是用d可关闭的所有室的两侧。在这一点上，两个苍蝇斗争领域内，但不能给分频器相互作用所致。通过除去这些，苍蝇可自由相互作用和随后的行为模式可以被观察和记录。

侵略的实验:对野生型CS的男性在38战斗进行。不同的行为参数进行评分，而苍蝇是在食物的杯子，打架的动态进行分析（ 表1）。在一个20分钟的时间段，观察中的24相遇（果蝇之间简短会议），54弓步（较高强度战斗的指标）的平均，与第一刺通常^第 2次相遇期间输送。平均而言， ^第 1次相遇， ^第 1次弓步，建立主导地位的时候，看到记录开始后2,4和8分。在大多数情况下，战斗的最后12分钟由高强度ENCO重复序列unters与下属的动物接近，被攻击和撤退，加强支配地位或每个动物的柔顺状态。

"失败者"的效果的实验:在为了寻找一个"失败者"效应的形成，在20分钟时间21 ¹日的战斗进行了对野生型CS的男性之间。腔室滑动分频器然后插入到苍蝇分离。 10分钟后， ^第 2次20分钟的战斗是:（a）以前的输家和赢家熟悉或（b）以前的输家和赢家不熟悉这些分析与上述（图7）之间进行。在这两种情况下，20以前的失败者失去了他们的^第二次战斗（95.5％），显示出强大的"失败者"的效果。战斗的结果进行了比较，以50-50与双尾卡方分析和高度显著"失败者"效果的预期值被发现。其他行为的改变失去个人观察^第 1次2间和^次战斗伴随的"失败者"的效果⁵的形成。

除侵略其他行为可以研究在装置:为了说明，求偶和运动进行实验（T 能够2）。求爱，雄性和雌性果蝇被负趋地性装入行为腔室，除法除去和行为求偶型态进行评分。 34进行实验和延迟至法院（= 1号相遇和第一求偶行为之间的时间7秒）和交配（第1相遇和交配= 4分之间的时间）进行了分析。只有2男没有在过程中观察的15分钟时间交配成功。的求偶活力指数（的，男性花费在15分钟内，在第一求偶行为模式后拉拢雌性时间部分）中的得分，在75％（见表2）。对于运动无论是罪GLE飞或群10苍蝇引入室和中线交叉时5分钟的总数进行计数。单蝇交叉平均73倍的腔室的中线在5分钟内，而个别苍蝇组交叉平均45次/ 5分钟（表2）的中线。这一下降观察到苍蝇成群可以提供每飞和他们花费相互交融而不是探索境内的时间中减少的空间来解释。

行为室的图6.图示。该装置的（A）的侧视图。新的装置是由三个独立的部分:（a）含有三个人战腔室的塑料块; （b）与三个孔（15.88毫米直径）在每两个滑动壁;和（c）的两件式盖子的顶部。 （B）顶部鉴于装置的。塑料块（一）的尺寸是36.83毫米×123.19毫米。每个单独的战斗室的直径为22.86毫米和17毫米的高度。在侧孔，使苍蝇的装载有一个直径15.88毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图7.一个强大的"失败者"效应的形成，一个显著"失败者"的效果（个失败者认为失去2 ^次战斗的时候前面的失败者配对观察（一）熟悉的获奖者（N = 21，*** P <0.0001）或（b）为他们的^第二次战斗陌生的获奖者（N = 21，*** P <0.0001）（失:95.5％，赢:4.5％，无平）PL轻松点击此处查看该图的放大版本。

表1:对雄性苍蝇之间激动相互作用的动力学平均值±SEM计算每个参数记为侵略性的指标。遭遇和弓步的总数，以及数交锋前一日弓步进行评分。第一次相遇，第一个弓步和优势，而延迟的时间，以弓步和主导权都在秒±SEM（N> 34）。

表2:对求偶行为和运动分析平均值±标准差计算的延迟告上法庭，并交配（以秒为单位）。求爱活力指数（以％的时间花在第一求偶炫耀求偶后）进行评分后，男性和女性分别装入行为室负趋地（N> 32）。运动，当单苍蝇或10苍蝇组分别装入腔室，被赢得了在5分钟内（48和20）计数中线交叉的总数。

利用果蝇以其强大的遗传方式作为模式生物的侵略研究的新时代开始了十几年前在可靠的战斗行为，可以单对苍蝇^1,7所获得的引进新的实验舞台上^{， 8,17,19。}这些领域包括所需的资源（食物杯，潜在配偶）和失败者的空间飞行，以退为进。当用这些领域获得的结果，加入到约果蝇拼行为以前的知识， 果蝇确立为用于检查像侵略一个复杂的行为非常理想的模型系统，用于在许多实验室。得到的总结结果表明:（1）苍蝇展览侵略对粮食资源，获得队友或者防御领土^14,15的竞争; （二）打架都是由一系列连续的刻板行为模式^1; （C）雄性和雌性果蝇在同性配对打（一些模式是男性具体，有些是女性专用的，有些是由男女双方共同^）17; （四）只有男性打架去高强度的水平，并导致有明确«赢家»和«输家»等级关系的形成苍蝇^17; （五）单基因的性别决定等级的无果而终 ，确定是否苍蝇争取像男性或女性¹⁶及（f）多重荷尔蒙物质，包括胺和肽苍蝇^7,8,19,20影响侵略果实。

这里，一个新颖的方法描述了用于研究的果蝇侵略其中苍蝇在实验过程中的处理被消除。这提供了实验方案一显著的改善，因为所有的行为测量是提高^5,6，有关行为的新信息已经获得了与学习和记忆，伴随着雄蝇的战斗有很大的提高。为了说明这一点，只有两个以前的研究报告说，在这个模型系统^3,4"失败者"效应的形成。在这两种，比在此协议中描述的那些较大的腔室被使用，苍蝇通过抽吸被转移进入和离开战斗的竞技场，和更长的战斗时间和间隔时间之间的战斗是必要的，以产生清晰的"失败者"的效果。我们最近的研究表明，消除从实验协议处理，对D的之间的明确主导地位的关系果蝇雄蝇仅20分钟的互动后观察。这个时间足以在¹日的战斗诱发的战斗策略，这两个苍蝇显著的变化，并可靠地观察在^第二战强"失败者"效应的形成。此外，在第一时间，明确的短期"冠军"效应也被在^第二观察打架^5,6。

成功利用此协议，一些关键点需要注意。为了诱导和观察，我们建议使用6-7日龄雄蝇已在社会孤立，因为后期蛹期举行稳健进取的行为模式。在一般情况下，资源是拥有可用性愿意争用（食物，配偶）是非常需要的，才能获得强大的战斗力行为，建立主导地位的关系。在该协议中，苍蝇是画使用_二氧化碳麻醉后，这可能是关注我们最近发表的研究报告显示，麻醉苍蝇严重干扰了随后的行为^5。可能的方法来避免麻醉可能是不画动物，如果它不是重要跟踪个人。如果画是必要的，但是，麻醉，应使用48小时，将动物用于实验，或替代方法来确定前个人也可能被用于^31。为了诱导强"输家"和"赢家"的影响，至关重要的是，苍蝇建立和维持在第一战斗一家独大的关系。在协议这里介绍，采用野生型菌株CS在25°C，互动的20分钟足以产生明显的"赢家"和"输家"，观察变化，无论是个人的斗争策略。在不同温度高于25℃或与其它基因型的CS比进行的实验，然而，平均时间，用于建立一个健壮支配关系可能会有所不同。因此，战斗期间应该通过执行组初步实验来调整。最后，如​​何对苍蝇他们的第一次战斗后，分开也许是在维护战斗结果的记忆是重要的。这可能是重要的，以减少设备的运动以及为了引入塑料分频器期间要温柔最小化动物的干扰。

该装置的设计和两件式盖允许分离的行为腔室分成两个相等的隔室，可以很容易地首先战斗后分离两个苍蝇和在^第 2次的战斗引入新的对手。另外，如表 2所示，与实验协议的小的调整，相同的装置可用于研究求爱，运动或实际上最果蝇行为在什么应为实验动物压力较小的条件。上的过程可能的进一步的改进可能引入一些形式的恒温控制到装置（压电元件或线圈中循环温度控制的流体），以允许容易地使用的温度敏感的试剂（shibire ^TS1，dTRPA1信道）的。

综上所述，我们设计，提供了一个新的战略，侵略我研究的新型装置ñ果蝇中，处理苍蝇之前，期间和之后的实验被淘汰。所有行为的措施相比，处理苍蝇其他几种常用的方法与新设备得到改善。也许一个更普遍的意见要提出的是，基本上所有的行为实验在实验室的环境中参与实验者拿起或以其他方式处理的动物。尽管努力温柔在此处理，这很可能是压力为动物。它可能是有益的设计方法来消除此处理只要有可能，从而使动物可能稍微更正常的条件下进行观察。

The authors have nothing to disclose.

这项研究是由普通医学科学研究所（GM099883和GM074675）的赠款，以EAK的资助者在研究设计，数据收集和分析，发布决定，或准备的手稿没有作用的支持。我们感谢的人从我们在哈佛医学院加工车间的行为设备的设计（联系人:http://mikesmachine.com）。

作者的贡献:ST，BC设计的行为装置。 ST设计和优化实验方案。 ST和BC进行分析实验。 ST，EAK和BC写文章。