Isolamento di cellule umane endoteliali linfatico da Multi-parametro fluorescenza-attivato cell sorting

L'obiettivo di questo protocollo è quello di isolare le cellule endoteliali linfatiche rivestono i vasi cisti-come malformazione linfatica umani e prepuzi utilizzando cellule fluorescenza attivate (FACS). Coltura delle cellule e successiva espansione di queste cellule permette un nuovo livello di sofisticazione sperimentale per studi genetici, proteomica, funzionali e differenziazione cellulare.

Disturbi del sistema linfatico, come linfedema primario, malformazioni linfatiche e tumori linfatici sono condizioni rare che causano una significativa morbidità, ma poco si sa sulla loro biologia. Isolando cellule altamente puri umane endoteliali linfatiche (LECs) dal tessuto malato e sano faciliterebbe studi dell'endotelio linfatico a livello genetico, molecolare e cellulare. Si prevede che queste indagini possono rivelare bersagli per nuove terapie che possono cambiare la gestione clinica di queste condizioni. Un protocollo che descrive l'isolamento di umana prepuzio LEC e malformazioni linfatiche linfatici cellule endoteliali (LM LECs) è presentato. Per ottenere un unico tessuto sospensione cellulare è stata tritata e enzimaticamente trattati con dispasi II e collagenasi II. La sospensione risultante singola cellula fu poi etichettata con anticorpi anti-cluster di differenziazione (CD) marker CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) e PODOPLANIN. Staicellule vitali ned state ordinate su un cell sorter fluorescente attivate (FACS) per separare la popolazione CD34 ^Basso CD31 ^Pos VEGFR-3 ^Pos PODOPLANIN ^Pos LM LEC da altre cellule endoteliali e non endoteliali. I LM LEC ordinati erano colti e ampliato su palloni fibronectina rivestite per uso ulteriore sperimentale.

Una delle principali funzioni del sistema vascolare linfatico è di assorbire la linfa, un fluido interstiziale eccesso contenente lipidi, proteine ​​e componenti cellulari, e condurre al sistema venoso del sangue. Una rete di capillari linfatici dirige linfa ai linfonodi dove viene proiettato per la presenza di antigeni estranei, un processo importante nella sorveglianza e la diffusione delle cellule bianche del sangue per neutralizzare antigeni estranei immunitario.

Il sistema linfatico unidirezionale inizia nei tessuti con capillare linfatica iniziale, una struttura unica con un singolo strato discontinuo di cellule endoteliali piatte a parete sottile con giunzioni di cellule specializzate che consentono entrata linfatico ^1,2. Questi capillari sono attaccati alla matrice del tessuto connettivo vicina Via ancoraggio filamenti per prevenire il collasso nave in presenza di un aumento della pressione interstiziale ^3. I capillari linfatici iniziali vuoti nella raccolta capillari linfaticiche fondersi in vasi linfatici o vene più grandi. Rispetto alla prima vasi capillari linfatici, raccogliendo i vasi linfatici hanno pareti dei vasi più spessi, valvole linfatiche appaiati e sono racchiusi da una membrana basale discontinua in cui alcune cellule muscolari lisce sono incorporati ^4. Apertura coordinata e chiusura delle valvole linfatiche e di contrazione delle cellule muscolari lisce facilita flusso della linfa ^3. Negli esseri umani, le vene linfatiche provenienti da varie regioni del corpo si uniscono per formare tronchi linfatici che si fondono per formare due dotti linfatici: il dotto toracico e il diritto dotto linfatico. Il dotto toracico drena la linfa dal lato sinistro del corpo e dalla destra sotto il petto mentre la destra linfatica drena condotto linfa braccio destro e sul lato destro della testa, collo e torace. Entrambi i condotti conducono linfa nelle vene succlavia nel collo ^5.

Disturbi del sistema linfatico sono ampiamente raggruppate in acquisito unand congenite (Tabella 1). Esempi di condizioni acquisite sono linfangite e linfedema secondario. Linfangite è un'infiammazione di un vaso linfatico a causa di un'infezione batterica. I vasi linfatici colpiti si dilatano e si riempiono di essudato contenente cellule polimorfonucleati. In pelle, questi vasi linfatici sono visibili come rosso, striature sottocutaneo doloroso spesso accompagnata da allargamento nodo associato drenante linfatico (linfadenite) ^6. Linfedema secondario nasce come conseguenza di un danno o ostruzione al linfatica nave o linfonodo ostruzione. Questo porta a gonfiore cronica progressiva a causa di accumulo di linfa distale al danno o ostruzione. Nei paesi sviluppati, linfedema secondario è più comunemente associato con malignità dove i tumori metastatizzanti ostruiscono i vasi linfatici o linfonodi regionali, o come conseguenza di una terapia anti-cancro dopo la rimozione chirurgica dei linfonodi, la fibrosi post-irradiazione e Throm post-infiammatorieBosis e cicatrici ^7. In altre parti del mondo, linfedema secondario può essere secondaria ad ostruzione linfatica causata da vermi parassiti come Wuchereria bancrofti ^6.

Tabella 1. Panoramica dei disturbi del sistema vascolare linfatico.

Disturbi congeniti del sistema linfatico sono primaria (idiopatica) linfedema pensato per essere causata da mutazioni genetiche, linfangectasia e anomalie del ^8,9 sistema linfatico. Linfedema primario può essere sporadica presumibilmente causata da mutazioni de novo o ereditato. Disturbi linfatico può anche essere isolate o comprendere parte di una sindrome più generalizzata ^10. Nella popolazione pediatrica, il 97% della linfaedema è sporadica con anomalie nella struttura dei vasi linfatici che compromettono linfa regionale drenaggio ^11. Malattia Milroy è un esempio di linfedema primario causata dalla mutazione nel VEGFR-3 gene evidente alla nascita o subito dopo ^{il 12.} Sebbene stato per lo più familiare, la malattia Milroy può anche essere identificata nei bambini senza storia familiare di malattia Milroy ^32. La gravità di qualsiasi linfedema dipende dalla quantità di produzione di linfa e capacità di trasporto linfatico ritorna circolazione venosa ^6.

Sulla base di presentazione clinica e in situ proliferazione delle cellule endoteliali, anomalie del sistema linfatico sono classificati come tumori linfatici o malformazioni linfatiche ^13. Kaposiforme linfangiomatosi è un esempio di un tumore LEC ^14. Malformazioni linfatiche sono pensati per sorgere durante lo sviluppo embrionale e crescere in proporzione al bambino ^15,16. Raramente regredisce, ma può Remain asintomatica fino traumi o infezioni precipitati rapida crescita che porta a complicazioni cliniche. La struttura ordinata di rete linfatica e la conduzione della linfa dal tessuto di circolazione venosa sopra descritto è perturbato in malformazioni linfatiche che consistono in raccolte localizzate di strutture cistiche anormali pieni di liquido linfatico. Mentre non vi è alcuna evidenza clinica o sperimentale che questi vasi cistiche sono connessi alla circolazione linfatica o che contengono valvole linfatici funzionali, la loro identità linfatico è confermato dalla espressione di serie di marcatori di cellule linfatiche, come PODOPLANIN, CD31, linfatico Vaso endoteliale Receptor 1 (LYVE-1), Prospero homeobox proteina 1 (PROX-1) e VEGFR-3 ^15,17,18. Queste strutture cistiche possono essere sia piccole (microcistica) o grande (macrocistiche), ma la maggior parte malformazioni linfatiche contenere sia microcistica e componenti macrocistiche (Figura 1) ^16. Dopo l'intervento chirurgico, injection scleroterapia e / o ablazione con radiofrequenza delle malformazioni linfatiche spesso ripresentarsi.

Figura 1. Morfologia dei vasi linfatici umani e delle malformazioni linfatiche. Normale linfatico umano (A) e vasi linfatici malformative (B e C) etichettati con anticorpi anti PODOPLANIN (etichetta marrone, freccia). Vasi linfatici malformazione umani sono caratterizzati da una marcata dilatazione e notevoli variazioni in termini di dimensioni del lume. Queste strutture cistiche anomalie localizzate possono essere sia piccole (microcistica, *) (B) o grande (macrocistiche, #) (C). La maggior parte delle malformazioni linfatiche contengono sia componenti microcistiche e macrocistiche. Cliccate qui per vedere una versione più grande della figura.

Alcuni ricercatori hanno suggerito che malformazioni linfatiche rappresentano un disturbo dello sviluppo dei vasi linfatici in cui le LEC non hanno un potenziale di crescita anormale, ma invece non sono riusciti a collegarsi alla normale circolazione ^19. Tuttavia, abbiamo trovato che i LEC LM proliferano più velocemente e sono più resistenti all'apoptosi di prepuzio LEC ¹⁵ suggerendo che vi è un difetto primario nella LM LEC. Quando LM LEC vengono impiantate in un modello murino di xenotrapianto, formano strutture che ricordano malformazioni linfatiche ^15. Questo supporta l'ipotesi che malformazioni linfatiche possono essere causati da una o più mutazioni somatiche derivanti LM LEC durante lo sviluppo fetale. Infatti, recenti studi hanno identificato un tale mutazione nel subunità catalitica p110α di (PIK3CA) gene ^20-Kinase Phosphoinositide-3.

Dati i progressi nella tecnologia di sequenziamento del DNA, mutazioni rilevanti cOuld essere più facilmente identificati in isolate LM LEC, guidando gli studi futuri di queste condizioni. L'isolamento di LEC vitali faciliterebbe il confronto tra LEC anormali e normali test quali la migrazione, la proliferazione, la capacità di formatura tubi e la sopravvivenza in risposta alla ridotta disponibilità di nutrienti o agenti pro-apoptotici ^15. Isolati LEC avrebbero ulteriormente ci permettono di eseguire l'espressione genica specifica delle cellule e studi di proteomica, per delineare nuove sottopopolazioni LEC e scoprire nuovi agenti farmacologici adatti per la gestione clinica delle malformazioni linfatiche.

Abbiamo già pubblicato un metodo di isolamento LEC basata sulla separazione magnetica tallone di LEC da prepuzio neonatale e malformazioni linfatiche ^15. Abbiamo segnalato una strategia di separare LEC normali e malati da cellule endoteliali vascolari basate sulla mancanza di espressione CD34, seguita sottoponendo frazione di cellule CD34 ^Neg alla selezione positiva per CD31.Tuttavia, questo metodo è stato ostacolato dalla presenza di cellule non endoteliali residue. Questo era indipendente dalla rimozione dell'epidermide prima successiva digestione tessuto connettivo. Questi contaminanti generalmente proliferavano più rapidamente e quindi alla fine overgrew colture cellulari endoteliali, nonostante i successivi tentativi di ripetere l'isolamento LEC. Infatti, una contaminazione iniziale di cellule non endoteliali a partire da 2% al 5% è sufficiente a sopraffare la popolazione LEC ^15. Questo ci ha spinto ad esplorare metodo delle celle di ordinamento fluorescenza attivata come opzione per migliorare la resa delle cellule LEC e purezza. Inoltre, abbiamo utilizzato multiparametrico smistamento per valorizzare le specificità delle popolazioni LEC, l'aggiunta di VEGFR-3 e PODOPLANIN per i marcatori di selezione per identificare CD34 ^Basso CD31 ^Pos VEGFR-3 ^Pos PODOPLANIN ^Pos LEC.

Il razionale per la selezione di questi indicatori si è basata sulle relazioni che, mentre LEC e vascolare endoteliale nel sangue cells hanno molti marcatori di superficie delle cellule in comune, come CD31, LEC mostrare variazione fenotipica nella loro espressione di CD34, PODOPLANIN e VEGFR-3 celle marcatore di superficie rispetto al sangue vascolare cellule endoteliali ^21-23. CD31 è una glicoproteina transmembrana di 130 kDa noto anche come piastrine molecola di adesione delle cellule endoteliali 1 (PECAM-1). Si è considerato un marcatore di cellule pan-endoteliale poiché è espresso su tutti i tipi di vasi sanguigni e linfatici ^21,24,25. CD34 è di 110-kDa transmembrana glicoproteina presente sulla progenitore più ematopoietiche e le cellule staminali, le cellule endoteliali vascolari e alcuni vasi linfatici ^26.

VEGFR-3, il recettore per la crescita endoteliale vascolare fattori C e D, è inizialmente presente sulle vene del mouse embrione in via di sviluppo, ma a seguito di specifiche linfatico regolato dalla trascrizione SRY legati HMG-box Fattori (SOX) -18, c hicken o valbumin u pstream p romoter t ranscription f attore 2 (COUPTF-II) e PROX-1, VEGFR-3 espressione venosa è perso e si restringe a embrionale LEC ^25,27. PODOPLANIN, un kDa membrana 38 mucoprotein, va osservato, innanzitutto sui vasi linfatici a circa embrionali giorno 11 (~ E11.0) di topo sviluppo embrionale ²⁸ e, mentre è fortemente espressa da microvascolari vasi linfatici, espressione PODOPLANIN da macrocistiche endotelio linfatico malformazioni linfatiche è più variabile ^15. Citometria a flusso esperimenti suggeriscono che almeno alcune cellule endoteliali CD34 ^alta CD31 ^Pos esprimono il marcatore linfatico PODOPLANIN ^29. Anche se una valutazione sistematica delle LYVE-1 e PODOPLANIN colorazione in malformazioni linfatiche umani ha dimostrato che entrambi sono efficaci a macchiare linfatica malformazione endotelio ^30, nei tessuti normali, LYVE-1 è stato segnalato per essere fortemente presente nella linfatico inizialeendotelio capillare ma ridotti, o addirittura assente nella raccolta di endotelio linfatico ^31. Poiché il nostro obiettivo è quello di isolare sia le cellule endoteliali linfatiche iniziali e di raccolta che abbiamo scelto di non usare LYVE-1 come parte della nostra strategia di selezione delle cellule. Infine, la decisione di impiegare questi marcatori era basata sulla disponibilità di anticorpi che vengono utilizzati diagnosticamente per etichettare i vasi linfatici per l'imaging microscopico, una caratteristica che permetta correlazione tra citofluorimetria e studi di immunofluorescenza.

Questo articolo descrive il metodo di digestione dei tessuti, la colorazione delle cellule e le impostazioni necessarie per il successo FACS isolamento di CD34 ^Basso CD31 ^Pos VEGFR-3 ^Pos PODOPLANIN ^Pos LEC così come le cellule endoteliali CD34 ^alta CD31 ^Pos VEGFR-3 ^Pos PODOPLANIN ^Pos dal prepuzio e malformazione linfatica tissue.

Etica dichiarazione: approvazione etica per la raccolta di malformazione e prepuzio tessuti linfatici sono state ottenute dai Comitati Etici di Ricerca Umane presso l'ospedale pediatrico di Reale, Melbourne, Australia. Firmato accordo è stato ricevuto dai genitori dei pazienti prima di un intervento chirurgico. I campioni di tessuto sono stati prelevati da pazienti con diagnosi di LM sottoposti a procedure chirurgiche come parte della loro gestione clinica e pazienti sottoposti a circoncisione elettivo. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida del National Health and Medical Research Council, Australia.

1. Preparazione di sospensione cellulare da prepuzio e linfatico malformazione tessuti

1. Tamponi e preparazione Media.
   1. Preparare completo supporto delle cellule endoteliali utilizzando disponibili in commercio EGM-2 MV Kit pallottola riscaldando EGM-2 media e delicatamente lo scongelamento dei componenti del kit a 37 ° C bagnomaria. In classe II biosicurezza cabinet, in modo asetticoaggiungere ogni componente per i EGM-2 media. Una volta che tutti i componenti sono aggiunti ai media, si riferiscono a questo media come 'mezzi delle cellule endoteliali completo'. Utilizzare sterile 50 ml pipetta per mescolare il contenuto prima dell'uso.
      Nota: Tutti i passi relativi a colture cellulari vengono eseguite in un armadio rischio biologico di classe II. Tutte le soluzioni vengono conservati a 4 ° C secondo le istruzioni del costruttore e vengono riscaldati a temperatura ambiente prima dell'uso. I mezzi completi endoteliali cellulari, tamponi di coltura cellulare e soluzioni enzimatiche sono riscaldati a 37 ° C per 20 minuti prima dell'uso.
   2. Supplemento completo supporto delle cellule endoteliali con 50 ng / ml VEGF-C. Aliquota i mezzi di comunicazione delle cellule endoteliali completato in 50 ml provette sterili e conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso. Il supporto è stabile per almeno 4 settimane se conservato a 4 ° C.
   3. Preparare calcio e magnesio libero tamponata con fosfato salino (PBS) sciogliendo 8,752 g di NaCl, 1.416 g Na ₂ HPO ₄ .2H ₂ O e0.395 g KH ₂ PO ₄ in 1000 ml di acqua. Regolare il pH a 7,4. Filtro sterilizzare PBS con 0,22 micron filtro e conservare a 4 ° C. Prima dell'uso aggiungere soluzione antibiotica / antimicotico (usato a 1: 100).
   4. Per preparare fibronectina umana, sciogliere 1 mg di fibronectina in 10 ml di acqua sterile. Conservare soluzione ricostituita in aliquote di 100 microlitri a -20 ° C. Il giorno di utilizzo aggiungere 10 ml di PBS sterile per 100 ml di fibronectina aliquota (per ottenere una concentrazione finale di lavoro di 10 mg / ml).
   5. Per i media enzimatici, preparare una soluzione contenente 0,04% dispasi II, 0,25% Collagenase II e 0,01% DNase I in PBS sterile. Innanzitutto, pesare dispasi e collagenasi, posto in una provetta sterile da 50 ml, aggiungere il volume di PBS e incubare per 30 minuti con agitazione a 37 ° C per sciogliere. Una volta sciolto, sterilizzare filtro (0,22 micron filtro) soluzione dispasi / collagenasi in cappa di biosicurezza. Asetticamente aggiungere la DNasi I. Conservare la soluzione enzimatica a 37 ° C fino autilizzare.
      NOTA: DNase I è un reagente grado di coltura cellulare commerciale disponibile sotto forma di polvere liofilizzata sterile.

2. Preparazione di sospensione cellulare da prepuzio e linfatiche Malformazioni

1. Pesare un tubo da 50 ml contenente 10 ml di / 2% soluzione antimicotico antibiotico DMEM. Questo tubo verrà utilizzato per la raccolta dei tessuti.
2. Dopo la rimozione chirurgica della malformazione linfatica e tessuti prepuzio, aggiungere asetticamente campione di tessuto al tubo e trasferimento su ghiaccio al laboratorio di coltura cellulare.
3. Pesare il tubo contenente il tessuto e calcolare il peso dei tessuti. Utilizzare questo peso per calcolare il volume di soluzione enzimatica necessario per digerire il tessuto.
4. In un armadio biosicurezza di classe II, utilizzare pinzetta sterile per trasferire il tessuto e dei media in un piatto di coltura di tessuti a 100 mm. Usare le forbici sterili per tritare finemente il tessuto in ~ 1 mm ³ pezzi.
5. Tessuto tritato Transfer mescolato con i media into un tubo da 50 ml contenente ulteriori 10 ml di soluzione sterile DMEM / 2% di soluzione antimicotico antibiotico. Miscelare per inversione di risospendere il tessuto. Centrifugare il campione a 300 xg per 5 min.
6. Rimuovere il surnatante. Sulla base del peso del tessuto, aggiungere 1 ml di pre-riscaldato (37 ° C) collagenasi II / soluzione di digestione DNasi I / dispasi II per 100 mg di tessuto tritato. Generalmente, utilizzare 10 ml di soluzione enzimatica per circa 1 g di tessuto tritato.
7. Incubare il tessuto in un 37 ° C incubatore per 20-90 minuti con costante agitazione a 200 rpm. Alla fine di questo periodo, assicurarsi che quasi tutto il tessuto viene digerito in frammenti sottili.
   NOTA: esposizione delle cellule alla collagenasi e dispasi al momento di isolamento dal primario tessuti influenze sopravvivenza cellulare. Abbiamo scoperto che la maggior parte dei campioni empiricamente prepuzio neonatale ottimale richiedono 20-30 min di digestione, mentre i campioni fibrotiche malformazioni linfatiche possono richiedere 60-90 min di digestione. LM resa LECs sono influenzati dalla quantità di fibrosi presente, più tessuto fibroso cedevole meno cellule, forse a causa di effetti deleteri di una prolungata esposizione a collagenasi II e dispasi II.
8. Dopo la digestione, trasferire il tubo per la biosicurezza e passare la soluzione del tessuto digerito attraverso un colino 70 micron inserito in una provetta sterile da 50 ml. Utilizzando 3 ml della siringa a pistone con pistone di gomma, macinare il tessuto rimanente prima sono osservate solo piccole tracce di matrice extracellulare.
9. Lavare il filtro cella con un volume di cellule endoteliali supporto equivalente al volume di dissociare mezzo dell'enzima di recuperare cellule incollati al setaccio e per disattivare gli enzimi. Ad esempio, per 2 ml di dissociare medio enzima per digerire il tessuto tritato, aggiungere 2 ml di mezzo di cellule endoteliali per inattivare gli enzimi.
10. Centrifugare la soluzione di cellule a 300 xg per 5 minuti e aspirare il surnatante. R> e-sospendere le cellule in 10 ml di PBS. Cellule centrifugare a 300 xgper 5 minuti, rimuovere il surnatante quindi ripetere lavaggio cella due volte. > Risospendere il pellet cellulare in 20 ml di terreno cellule endoteliali. Contare le cellule utilizzando trypan blue poi seme 2 x 10> ⁶ cellule in 150 centimetri> ² beuta pre-rivestite con fibronectina in un volume finale di 20 ml di mezzo di cellule endoteliali. Coltura a 37 ° C in 5% CO> ₂ in incubatore umidificato dell'aria.>
    NOTA: Si prevede che il 75% -90% delle cellule nucleate sopravvivere digestione tessuto come stimato dalla trypan blue. La conta delle cellule iniziale riflette tutte le cellule nucleate della sospensione cellulare (cioè cheratinociti, leucociti, macrofagi, cellule del tessuto connettivo e le cellule dei vasi sanguigni). La conta delle cellule di 5-7 giorni riflette le cellule che hanno attaccato, sopravvissuti e proliferato durante coltura cellulare. Rivestimento tessuto fiasche di coltura con fibronectina migliora anche la successiva LEC e la sopravvivenza LM LEC.
11. Dopo incubazione durante la notte, lavare le cellule via non legato a tre lavaggi con PSoluzione BS / 1% antibiotico-antimicotico e aggiungere mezzo delle cellule endoteliali fresco. Effettuare tre lavaggi per rimuovere efficacemente le cellule non legato e globuli rossi presenti nel pallone. Modificare i media ogni due giorni. Le cellule saranno ~ 80% confluenti dopo 5-7 giorni.

3. Anticorpo colorazione delle cellule endoteliali per linfatico marcatori di cellule superficiali per Citometria a Flusso

1. Dopo che le cellule hanno raggiunto l'80% di confluenza, medio aspirare e cellule risciacquo con PBS.
2. Staccare cellule aderenti incubando le cellule con 7 ml di soluzione di distacco cellulare come Accutase ogni 150 cm ² beuta per 5-7 minuti a 37 ° C.
3. Celle di raccolta indipendente, inattivano la soluzione distacco cellulare aggiungendo 3 volumi di medie cellule endoteliali e trasferire la sospensione cellulare in una nuova provetta sterile.
4. Centrifugare le cellule a 300 xg per 5 min.
5. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 5 ml di PBS. Cellule centrifugare a 300 xg per 5 minuti, togliere la supernatant quindi ripetere lavaggio delle cellule. Risospendere le cellule in 5 ml di PBS.
6. Contare il numero di cellule vitali. Miscelare 10 ml di sospensione cellulare con 90 ml di 0,4% trypan blu. Trasferire 10 ml di questa sospensione per emocitometro per il conteggio.
   NOTA: La quantità di cellule finale dipenderà dalle dimensioni campione trattato. La quantità di cellule usuale per 150 gamme cm ² boccetta da 7 x 10 ^5-1,2 x 10 ⁶ di cellule vitali.
7. Preparare le soluzioni di anticorpi per la colorazione delle cellule.
   NOTA: Le seguenti diluizioni sono stati titolati per la colorazione 1 x 10 ⁶ in un volume di 100 microlitri di colorazione.
   1. Diluire PE topo coniugato anti- umano VEGFR-3 (01:50); PE-Cy7 topo coniugato contro CD34 umano coniugato (1: 200); APC-coniugato topo CD31 anticorpi umani (1: 100) e Alexa rat 488-coniugato anticorpi umani PODOPLANIN (1: 200) in volume totale di 100 microlitri sterile 5% FBS soluzione / PBS per campione di tessuto. Dopo la preparazione disoluzione di anticorpi, di tenere in ghiaccio fino al momento dell'uso. Allo stesso modo preparare miscela di anticorpi controllo isotipico diluito per facilitare l'impostazione di citometria a flusso cancelli.
8. Per ridurre i legami non specifici degli anticorpi, le cellule centrifugare a 300 xg per 2 minuti, rimuovere il surnatante quindi sospendere le cellule in 100 microlitri sterile 5% FBS / soluzione PBS per campione da colorare. Incubare le cellule in ghiaccio per 20 min a 4 ° C.
9. Cellule centrifugare a 300 xg per 5 minuti, rimuovere il surnatante quindi risospendere cellule del cocktail anticorpo coniugato. Macchiare Anche una piccola aliquota di cellule (1 x 10 ⁵⁾ in 100 microlitri miscela di anticorpi controllo isotipico. Incubare le cellule in ghiaccio per 20 min.
10. Per rimuovere l'anticorpo non legato, aggiungere 2 ml di 2% FBS soluzione / PBS e centrifugare le cellule a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante e ripetere il lavaggio.
11. Risospendere il pellet di cellule per il controllo isotipico e il campione anticorpo macchiato da ordinare in 300 ml di 0,5 mg / ml di propidio ioDide / 2% soluzione FBS / PBS. Mettere tubi sul ghiaccio fino ordinamento.

4. cella Ordinamento

1. Utilizzare i seguenti materiali per impostare lo strumento; perle di allineamento come particelle disponibili in commercio fluorescenti, salino basato liquido guaina tampone fosfato e perline di ritardo goccia, come perline fluorescenti Accudrop.
2. Isolare i LEC umane purificate su uno strumento di fluorescenza-attivato multiparametrico separazione delle cellule. Impostare lo strumento e allineare secondo le raccomandazioni del fabbricante. Inoltre, eseguire singoli comandi compensazione macchia con ogni sorta per generare la matrice di compensazione ed eliminare così sostanziale spurgo attraverso dell'emissione di fluorocromi quale PE nel canale PE-Cy.
   NOTA: una percentuale maggiore dei FACS cellule ordinati sopravvivere all'isolamento se viene utilizzato un ugello 100 micron e le cellule sono allineati in mezzo delle cellule endoteliali.

5. Colture Cellulari Posta FACS Ordinaing

1. Dopo smistamento, cellule centrifugare a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 5-10 ml di supporti (a seconda del pallone utilizzato per inseminare la cella). Se meno di 50.000 cellule sono ordinati, le cellule sono coltivate in fibronectina rivestite a 25 ^cm2 pallone.
2. Altrimenti coltura le cellule nel 75 cm ² beuta fibronectina rivestite a 37 ° C in un CO _2, aria incubatore umidificato 5%. Cambiare media dopo 2 giorni.
   NOTA: supporti cellulare viene cambiato ogni secondo giorno perché prolungando il tempo tra le modifiche di supporto sembra favorire la sopravvivenza delle cellule non endoteliali. Abbiamo convalidare la linfatica fenotipo delle cellule endoteliali con rilevazione immunoistochimica di marcatori: PROX-1, VEGFR-3, Podoplanin, CD34 e CD31 quando le cellule sono di prima divisione per un'ulteriore espansione ^15.

Dopo la digestione del tessuto iniziale, dopo 24 ore di coltura di campioni non frazionate, distinte colonie di cellule endoteliali può essere osservato (Figura 2A) unitamente a cellule fibroblasto-simili e le cellule muscolari lisce. A seguito di selezione e dopo 24 ore di coltura cellulare, le CD34 ^Bassa CD31 ^Pos VEGFR-3 celle ^Pos Podoplanin ^Pos attaccare e mostra morfologia tipica di ciottoli (Figura 2B e C). Utilizzando il metodo FACS sopra descritto, siamo in grado di purificare le cellule fino al 99,8% di purezza e distinguerli da CD34 ^alta CD31 ^Pos VEGFR-3 cellule endoteliali ^Pos Podoplanin ^Pos. Risultati rappresentativi di gating strategia e selezione sono presentati nella figura 3. Questo ha risolto i problemi sperimentati quando si utilizza il metodo di isolamento magnetico-tallone. Fino ad oggi, abbiamo diversi passaggi queste cellule fino a passaggio 13. Dopo questo passaggio, la LM LEC e prepuzio LECs iniziano a senescenza, accompagnati da cambiamenti morfologici e la divisione cellulare ridotta.

Figura 2. Foreskin LEC e LM-LEC. Ventiquattro ore dopo la digestione enzimatica, le cellule non smistata contengono sia endoteliale (freccia) e le cellule non endoteliali (A). Dopo aver isolato cellule CD34 ^Bassa CD31 ^Pos VEGFR-3 ^Pos Podoplanin ^Pos FACS, prepuzio LEC (B) e LM-LEC (C) sono privi di cellule non endoteliali e mantenere ciottoli morfologia. Cliccate qui per vedere una versione più grande della figura .

Figura 3. cella Fluorescence-activated ordinamento strategie di gating per l'ordinamento delle cellule dei vasi e delle cellule endoteliali linfatiches. (A) cellule vive sono prima gated su CD34 e CD31 espressione, seguita da endoteliale linfatica (C), le cellule VEGFR-3 e PODOPLANIN gating di tipo vascolare (B) e, rispettivamente. (D) Re-analisi ordinati CD34 ^alta CD31 ^Pos VEGFR-3 ^Pos PODOPLANIN ^Pos cellule spettacoli> 98% vascolare fenotipo delle cellule endoteliali. (E), le cellule LEC ordinati su CD34 ^Basso CD31 ^Pos VEGFR-3 ^Pos PODOPLANIN ^Pos fenotipo sono> 98%. Cliccate qui per vedere una versione più grande della figura.

LEC svolgono un ruolo importante nel mantenimento dell'omeostasi fluido, risposta immunitaria agli antigeni estranei e l'assorbimento e il trasporto di alcuni nutrienti. Omeostasi LEC può essere influenzata da processi di malattia, come le infezioni batteriche e metastasi tumorali, ma LEC può anche sviluppare mutazioni somatiche che provocano la formazione di vasi linfatici disfunzionali e una significativa morbidità nei pazienti affetti. Per ottenere una maggiore comprensione di linfatica malformazione eziologia attraverso l'impianto in vivo e ex vivo sperimentazione, e scoprire nuove opzioni di trattamento, in primo luogo abbiamo sviluppato un metodo di isolamento LEC sulla base di perla magnetica strategia di selezione utilizzando CD34 CD31 ^{Neg Pos} strategia di selezione ^15. Tuttavia, le colture risultanti spesso contenevano cellule diversi dalle cellule endoteliali che sono difficili da rimuovere. Successivamente, il metodo è stato perfezionato utilizzando FACS per ordinare LEC che esprimono CD34 ^Basso CD31 ^Pos VEGR3 ^Pos PODOPLANIN ^Pos fenotipo. Questo approccio ha portato a culture LEC relativamente omogenee contenenti <0,5% di cellule CD34 non ^Bassa CD31 ^Pos VEGR3 ^Pos PODOPLANIN ^Pos on assegno post-ordinamento. In termini pratici, il vantaggio di classificare cellule FACS è che la riduzione della presenza non LEC di <0,5%. LEC coltivate e LM LEC hanno una morfologia tipica di ciottoli e diventano senescenti intorno passaggio 13.

In questo studio abbiamo descritto un protocollo basato su citometria di flusso per l'isolamento e la coltura di LEC altamente arricchito da tessuti normali e anormali in base alla loro espressione di una serie di marcatori di superficie cellulare (CD34 ^Basso CD31 ^Pos VEGR3 ^Pos PODOPLANIN ^Pos). Le cellule sono state filtrate da tessuti primari dopo 5-7 giorni di espansione in vitro, un passo che ha provocato sostanziale arricchimento di LEC rispetto alla loro frequenza nei tessuti al momento di isolamento. Durante surgery otteniamo tessuti, da alcuni microgrammi a decine di grammi di peso. Questo tessuto può variare notevolmente nella sua composizione rispetto al volume di vasi linfatici malformazione presente, cicatrici dei tessuti e presenza di cisti linfatica malformazione trombi. Tutti questi componenti influenzeranno il numero di cellule può essere isolato dal tessuto malato. Quindi, il numero di cellule di partenza può variare da poche migliaia di cellule a diversi milioni di cellule. Analogamente, questo influenzerà la composizione della sospensione cellulare e partendo numero di cellule che significa che il numero di cellule ordinati dipendono anche da un campione all'altro.

La frequenza dei LEC in campioni prepuzio non ordinati a seguito di 5-7 giorni in coltura varia dal 0,52% al 4,7%, mentre LM LEC vanno da 0,8% al 12,43%. Le culture LEC compreso> 99% CD34 ^Basso CD31 ^Pos VEGR3 ^Pos PODOPLANIN ^Pos cellule dopo la post-ordinamento rianalisi e mantenuto una cobbleston tipicoe la morfologia della cultura fino a senescenza passaggio ~ 13 senza crescita eccessiva da elementi non endoteliali.

È necessario espandere cellule ex vivo dopo la digestione del tessuto iniziale e smistamento per la resa di cellule sia malformazione prepuzio o linfatici è generalmente bassa. Così, la prima espansione di cellule endoteliali linfatiche i n permette vitro la generazione dei ~ 2x10 ⁶ cellule necessarie per inizializzare una camera di mouse. Questo richiede una fase di espansione in vitro di 5-7 giorni. Mentre noi accettiamo che la cultura cellula può indurre cambiamenti fenotipici nelle cellule primarie, abbiamo dimostrato che queste cellule in coltura mantengono la loro capacità di formare strutture malformazione simile linfatici in un modello di xenotrapianto del mouse ^15.

Ci sono diversi passaggi critici all'interno del protocollo che determinano il grado di successo durante l'ordinamento delle cellule da FACS. La fase più critica è il tempo di esposizione delle cellule di collagenasie dispasi durante l'isolamento dai tessuti primari come descritto al punto 2.7. Questo non solo è influenzata dalla quantità e dal tipo di tessuto presente ma anche dal lotto di enzimi utilizzati. Inoltre, fluorescente anticorpi usati per caratterizzare le popolazioni cellulari devono essere titolati e preferibilmente monoclonali. Abbiamo provato diverse soluzioni diverse di distacco delle cellule come la tripsina / EDTA, EDTA, TrypLE Select e soluzione il distacco delle cellule. Abbiamo trovato che EDTA doveva essere usato per un periodo prolungato di tempo per staccare cellule e grumi di cellule residue spesso rimasti. Al contrario, sospensioni singola cella sono stati generati in 3-5 minuti di incubazione a Tripsina / EDTA, soluzione il distacco delle cellule e TrypLE Select. Abbiamo trovato alcuna differenza sostanziale nella espressione di CD31, CD34, Podoplanin e VEGFR-3 in seguito al trattamento con una qualsiasi delle soluzioni di enzimi. Campioni colorati singoli dovrebbero anche essere fatto con ogni esperimento di smistamento per garantire che spettri di emissione fluorocromo non si sovrappongono equindi dare letture errate. Questi passaggi critici costituiscono anche punti in cui le modifiche al protocollo delle cellule potrebbe essere necessario o la risoluzione dei problemi durante la citometria a flusso di ordinamento.

Rispetto alla nostra precedentemente pubblicato isolamento branello magnetico di LEC ^15, il vantaggio di isolare LEC da FACS include quanto segue: più rapido isolamento di cellule con elevata purezza e identità delle sottopopolazioni cellulari discreti e popolazioni rari in un campione eterogeneo. Le principali limitazioni della LEC-based FACS e l'isolamento LM LEC ruota attorno numero di cellule disponibili per la convalida seguenti cellula ordinamento risultati limitati. Inoltre, mentre è fatto ogni tentativo di standardizzare i nostri test e strumenti di set-up, questi stessi parametri possono non essere necessariamente riproducibile in altri laboratori. Pertanto, si può verificare una certa variabilità nei risultati. Inoltre, una delle questioni che i biologi linfatici affrontare è l'assenza di marcatori specifici delle celluleche sarebbe distinguere tra marcatori capillare LEC iniziale e la raccolta di indicatori LEC capillari. In questa fase, non abbiamo ancora identificato i marcatori LEC che distinguere tra LEC sani e LM LEC. Poiché il tessuto malformazione linfatica contiene anche normale aspetto vasi linfatici (Figura 1A), il conseguente ^basso CD34 CD31 ^Pos VEGR3 ^Pos PODOPLANIN ^Pos conterrà una proporzione di LEC normali sia quelli del fenotipo malato. Studi futuri esame LEC e di espressione genica LM LEC e proteomica può essere in grado di orientarci verso più specifici marcatori LEC LM che potrebbero distinguere LM LEC dal LEC nello stesso tessuto.

In futuro, ci aspettiamo di utilizzare FACS e questi nuovi marcatori LEC in tentativo di identificare rari sottoinsiemi di popolazione LEC sia in prepuzio e malformazioni linfatiche. Ciò consentirebbe di isolare queste popolazioni cellulari e studiare il loro ruolo nello sviluppo della lympsistema vascolare hatic e malformazioni linfatiche.

LEC isolamento e LM LEC basate su CD34 ^Basso CD31 ^Pos VEGR3 ^Pos PODOPLANIN ^Pos ridotto in modo significativo la contaminazione delle cellule non endoteliali. Inoltre, la tecnologia di FACS permette di separare LEC in sottotipi in base alla espressione di CD31, PODOPLANIN e VEGFR-3 marcatori di superficie delle cellule e di comprendere ciò nel contesto dello sviluppo linea cellulare. Per LEC malate, questo permette di studi specifici per cellulari che permetterà di fare ulteriore luce sui geni che causano malattie e la capacità LEC LEC di rispondere a stimoli diversi cellulari in vitro e in modelli animali di xenotrapianto.

The authors have nothing to disclose.

Gli autori desiderano ringraziare la Fondazione Baker e 'Women in Science Fellowship' Fondazione dei bambini di reale sostegno Zerina Lokmic. Andrew G. Elefanty e Edouard G. Stanley sono NHMRC anziani borsisti di ricerca. Il lavoro nei loro laboratori è stata sostenuta da NHMRC e cellule staminali in Australia.