Attivazione e misurazione dei NLRP3 inflammasome all'attività utilizzando IL-1β in cellule dendritiche umane derivate da monociti

Le cellule dendritiche (DC) secernono IL-1β in risposta al riconoscimento di TLR8 purinico sintetico, R848, seguita dall'attivazione inflammasome NLRP3 con nigericin, dunque, IL-1β può essere utilizzata per misurare l'attività inflammasome NLRP3. Intracellulare colorazione citochina, immunoblotting, ELISA e sono utilizzati per misurare con precisione NLRP3 inflammasome adescamento e l'attivazione tramite l'espressione di IL-1β.

Processi infiammatori derivanti dalla secrezione di interleuchina (IL) -1 citochine famiglia di cellule immunitarie portano a infiammazione locale o sistemica, rimodellamento tissutale e riparazione, e il controllo virologico ^{1, 2.} L'interleuchina-1β è un elemento essenziale della risposta immunitaria innata e contribuisce ad eliminare agenti patogeni invasori evitando la creazione di infezione persistente ^1-5.

Inflammasomes sono la piattaforma chiave di segnalazione per l'attivazione di interleuchina 1 enzima di conversione (ICE o caspasi-1). Il inflammasome NLRP3 richiede almeno due segnali in DC per provocare la secrezione di IL-1β ^6. Espressione proteica Pro-IL-1β è limitato in cellule quiescenti; Pertanto è richiesto un segnale di innesco per IL-1β trascrizione e l'espressione della proteina. Un secondo segnale rilevato dai risultati NLRP3 nella formazione del multi-proteina NLRP3 inflammasome. La capacità delle cellule dendritiche di responsabilitàd per i segnali necessari per la secrezione di IL-1β può essere testato utilizzando un purinico sintetico, R848, che è rilevata da TLR8 in monociti umana derivata cellule dendritiche (moDCs) di cellule primarie, seguita da attivazione del inflammasome NLRP3 con la tossina batterica e ionophore potassio, nigericin.

Monociti DC derivati ​​vengono facilmente prodotte nella cultura e forniscono significativamente più cellule purificate di cellule dendritiche mieloidi umane. Il metodo qui presentato differisce da altri saggi inflammasome dal fatto di utilizzare in vitro umana, invece di topo derivata, DC permettendo così lo studio della inflammasome nella malattia umana e infezione.

L'attivazione del sistema immunitario innato è necessario per orientare le risposte immunitarie adattative durante l'infezione, la malattia, e la vaccinazione ^7. Le cellule dendritiche sono le più potenti cellule presentanti l'antigene del sistema immune innato; sono specializzati per l'assorbimento di antigeni, la migrazione ai linfonodi, e l'attivazione di ingenuo CD4 ⁺ e CD8 ⁺ citolitica cellule T ^8-10. Per attivare il rilevamento rapido patogeno il sistema immunitario innato utilizza numerosi germinali codificato pattern recognition recettori (PRR), che riconoscono patogeni conservati motivi derivati ​​o ospitano derivata marcatori di stress e danno cellulare. Toll like receptors (TLR) sono recettori di membrana legato pattern recognition che riconoscono certi extracellulare patogeno fagocitato pattern molecolari associati (PAMPs) e modelli molecolari pericolo associato (smorza). Per cenno contrario like receptors (NLRs) sono citosolico e rispondere ad una vasta gamma di PAMPs e smorza. Nod like receptors representare una seconda linea di difesa contro gli agenti patogeni che eludono superficie cellulare e PRRs endocitiche. L'interazione del patogeno derivata o "pericolo" associata, fattori con TLR e NLR ligandi porta ad uno stato di maturazione delle DC conseguente maggiore interazione DC con altre cellule immunitarie e promozione della cellula T e l'attivazione delle cellule natural killer ^11.

L'interleuchina-1β è una componente cruciale della difesa dell'ospite contro le infezioni. All'atto della rilevazione di un microrganismo, la citochina proinfiammatoria molto, IL-1β, è secreta e funziona come un attrattivo chemio e attivatore delle cellule immunitarie innate e adattative. In vivo IL-1β è in gran parte responsabile della risposta di fase acuta tra cui febbre e citochine infiammatorie sintesi ^12.

La maggior parte NLRs contengono un dominio ricco di ripetizione C leucina terminale che è pensato per funzionare in sensing ligando, un nucleotide dominio di legame centrale (NACHT), che è imponella documentazione, per NLRP3 oligomerizzazione, ed un terminale di dominio effettore N (PYD in NLRP3) che media la trasduzione del segnale a bersagli a valle attraverso interazioni proteina proteina. La proteina NLRP3 definisce il complesso più intensamente studiati inflammasome. Questa proteina è un membro della famiglia NLR e ha la capacità di formare un complesso proteico molecolare più composto NLRP3, il PYCARD proteina adattatore (noto anche come ASC), e ICE. Dopo l'attivazione inflammasome PYCARD si lega ai domini terminali NLRP3 N e recluta ICE, attraverso l'attivazione delle caspasi e il dominio di reclutamento (CARD) domini. Interleuchina-1 enzima di conversione viene inizialmente generato come zimogeno contenente un motivo CARD al suo N-terminale. Risultati formazione inflammasome nel portare due molecole ICE sufficientemente vicino per indurre la loro attivazione autocatalitica. Il complesso inflammasome necessari all'attivazione ICE permettendo così di convertire citoplasmatica pro-IL-1β maturare citochina.

La secrezione di successo di IL-1β in DC richiede rilevamento di due segnali di pericolo diversi e indipendenti. Primo, TLR rilevamento di PAMPs, smorza o segnalazione citochine (TNFa o IL-1β) causa un upregulation dell'espressione della proteina pro-IL-1β citoplasmatica. È necessaria una seconda, spesso diversi, segnale per inflammasome formazione del complesso monte di ICE maturazione. Alcuni inflammasome segnali di stimolare includono le tossine membrana batterica formazione di pori (come nigericin), lisosomiali interrompendo cristalli (come ad esempio cristalli di urato monosodico, MSU), e ATP extracellulare. Il meccanismo che porta a monte NLRP3 attivazione inflammasome da questi diversi attivatori è chiaro. Gli studi che indagano monte segnalazione della formazione inflammasome propone di eventi intracellulari, come l'induzione di ipopotassiemia o di specie reattive dell'ossigeno (ROS) indirettamente attivano il inflammasome ^13-28.

Tra i diversi attivatori virali del inflammasome NLRP3 è influenza, che fornisce bOth il segnale primario e secondario richiesto per la secrezione di IL-1β ^{3, 29-33.} Utilizzando modelli NLRP3 topo knockout è stato trovato che la secrezione di IL-1β in DC è NLRP3 dipendente ^32. Inoltre, NLRP3 topi knockout attratti minor numero di leucociti nel sito di infezione e sperimentato una maggiore mortalità ^{2, 5.} Due lavori recenti suggeriscono un meccanismo per l'attivazione inflammasome NLRP3 durante l'infezione da virus influenzale; prima, adescamento attraverso il riconoscimento di RNA virale da TLR7 o TLR8 (seconda espressione TLR della cellula risponde) o tramite rilevamento di batteri commensali da altri TLR per indurre l'espressione citoplasmatica pro-IL-1β, seguito da un secondo segnale, l'attivazione di NLRP3 formazione inflammasome da proteine ​​canale ionico M2 virale sulla rete transeuropea Golgi ^{33, 34.} In quest'ultima fase, l'attivazione del inflammasome NLRP3 è compiuto da disturbi del ionico intracellulare ambiente che porta alla produzione di ROS, che è semplice, rilevata da NLPR3 come segnale per formare il inflammasome. Tuttavia, il meccanismo preciso di inflammasome monte l'attivazione di attività ICE durante l'infezione influenzale rimane ancora poco chiaro.

Questo lavoro descrive una tecnica utile per studiare la inflammasome NLRP3 in moDCs umani che può essere utilizzato come base per ulteriori indagini della via sottostante DC basato secrezione di IL-1β in risposta a TLR8 legatura con R848 seguita dall'attivazione del inflammasome da un pozzo attivatore noto di NLRP3, nigericin. Variazioni di questo metodo possono essere utilizzati con altri tipi di cellule inclusi, ma non limitati a: monociti, macrofagi, altri sottoinsiemi DC e cellule epiteliali.

Dichiarazione Etica: i campioni di ricerca sono ottenuti e conservati per la ricerca con il consenso dei donatori. Tutti i campioni devono essere codificati o anonimizzati prima dell'uso. Questo protocollo segue le linee guida del nostro Institutional Review Board.

1. Differenziazione del sangue periferico umano monociti in cellule dendritiche derivate da monociti.

Nota: buffy coat umani servono come fonte di cellule umane del sangue periferico (PBMC) e sono stati ottenuti dal New York Blood Center (New York, NY). Donatori di sangue sono volontari sani. La procedura di cinque giorni inizia con la placcatura di cellule umane mononucleate del sangue periferico (PBMC) su colture di tessuti Boccette ^35,36. Notevoli differenze dei protocolli pubblicati sono i seguenti:

1. Utilizzare 225 centimetri ² non pirogeniche fiasche di coltura tissutale polistirene con un tappo del filtro di aderire un totale di 2x10 ⁸ PBMC al pallone invece di 10 centimetri di polistirolo piastra di coltura tissutales (58 gli cm ²⁾ (step 1).
2. Preparare media con 5% di siero umano (pool PHS; 30 ml) a 500 ml RPMI-1640 + L-glutammina, tampone 5 ml 1 M HEPES, e 1,4 ml di 50 mg / ml di gentamicina (5% PHS media) seguita da filtrazione attraverso un filtro 20 micron. Aggiungere un totale di 50 ml 5% PHS supporti per 225 centimetri pallone di coltura tissutale ^2.
3. Lavare le cellule aderito tre volte con 25 ml fresco RPMI-1640. Agitare energicamente per 5 secondi durante ogni lavaggio e aspirare le cellule non aderenti (punto 4).
4. Aggiungere 190 ml di 400 UI / mL di IL-4 e 380 ml di 100 UI / ml GM-CSF per bombola (fase 3) al giorno 0, 2 e 4. Giorno 0 è definita come la PBMC giorni sono inizialmente placcati in fase 1 (punto 8).
5. Giorno Harvest 5 moDCs una concentrazione di 1x10 ⁶ cellule / ml (passo 15).
6. Utilizzare immediatamente moDCs nel loro stato di riposo. Passi 17-22 non sono mai eseguite. Nota: I campioni devono essere trattati il ​​più presto possibile dopo la raccolta per i migliori risultati.
7. MoDCs aliquote ad una concentrazionezione di 2x10 ⁵ cellule / pozzetto (200 pl / pozzetto della 1x10 ⁶ cellule / ml) in una piastra da 96 pozzetti a fondo rotondo (western blot, ELISA, FACS) o su un chamberslide poli-L-lisina trattati (microscopia) per la sperimentazione . Nota: Ci sono almeno quattro condizioni: Completamente non stimolato (controllo negativo), adescamento solo, solo l'attivazione, e adescamento seguita da attivazione. Le condizioni possono essere espanse per includere controlli diluente per R848 e nigericin se lo si desidera. Se il test a valle è ICS, duplicati sono necessari per i controlli isotipo.

. 2 adescamento del inflammasome - Segnale 1

1. Ricostituire liofilizzato R848 in DMSO secondo le istruzioni del produttore. Diluire magazzino lavorare a RT con RPMI-1640.
2. Aggiungi R848 ad una concentrazione finale di 10 micron di appropriarsi di pozzi per 18 ore. Cellule posto in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO _2.

3 Attivazione del NLRP3 inflammasome -. Segnale2

1. Ricostituire nigericin liofilizzato in etanolo secondo le istruzioni del produttore. Diluire magazzino lavorare a RT con RPMI-1640 prima di aggiungere alle condizioni appropriate.
2. Aggiungere nigericin ad una concentrazione finale di 20 mM e tornare alla incubatore a 37 ° C e 5% di CO ₂ per 6 ore. Nessun fasi di lavaggio si verificano tra adescamento e durante l'attivazione. Nota: La secrezione di IL-1β è incrementata dalla presenza di ionofori del calcio, brefeldina A, monensina, dinitrofenolo, o cianuro di carbonile chlorophenylhydrazone ^{37, 38.} Pertanto, l'aggiunta di questi inibitori di secrezione non sono raccomandati quando si analizzano adescamento o attività inflammasome in quanto altera la secrezione di IL-1β.

4. IL-1SS Raccolta dei campioni

1. Centrifugare la piastra con cellule e surnatanti a 974 xg per 3 min.
2. Senza disturbare il pellet cellulare, aspirare il surnatante e trasferire comeeparate rotondo fondo piatto per misurare la secrezione di citochine dai surnatanti. Nota: I surnatanti sono temporaneamente conservati a -20 ° C o -80 ° C per una conservazione a lungo termine.
3. Lavare il pellet cellulari tre volte con 200 microlitri di PBS 1x a 974 xg per 3 minuti per rimuovere ogni extracellulare IL-1β dai campioni cellulari. Nota: Quando si lavano pellet cellulari da una piastra a 96 pozzetti, rimuovere il lavaggio da una rapida inversione piastra in un contenitore di raccolta in modo da non disturbare il campione.

5. Misura di IL-1SS Da cellulari e surnatante Campioni

1. Intracellulare di citochine colorazione (ICS): Il protocollo ICS è descritto di seguito ^{39, 40.} Nota: non sospendere le cellule se il test a valle è la microscopia. Tutti i lavaggi e aspirazioni dovrebbe essere fatto senza disturbare lo strato di cellule / pellet (a seconda del dosaggio a valle).
   1. Aggiungere 100 ml di 5% mezzi PHS nei pozzetti. Aggiungerevolume appropriato (circa 1 μl/2x10 ⁵ celle o 1 ml / pozzetto) di fluorescente α-CD11c e α-CD14 (marcatori fenotipo; clone B-ly6 e MφP9 rispettivamente) o controllo isotipico alle cellule per 10 minuti a RT al buio.
   2. Lavare tre volte con PBS 1x a 974 xg per 3 min.
   3. Fissare le cellule con l'aggiunta di 100 ml di PFA 4% per 20 minuti a temperatura ambiente al buio.
   4. Pausa Point: Lavare con 100 microlitri 1x PBS a 974 xg per 3 min e conservare a 4 ° CO / N in 1x PBS.
   5. Aggiungere 100 microlitri di tampone di permeabilizzazione alle cellule per 30 min. Nota: tampone permeabilizzazione è composto di 1x PBS con 0,3% Triton X-100, e 1% di albumina di siero bovino (BSA) per permeabilizzazione. Non disturbare cellule aderenti quando dosaggio valle è microscopia.
   6. Aggiungi volume adeguato (circa il 62 ng antibody/2x10 ⁵ celle, circa o 2,5 microlitri / pozzetto) di α-IL-1β-FITC (clone 8516) o il controllo isotipico per2 ore in un incubatore a 37 ° C.
   7. Lavare le cellule tre volte con 200 microlitri di tampone di permeabilizzazione a 974 xg per 3 minuti al buio.
   8. Optional: Stain con DAPI, aggiungere mezzo di montaggio e posizionare coprioggetto delicatamente sulla sommità di un vetrino. Lasciare montante per curare O / N prima di catturare immagini di microscopia.
   9. Acquisire i dati da FACS o microscopia. Nota: Confronta isotipo per ogni condizione per la colorazione appropriata quando si analizzano da FACS o microscopia.
      1. FAC: Acquisire un campione alla volta. Impostare la FSC / cancello SSC sulle cellule vive, seguita da gating su CD11c ⁺ CD14 ^- cellule prima di analizzare la popolazione modc pro-IL-1β colorazione.
      2. Microscopia: Impostare il tempo di esposizione con il campione di colorazione positiva - R848 trattato. Utilizzare DAPI ⁺ pro-IL-1β ⁺ e DAPI ⁺ pro-IL-1β ^- per determinare la percentuale di pro-IL-1β + moDCs esprimono.
2. SDS-Pagina: Immunoblotting viene eseguita per rilevare pro-IL-1β. Nota: La tecnica descritta di seguito unisce tecnica standard immunoblotting, pendenza 4-20% gel di poliacrilammide, e la rilevazione fluorescente o chemiluminescente ^{41, 42.}
   1. Lisare le cellule direttamente in 10 microlitri di denaturazione buffer di lisi (5 microlitri β-mercaptoethanol/950 tampone campione microlitri Laemmli seguita da diluire 1:1 con tampone di lisi cellulare). Trasferire il lisato a 1,5 ml provette Eppendorf.
   2. Lisato calore su una piastra secco per 10 minuti a 100 ° C.
   3. Spin lisato a 20.800 xg su un minicentrifuge per 1 min per concentrare il volume di liquido. Punto Pausa: i campioni possono essere congelati a -20 ° C per la conservazione a breve termine.
   4. Caricare il volume totale sul gel di poliacrilamide. Eseguire 140 V attraverso la scatola gel per circa 1 ora, o fino a quando il fronte del colorante fuoriesce dal fondo del gel.
   5. Trasferire la proteina dal gel di poliacrilammide su un membr PVDF Immobilon-FLane per 90 min a 100 V. Block la membrana con 5% BSA in Tris Buffered Saline / 0,1% Tween-20 (TBS-T) per 1 ora. Nota: PVDF Immobilon-FL è la migliore per l'utilizzo con la rilevazione fluorescente. Una membrana con una diversa composizione è raccomandato per altre tecniche di rilevamento per aumentare il rapporto segnale sfondo.
   6. Diluire gli anticorpi primari e secondari in 10 ml di 5% BSA / TBS-T. Eseguire incubazioni anticorpi primari a 4 ° CO / N mentre stringe e anticorpo secondario a temperatura ambiente per 1 ora agitando.
   7. Lavare la membrana 3 volte con TBS-T per 5 minuti agitando tra le incubazioni anticorpi primari e secondari e di nuovo tra le incubazioni secondari e imaging. Nota: Bands possono essere rilevati utilizzando fluorescenti o rivelazione chemiluminescente. Seguire le istruzioni del produttore per il rilevamento.
3. ELISA: I campioni che vengono congelati per la conservazione necessità di equilibrare a RT prima dell'analisi. Spin down campioni in una centrifuga per consolidare condensa surnatantezione. Seguire le istruzioni del produttore per la misura di IL-1β. Nota: In questo protocollo IL-1β è specificamente misurato; Tuttavia, la misurazione simultanea di TNFa, IL-6, e il immunomodulante citochina IL-10 assicurare le condizioni appropriate erano pronti.

Queste tecniche misurano TLR8 adescamento con R848. Intracellulare colorazione citochina per pro-IL-1β permette di microscopia e FAC letture da CD14 ^- CD11c ⁺ moDCs. Entrambe le tecniche possono essere quantificate rispetto ad un non innescato, o di riposo, controllo delle cellule così come un controllo isotipico (figure 1 e 2). Percentuale di cellule pro-IL-1β ⁺ colorazione viene moltiplicato per il mediano geometrico di questa popolazione per fornire l'intensità fluorescente mediana (MFI). Il MFI è paragonabile alla quantità di pro-IL-1β presente nelle cellule colorazione positiva.

Misure di immunoblotting pro-IL-1β dal lisato cellulare, che viene poi quantificato rispetto al controllo cellulare interna, come β-tubulina o β-actina (Figura 3). Immunoblotting per pro-IL-1β nelle cellule trattate Nigericina dovrebbe rivelare una diminuzione pro-IL-1β. Ciò è completato da unconcomitante aumento di IL-1β in surnatanti, misurata mediante ELISA, solo in R848 seguita dal Nigericina (Figure 3 e 4). Tutte le altre condizioni devono comportare nessun extracellulare di IL-1β presente. Misura simultanea di altre citochine infiammatorie, come TNFa, IL-10 e IL-6, assicurano che nigericin è specifico nel causare la secrezione di IL-1β. Il livello di adescamento è tempo (Figura 3) e la dose (Figura 4) dipende, una risposta riflessa nel grado di intracellulare pro-IL-1β in R848 innescato e extracellulare di IL-1β (così come TNFa, IL-10, e IL-6) secrezione in tutto R848 condizioni trattate (Figura 4).

Figura 1. Citoplasmica pro-IL-1β è rilevata da f bassa citometria. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Citoplasmica pro-IL-1β viene rilevato mediante microscopia. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Citoplasmica pro-IL-1β viene rilevato mediante SDS-PAGE.res.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Secreted IL-1β viene rilevato dal test ELISA. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Citochine infiammatorie sono parte integrante nel guidare la risposta immunitaria innata e adattativa per combattere le infezioni virali. Secreto IL-1β è stato dimostrato di aumentare durante l'infezione influenzale ^{3, 43, 44.} I meccanismi precisi con cui queste citochine sono elaborate in risposta al riconoscimento virale in cellule dendritiche umane non sono pienamente compresi. Kit di isolamento DC mieloidi sono costose e richiedono tempo. Kit di isolamento e FAC ordinamento possono involontariamente stress o di attivare le cellule. Inoltre, vi è spesso insufficiente quantità di cellule isolate di sperimentazione. Fortunatamente, la biologia dei moDCs umani da vicino modelli di primarie DC mieloidi umane in vitro ^{45, 46.} Entrambi i tipi di cellule necessitano di due segnali, TLR adescamento e NLRP3 attivazione, per ottenere la secrezione di IL-1β maturo. Pertanto, moDCs forniscono e tipo economico e semplice cellulare modello DC per lo studio e la scommessater comprendere l'importanza e il ruolo della inflammasome NLRP3 in salute e della malattia.

Il rilevamento di IL-1β utilizzando i metodi qui descritti fornisce vari saggi immunologici semplici ed efficaci per studiare le malattie infiammatorie con patologie associate, comprese le infezioni RNA virale; specificamente, come misurare IL-1β in una varietà di modi in risposta a R848 e nigericin stimolazione. Altri TLR agonisti (come il poli (I: C) e LPS) e NLRP3 attivatori inflammasome (quali ATP e MSU) possono essere usati per misurare l'attività dopo stimolazione nel contesto di altre patologie malattia; Tuttavia, i tempi e le condizioni di stimolazione potrebbe essere necessario un aggiustamento. Tempi di esposizione del reagente e concentrazioni dovrebbero inoltre essere regolati quando si modificano questo protocollo per l'utilizzo in altri tipi di cellule e specie.

Tutte le condizioni devono essere eseguiti in triplice copia e la risposta pesati con attenzione ai fini del controllo della qualità; è comune pergrande variabilità dei donatori di esistere. Monociti DC derivate sono un tipo di cellula, non una linea cellulare, ed esiste eterogeneità all'interno di una cultura modc.

L'adescamento può essere confermata con ICS per pro-IL-1β e confrontando moDCs riposo alla condizione R848-innescato. MoDCs di riposo non dovrebbero comportare colorazione positiva. L'adescamento può anche essere convalidato da immunoblotting per l'espressione di pro-IL-1β. Successo risultati innesco R848 nella secrezione di citochine proinfiammatorie TNFa, IL-6, e la citochina IL-10 immunomodulante con minima secrezione di IL-1β. Cellule attivate inflammasome non dovrebbero mostrare un ulteriore aumento TNFa, IL-6 e IL-10 secrezione, ma avrà un aumento delle concentrazioni di IL-1β secreti rispetto alle cellule non attivati.

Pro-IL-1β può essere passivamente rilasciato durante la morte cellulare necrotica pertanto saggi biodisponibilità potrebbero essere di interesse. In alternativa, immunoblotting può essere eseguita su supernatants per determinare il peso molecolare di secreto IL-1β garantire attiva di IL-1β è la forma della citochina secreta; maturo IL-1β è di 17 kDa, mentre il precursore è 31 kDa. Per misurare IL-1β da surnatanti, concentrazione cellulare dovrà essere regolata per ottenere un segnale positivo di sopra del limite di rilevamento. Caspasi-1 attivazione può essere misurato mediante una varietà di metodi per determinare l'attivazione inflammasome.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Gli autori desiderano ringraziare Olivier Manches, Ph.D., Davor Frleta, Ph.D., e Meagan O'Brien, MD per il loro supporto e feedback. Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institute of Allergy e malattie infettive e completato con finanziamenti NIH concede Ruth L. Kirschstein Nazionali servizio di ricerca Awards per i diversi predoctoral Fellowships (F31) per promuovere la diversità nella ricerca in campo sanitario (AI089030) e RO1 (AI081848 ).