A Step-by-step Metodo per la ricostituzione di un Transporter ABC in particelle lipidiche Nanodisc

Nanodiscs sono piccole particelle discoidali che incorporano proteine ​​di membrana in una piccola zona di doppio strato di fosfolipidi. Forniamo un protocollo visivo che mostra il passo-passo incorporazione del trasportatore MalFGK2 in un disco.

Il nanodisc è una particella discoidale (~ 10-12 nm di grandi dimensioni) che le proteine ​​di membrana trappola in una piccola zona di doppio strato di fosfolipidi. Il nanodisc è un'opzione particolarmente interessante per studiare proteine ​​di membrana, in particolare nel contesto delle interazioni ligando-recettore. Il metodo introdotto da Sligar e colleghi si basa sulle proprietà di un anfipatiche altamente ingegnerizzato ad a-elica proteina scaffold derivato dal apolipoproteina A1. Le facce idrofobe della proteina scaffold interagire con i grassi acil catene laterali del doppio strato lipidico che le regioni polari affrontare l'ambiente acquoso. Analisi di proteine ​​di membrana in nanodiscs hanno vantaggi significativi rispetto liposoma perché le particelle sono piccole, omogenea e idrosolubile. Inoltre, metodi biochimici e biofisici normalmente riservati alle proteine ​​solubili possono essere applicati, e da entrambi i lati della membrana. In questo protocollo visiva, presentiamo un passo-passo ricostituzione di un carattere benterizzato trasportatore batterica ABC, il maschio-MalFGK ₂ complessi. La formazione del disco è un processo di auto-assemblaggio che dipende da interazioni idrofobiche che avvengono durante la rimozione progressiva del detersivo. Si descrivono le fasi essenziali e sottolineano l'importanza di una corretta scelta proteina-lipide rapporto al fine di limitare la formazione di aggregati e grandi polidispersi liposoma-come particelle. Qualità semplici controlli, come la cromatografia di gel filtrazione, elettroforesi su gel nativo e dinamico spettroscopia di dispersione della luce in modo che i dischi sono stati adeguatamente ricostituito.

Ricostituzione del processo globale

Il processo inizia ricostituzione miscelando la membrana proteina scaffold (MSP) con il complesso purificato MalFGK ₂ in presenza di detergente-solubilizzate fosfolipidi. La fase è seguita dalla rimozione lenta del detergente da un materiale adsorbente polistirene chiamato Bio-Beads o Amberlite (Figura 1). L'auto-assemblaggio processo si verifica molto probabilmente a causa delle interazioni tra i fosfolipidi apolari idrofobici, la MalFGK ₂ complessi e la superficie della proteina MSP anfipatica. Il prodotto finale è una particella discoide fatta di due molecole di MSP incarto attorno al complesso ₂ MalFGK. Le particelle vengono separate dalle addotti e aggregati di ultra-centrifugazione analitica e cromatografia ad esclusione dimensionale. Le particelle sono caratterizzate da native-gel elettroforesi e spettroscopia dispersione della luce dinamica.

1. Il suo tag-MSP (versione MSP1D1 ¹⁾ è prodotto da pMSP1D1 plasmidi in E. coli BL21 (DE3) indotta a OD ₆₀₀ ~ 0,5 con 0,5 mM isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside per 3 ore a 37 ° C.
2. Le cellule vengono raccolte mediante centrifugazione a 5000 xg per 10 min a 4 ° C e risospese in tampone contenente 100 TSG10 fluoruro phenylmethanesulfonyl pM.
3. Le cellule vengono lisate con una pressa French (3x) a 8000 psi e il materiale insolubile è rimosso per centrifugazione a 5000 xg per 10 min a 4 ° C. La frazione solubile contenente l'MSP è isolato da ultra-centrifugazione a 125.000 xg per 45 min.
4. La MSP è purificato dal nichel-chelante cromatografia usando ~ 1,5 ml Ni Sepharose HP TSG10 buffer. Contaminanti vengono lavati via con TSG10 tampone contenente 50 mM imidazolo. La MSP è eluita con TSG10 tampone contenente 600 mMimidazolo. La proteina purificata è dializzato in TSG10 tampone e conservati in -70 ° C ad una concentrazione proteica di ~ 10-15 mg / ml.

2. Preparazione del Complex ₂ MalFGK

1. Il complesso MalFGK _2, la-etichettato al C-terminale della MalK, viene espressa dal plasmide pBAD22-FGK in E. coli BL21 (DE3) e indotto a OD ₆₀₀ ~ 0,5 con 0,2% di L-arabinosio per 3 ore a 37 ° C.
2. Seguendo la lisi cellulare e centrifugazione come nel passo 1,3, il pellet viene risospeso in membrana TSG20 tampone ad una concentrazione finale di 5 mg / ml. Il materiale viene solubilizzato con 1% w / v n-dodecil-β-maltopyranoside (DDM) per 3 ore a 4 ° C con agitazione delicata.
3. Il materiale insolubile è rimosso per centrifugazione ultra-come nel passo 1.3 e il surnatante contenente il solubilizzata MalFGK ₂ complesso viene raccolto e purificato come nel passo 1.4, ma senza dialisi.
4. Inopurificazione r è ottenuta mediante cromatografia di filtrazione su gel in tampone TSGD su un Superdex 200 HR 10/300 colonna ad una velocità di flusso di 0,5 ml / min.

3. Preparazione di fosfolipidi

1. Un E. lipidi coli totale estratto sciolto in cloroformio è separato in 1000 nmol aliquote in provette con tappo a vite microcentrifuga. Il solvente viene evaporato sotto leggera corrente di azoto ed essiccato ulteriormente durante la notte in un essiccatore sotto vuoto.
2. Il film lipidico viene disciolto in tampone TS a 5 nM concentrazione finale e vortexati vigorosamente e sonicata. I lipidi disciolti appariranno leggermente opaco a causa della loro insolubilità generale in tampone acquoso TS, ma devono rimanere in sospensione. DDM viene aggiunto ad una concentrazione finale di 0,5% (~ 10 mM), in cui la soluzione diventa limpida.
3. La miscela lipidica è posto in un bagno di acqua e impulsi sonicata per 5 volte per ~ 5 sec. La miscela lipidica è conservato a 4 ° C per un massimo di 1 week.

4. Preparazione di Bio-Beads

1. Circa 10-15 ml (volume secco) Bio-Beads viene posto in una provetta da 50 ml.
2. Le perle vengono successivamente lavato con 50 ml di metanolo al 100%, 95% etanolo, MilliQ H ₂ O, e infine tampone TS (due volte).
3. Le perle vengono lavate conservato a 4 ° C in 10 ml di tampone ~ TS.

5. Nanodisc Ricostituzione

1. La MSP è diluito in tampone TSGD alla concentrazione finale di ~ 7 mg / ml (~ 0,3 mM).
2. ~ 2 nmol purificato MalFGK _due complessi sono miscelati in una proteina: MSP: rapporto di 1:3:60 lipidi o 1:3:400 in tampone TSGD. La concentrazione finale è di 6 mM MalFGK _2, 18 MSP pM e lipidi pM 360 (1:3:60) e 2.4 mM di lipidi (1:3:400). Il volume finale è 300 ml. La concentrazione DDM finale è 0,08% (~ 1,6 mm). La concentrazione finale di glicerolo dipende dalla quantità di lipidi aggiunto ma rimane circa 5-10% v / v
3. ~ 50 pl di Bio-Bead sospensione viene aggiunto alla provetta e la miscela è incubata per una notte su una tavola oscillante a 4 ° C.
4. Le perle vengono sedimentate per gravità e la soluzione viene pipettato attraverso una punta stretta per evitare il più Bio-Beads possibile.
5. Grande precipitati vengono rimossi dalla ultra-centrifugazione a 100.000 xg per 20 min. I dischi sono purificati mediante cromatografia di gel filtrazione, come nel passo 2.4 in TSG10 buffer. Frazioni contenenti i dischi vengono raggruppati ed una aliquota deve essere reimmesso sulla stessa colonna di filtrazione su gel per verificare la stabilità del preparato.
6. I dischi purificate possono conservati a -70 ° C per un periodo prolungato di tempo. Dopo lo scongelamento in ghiaccio, i dischi devono essere sottoposti ad ultra-centrifugazione come nel passaggio 5,5 per rimuovere potenziale precipitati. Una aliquota deve essere analizzata mediante cromatografia di gel filtrazione per garantire che l'aggregazione significativa o precipitazione non verificarsi durante lo scongelamentoprocesso.

6. Elettroforesi su gel nativo

1. 1 pM di nanodiscs (~ 0,2 mg / ml) sono analizzati mediante PAGE nativa ^{6, 7} (Tris-HCl pH 8,8, 4-12%) per valutare la qualità della ricostituzione (Figura 3A).
2. Il legame di maschio (1 mM) al _2-complesso MalFGK ricostituito in nanodiscs è anche valutata nativo-PAGE (Figura 3A).
3. Dopo l'elettroforesi, il gel viene colorato con blu Coomassie per 10 min, e decolorato per ~ 1 ora.

7. Light Scattering Dinamico (DLS)

1. Nanodiscs vengono purificati mediante cromatografia di gel filtrazione, come al punto 2.4 in TSG10 tampone usando un Superdex 200 HR 10/300 colonna ad una velocità di flusso di 0,1 ml / min. Frazioni contenenti nanodiscs sono riunite e concentrate a ~ 10 mg / ml con un filtro Amicon centrifugo.
2. Il campione viene filtrato due volte (0,22 micron filtro) prima dell'analisi da DLS utilizzanoun DYNAPRO nanostar strumento (Wyatt Technology) in un volume di 1 cuvetta microlitri interna quarzo. Dati è montato mediante il software DYNAMICS (Wyatt Technology) per stimare il diametro e peso molecolare delle particelle.

8. ATPasi Misure

1. L'attività di ATPasi MalFGK _{2-ricostituite} nanodiscs viene determinato utilizzando un saggio colorimetrico ^8.
2. 1 pM di dischi purificati e 1 mM ATP si mescolano con quantità crescenti di sesso maschile e incubate a 37 ° C per 20 min. Il rilascio di fosfato inorganico è misurata a 660 nm.
3. La quantità di fosfato liberato viene confrontata con una curva standard generata con una soluzione standard Fosforo.

9. Risultati rappresentativi

Le nanodiscs vengono purificati mediante cromatografia di filtrazione su gel (Figura 2A, a sinistra). Il cromatogramma mostra che la maggior parte del ricostituito dCSI (traccia nera) eluire come picco singolo, mentre i dischi realizzati con lipidi in eccesso (traccia rossa) eluiti nel volume di vuoto e da una serie di picchi di massima. La qualità dei nanodiscs è ulteriormente analizzati mediante elettroforesi su gel nativo e spettroscopia light scattering dinamico (DLS). Dischi correttamente ricostituite migrare come banda tagliente sul gel mentre quelli ricostituito in presenza di un eccesso di lipidi migrare come striscio (Figura 2A, destra). Analisi per DLS mostra che la popolazione disco è omogenea con un diametro medio di 11,4 nm (Figura 2B). I dischi ricostituiti hanno un peso molecolare apparente di 215 kDa basato sul ravvicinamento DLS. Campioni ricostituiti in presenza di eccesso di lipidi visualizzano ampiamente distribuiti raggi circa 100 nm, che è tipico per campioni non omogenei.

La qualità del complesso ₂ MalFGK viene valutata native-gel elettroforesi e la sua attività da ATPasimisure (Figura 3). Il maschio maltosio legame con le proteine ​​si lega con alta affinità per il trasportatore ₂ MalFGK ^{9, 10.} Utilizzo non denaturante elettroforesi su gel, è possibile rilevare un complesso tra maschio e MalFGK ₂ (Figura 3A). La stimolazione della attività ₂ MalK ATPasi da Male è illustrato nella figura 3B.

Figura 1. Tipico diagramma di flusso per il protocollo ricostituzione.

Figura 2. Il controllo di qualità della preparazione nanodisc. A. Filtrazione analisi Gel (Superdex 200 HR 10/300 colonne) delle nanodiscs ricostituito con rapporto di lipidi bassa (1/3/60; traccia nera) o il rapporto lipidi alta (1/3/400; traccia rossa). Elettroforesi su gel nativo del preparato stesso disco. Molmarcatori di peso ecular in kDa sono indicati. B. Analisi luce dinamica dispersione del preparato stesso disco. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 3. Analisi del MalFGK _2-nanodisc particelle. A. Spostamento analisi Gel di Malè incubate con quantità crescenti di MalFGK ₂ nanodisc particelle. B. ATPasi del MalFGK ₂ nanodisc particelle in funzione della concentrazione di Malè.

Descriviamo una semplice procedura per la ricostituzione del trasportatore maltosio in nanodiscs. Il trasportatore è ATPasi attiva e l'interazione con il maschio solubile partner di legame può essere ricreato (Figura 3). La ricostituzione di successo del trasportatore in nanodiscs aprire la strada a ulteriori analisi biofisica e biochimica. Di particolare interesse sarà l'analisi sistematica della ATPasi MalK e attività di trasporto in maltosio detersivo, liposomi e nanodiscs. Trasportatori ABC cambia conformazione durante il ciclo di trasporto, ma il contributo dei lipidi a questi cambiamenti conformazionali ancora da esplorare.

La realizzazione del nanodisc è relativamente semplice, ma piccole deviazioni da condizioni ottimali può portare irreversibili aggregazione proteica. In questo rapporto, sottolineiamo l'importanza della scelta di un corretto proteine: rapporto lipidi a causa di un eccesso di lipidi porterà alla production di grandi polidispersi liposomi come particelle che non rispondono alla qualificazione di un biofisico nanodisc. Una precedente analisi impiegato MSP molto elevata: rapporto lipidi per la ricostituzione del trasportatore maltosio (1/120 rispetto a 1/20 nella nostra analisi), ma le particelle formate non sono stati ulteriormente caratterizzati ^11. In ogni caso, è fondamentale analizzare attentamente la qualità del materiale ricostituito con tecniche diverse da gel filtrazione, come la spettroscopia di diffusione della luce, ultracentrifugazione analitica o più semplicemente, elettroforesi su gel nativo. L'importanza di questo controllo di qualità è stato sottolineato durante la ricostituzione di batteriorodopsina e P-glicoproteina ^12. Due altri parametri possono influenzare notevolmente il successo della ricostituzione: 1) la purezza della proteina di membrana di destinazione e l'assenza di aggregati e 2) il corretto rapporto tra le proteine ​​di membrana e proteine ​​scaffold. Inoltre, il tipo di fosfolipide i incorporatanto il disco, così come la lunghezza della proteina di membrana scaffold, può contribuire all'efficienza della ricostituzione. Altri parametri quali la solubilità e la stabilità della proteina di membrana in una soluzione detergente, il sistema tampone, la temperatura e il tempo di lunghezza della ricostituzione può inoltre essere regolata per ottimizzare il protocollo ricostituzione. Per esempio, proteine ​​di membrana impalcatura di lunghezze differenti producono nanodiscs di diverse dimensioni ^1, che possono aiutare la ricostituzione dei complessi proteici di membrana più grandi o oligomeri proteine ​​di membrana.

Il nanodisc è stata combinata con metodi biofisici quali SPR, ITC, e spettroscopia di fluorescenza ^12-16 per aiutare la ricerca membrana che sta lottando con metodologia quantitativa. Recentemente, il nanodisc è stata combinata con spettrometria di massa quantitativa per identificare interactomi proteine ​​di membrana con una migliore copertura e precisione17. L'industria farmaceutica è stato limitato dalle stesse difficoltà che affliggono il mondo accademico per studiare proteine ​​di membrana, anche se è fatto che i farmaci più frequentemente prescritti bersaglio proteine ​​di membrana (recettori, canali, trasportatori, sensori). Si può prevedere che il nanodisc aiuterà sviluppo di strategie screening di farmaci che funzionano con proteine ​​di membrana incorporati.

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo lavoro è stato sostenuto dal Canadian Institute of Health Research. CSC è stato finanziato da una borsa di studio post-dottorato della scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada. FD è un Tier II Canada Research Chair.