A أسلوب الخطوة بخطوة لإعادة تشكيل ناقلة الى جزيئات الدهون ABC Nanodisc

Nanodiscs هي جسيمات صغيرة القرصية التي تتضمن البروتينات الغشاء في قطعة صغيرة من طبقة ثنائية فسفوليبيد. نحن نقدم بروتوكول البصرية التي تظهر إدماج خطوة بخطوة من نقل MalFGK2 إلى القرص.

وnanodisc هو الجسيمات قريصي (~ 10-12 نانومتر الكبيرة) أن البروتينات الغشاء فخ في قطعة صغيرة من طبقة ثنائية فسفوليبيد. وnanodisc هو خيارا جذابا بشكل خاص لدراسة البروتينات الغشاء، وخاصة في سياق يجند مستقبلات التفاعلات. رائدا في الطريقة التي Sligar ويقوم الزملاء على خصائص متقابلة الزمر من المهندسة عالية A-حلزونية سقالة البروتين المستمد من A1 ئي. وجوه مسعور من البروتين سقالة التفاعل مع سلاسل جانبية أسيل الدهنية من طبقة ثنائية المادة الدهنية في حين أن المناطق القطبية تواجه البيئة المائية. تحليل البروتينات الغشاء في nanodiscs لها مزايا هامة على الحويصلية لأن جزيئات صغيرة، متجانسة وللذوبان في الماء. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق أساليب الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية التي عادة ما تحجز للبروتينات قابلة للذوبان، ومن جانبي الغشاء. في هذا البروتوكول البصرية، فإننا نقدم إعادة خطوة بخطوة من charac جيداterized نقل ABC البكتيرية، والذكور ₂ MalFGK المعقدة. تشكيل القرص هو عملية التجميع الذاتي التي تعتمد على التفاعلات التي تحدث أثناء مسعور في الإزالة التدريجية للمواد التنظيف. نحن وصف الخطوات الأساسية ونسلط الضوء على أهمية اختيار الصحيح البروتين إلى الدهون نسبة للحد تشكيل المجاميع والجسيمات الأكبر حجما polydisperse الحويصلية مثل. نوعية بسيطة مثل اللوني يتحكم الترشيح هلام، هلام الكهربائي الأصلي وديناميكية تشتت الضوء الطيفي ضمان أنه تم تشكيل الأقراص بشكل صحيح.

وعموما عملية إعادة إعماره

عملية إعادة خلط يبدأ الغشاء سقالة البروتين (MSP) مع مجمع تنقية ₂ MalFGK في وجود المنظفات الفوسفاتية-solubilized. ويتبع الخطوة عن طريق إزالة البطيء للالمنظفات من مادة البوليسترين الممتزات دعا بيو الخرز أو Amberlite (الشكل 1). عملية التجميع التلقائي يحدث على الأرجح بسبب التفاعلات بين عديم الأقطاب الفوسفورية مسعور، ₂ MalFGK معقدة وسطح البروتين ومتقابلة الزمر MSP. المنتج النهائي هو الجسيمات القرصية المصنوعة من اثنين من جزيئات التفاف حول المجمع MSP ₂ MalFGK. يتم فصل الجزيئات من adducts والمجاميع المتطرفة بواسطة الطرد المركزي والتحليلية اللوني الحجم الاستبعاد. وتتميز الجزيئات التي كتبها الأصلي هلام الكهربائي ودينامية تشتت الضوء الطيفي.

1. THE-MSP له الموسومة (الإصدار MSP1D1 ¹⁾ وينتج من pMSP1D1 البلازميد في E. القولونية BL21 (DE3) التي يسببها في OD ₆₀₀ ~ 0،5 مع 0.5 مم الآيزوبروبيل β-D-thiogalactopyranoside-1 لمدة 3 ساعة عند 37 ° C.
2. ويتم حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي عند 5000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية ومعلق في TSG10 العازلة التي تحتوي على 100 فلوريد phenylmethanesulfonyl ميكرومتر.
3. والخلايا هي lysed مع الصحافة الفرنسية (3X) عند 8،000 رطل وتتم إزالة المواد غير القابلة للذوبان بواسطة الطرد المركزي عند 5000 x ج لمدة 10 دقيقة في C. ° 4 يتم عزل جزء القابلة للذوبان التي تحتوي على MSP بواسطة الطرد المركزي المتطرفة في 125،000 x ج لمدة 45 دقيقة.
4. يتم تنقيته من MSP من النيكل مخلبية اللوني باستخدام ~ 1.5 مل ني sepharose و HP في TSG10 العازلة. تغسل مع الملوثات بعيدا TSG10 العازلة التي تحتوي على 50 ملي الاميدازول. ومزال في MSP مع TSG10 العازلة التي تحتوي على 600 ممالاميدازول. ومدال البروتين النقي في TSG10 العازلة وتخزينها في -70 ° C عند تركيز بروتين 10-15 ملغ من ~ / مل.

2. إعداد مجمع ₂ MalFGK

1. ال ₂ MalFGK المعقدة، له الموسومة في محطة سي من ذالك، ويعبر عن البلازميد من pBAD22-FGK في E. القولونية BL21 (DE3) والتي يسببها في OD ₆₀₀ ~ 0،5 مع 0.2٪ L-أرابينوز لمدة 3 ساعة عند 37 ° C.
2. بعد تحلل الخلايا والطرد المركزي كما في الخطوة 1.3، وبيليه معلق في الغشاء TSG20 العازلة عند تركيز النهائي من 5 ملغ / مل. وsolubilized المواد مع 1٪ ث / ت ن دوديسيل-β-maltopyranoside (DDM) لمدة 3 ساعة في 4 درجات مئوية مع الهز لطيف.
3. تتم إزالة المواد غير القابلة للذوبان بواسطة الطرد المركزي المتطرفة كما في الخطوة 1.3 و طاف يحتوي على solubilized يتم جمع ₂ MalFGK معقدة وتنقيته كما في الخطوة 1.4، ولكن من دون غسيل الكلى.
4. ابعد من ذلكويتحقق عن طريق تنقية ص الكروماتوغرافيا الترشيح في المخزن المؤقت TSGD على HR 200 Superdex 10/300 في العمود معدل تدفق 0.5 مل / دقيقة.

3. إعداد من الدهون الفوسفاتية

1. وE. القولونية الليبيدات الكلية الذائبة في استخراج كلوروفورم يتم فصل إلى 1000 نانومول مأخوذة في أنابيب المسمار microfuge الغطاء. يبخر المذيب تحت تيار لطيف من النيتروجين وتجفيفها في ليلة وضحاها مزيد من فراغ مجفف.
2. يذوب الدهون في الفيلم TS العازلة في تركيز نانومتر 5 انتهاء الوقت وvortexed بقوة وsonicated. سوف تظهر الدهون المذابة مبهمة قليلا بسبب الذوبان بهم في العام العازلة TS المائي، ولكنها ينبغي أن تظل في التعليق. يضاف إلى DDM تركيز النهائي من 0.5٪ (~ 10 ملم)، حيث يصبح الحل واضح.
3. يتم وضع الخليط الدهون في حمام مائي والنبض sonicated لمدة 5 ثوانى مرات عن 5 ~. يتم تخزين الدهون في الخليط C ° 4 لأقصى 1 ويك.

4. إعداد الحيوية الخرز

1. حوالي 10-15 مل (حجم الجافة) يتم وضع الخرز الحيوية في أنبوب 50 مل.
2. تغسل حبات تباعا مع 50 مل من الميثانول بنسبة 100٪، والإيثانول 95٪، milliQ H O _2، وأخيرا TS العازلة (مرتين لكل منهما).
3. يتم تخزين حبات غسلها عند 4 ° C ~ 10 في المخزن المؤقت TS مل.

5. Nanodisc إعادة إعماره

1. وتضعف MSP في المخزن المؤقت TSGD في تركيز النهائي من ملغ 7 ~ / مل (~ 0.3 مم).
2. يتم خلط ~ 2 نانومول مجمع تنقية ₂ MalFGK في البروتين: MSP: نسبة الدهون من 1:3:60 أو 1:3:400 في المخزن المؤقت TSGD. تركيز النهائي هو 6 ميكرومتر MalFGK _{2 و} 18 ميكرومتر والدهون MSP ميكرومتر 360 (1:3:60) أو 2.4 ملي الدهون (1:3:400). الحجم النهائي هو 300 ميكرولتر. تركيز DDM النهائي هو 0.08٪ (~ 1.6 مم). تركيز النهائي من الجلسرين يعتمد على مقدار من الدهون المضافة ولكن لا يزال حوالي 5-10٪ V / V.
3. ~ تم إضافة 50 ميكرولتر من الحيوية حبة التعليق على أنبوب وحضنت الخليط بين عشية وضحاها على طاولة هزاز في C. ° 4
4. وsedimented حبات عن طريق الجاذبية وpipetted الحل من خلال معلومات سرية لتجنب ضيق بقدر الحيوية الخرز ممكن.
5. يتم إزالة رواسب كبيرة بواسطة الطرد المركزي المتطرفة في 100،000 x ج لمدة 20 دقيقة. وتنقيته من الأقراص الكروماتوغرافيا الترشيح كما في الخطوة 2.4 في TSG10 العازلة. يتم تجميع الكسور التي تحتوي على أقراص وينبغي أن يكون قسامة إعادة حقن على عمود هلام نفس الترشيح لاختبار استقرار الإعداد.
6. يمكن للأقراص تنقية تخزينها في -70 ° C لفترة طويلة من الزمن. بعد ذوبان الجليد على ذلك، ينبغي إخضاع أقراص لالطرد المركزي المتطرفة كما في الخطوة 5.5 إلى إزالة رواسب المحتملة. ينبغي تحليل وقسامة من الترشيح هلام اللوني لضمان تجميع كبيرة أو هطول الأمطار لم يحدث خلال الذوبانالعملية.

6. الأم جل الكهربائي

1. ويتم تحليل من 1 ميكرومتر nanodiscs (حوالي 0.2 ملغ / مل) في الصفحة الأصلية ^{6، 7} (تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.8، 4-12٪) لتقييم جودة إعادة (الشكل 3A).
2. كما يتم تقييم الربط من الذكور (1 ميكرومتر) إلى MalFGK _2-معقدة تشكيلها في nanodiscs من قبل الناطقين PAGE (الشكل 3A).
3. بعد الكهربائي، اتسخت لهلام مع الأزرق لمدة 10 دقيقة Coomassie، وdestained للساعة 1 ~.

7. ديناميكية تشتت الضوء (DLS)

1. وتنقيته من Nanodiscs الكروماتوغرافيا الترشيح كما في الخطوة 2.4 في TSG10 العازلة باستخدام إلي 200 Superdex HR 10/300 في العمود معدل تدفق 0.1 مل / دقيقة. يتم تجميع الكسور التي تحتوي على nanodiscs وركزوا على 10 ملغ ~ / مل مع مرشح Amicon الطرد المركزي.
2. يتم تصفية العينة مرتين (0.22 ميكرون فلتر) قبل التحليل باستخدام DLSوnanostar DynaPro صك (وايت التكنولوجيا) في (أ) 1 ميكرولتر حجم كوفيت الكوارتز الداخلية. تم تجهيز البيانات باستخدام برنامج DYNAMICS (وايت التكنولوجيا) لتقدير القطر والوزن الجزيئي للجزيئات.

8. قياسات أتباز

1. يتم تحديد النشاط أتباز من MalFGK _{2-المعاد} nanodiscs باستخدام مقايسة اللونية ^8.
2. يتم خلط 1 ميكرومتر من الأقراص تنقية و 1 ملي ATP مع كميات متزايدة من C ذكر وحضنت عند 37 درجة لمدة 20 دقيقة. يتم قياس الافراج عن الفوسفات غير العضوي في 660 نيوتن متر.
3. تتم مقارنة كمية الفوسفات المفرج عنهم إلى منحنى القياسية ولدت مع الفوسفور حل قياسي.

9. ممثل النتائج

وتنقيته من nanodiscs بواسطة الكروماتوغرافيا الترشيح (الشكل 2A، اليسار). وكروماتوغرام يدل على أن الغالبية العظمى من د المعادISCS (أسود التتبع) أزل باعتبارها ذروة واحدة، في حين أن الأقراص المصنوعة من الدهون الزائدة (أحمر التتبع) أزل في حجم الفراغ ونتيجة لسلسلة من القمم واسعة. ويتم تحليل مزيد من نوعية nanodiscs من الأم الكهربائي للهلام وديناميكية تشتت الضوء الطيفي (DLS). أقراص المعاد بشكل صحيح كما ترحيل فرقة حادة على هلام في حين أن أعيد تشكيلها في وجود فائض من الدهون وترحيل مسحة (2A الشكل، والحق). تحليل DLS يدل على أن السكان القرص متجانسة ذات قطر متوسط ​​قدره 11.4 نانومتر (الشكل 2B). الأقراص المعاد يكون لها الوزن الجزيئي واضح من 215 كيلو دالتون على أساس تقريب DLS. عرض على نطاق واسع في تشكيل العينات وجود الدهون الزائدة حول كعبرة 100 نانومتر، والتي هي نموذجية لغير متجانسة العينات.

ويتم تقييم نوعية معقدة من ₂ MalFGK الأصلية جل الكهربائي ونشاطها من خلال أتبازقياسات (الشكل 3). والمالتوز ذكر بروتين ملزمة يتحد مع تقارب عالية لنقل ₂ MalFGK ^{9 و 10.} استخدام غير يبدل طبيعة الكهربائي للهلام، فمن الممكن الكشف عن مجمع بين الذكر وMalFGK ₂ (الشكل 3A). يظهر تحفيز النشاط أتباز ذالك ₂ من الذكور في الشكل 3B.

الشكل 1. مخطط نموذجي لبروتوكول إعادة.

الشكل 2. مراقبة جودة إعداد nanodisc. A. تشكيل هلام تحليل الترشيح (200 Superdex HR 10 / عمود 300) من نسبة الدهون في nanodiscs منخفضة (1/3/60؛ التتبع أسود) أو ارتفاع نسبة الدهون (1/3/400؛ التتبع الحمراء). الأم الكهربائي للهلام لإعداد القرص نفسه. موليشار إلى علامات الوزن ecular في كيلو دالتون. B. تشتت الضوء الحيوي تحليل إعداد القرص نفسه. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 3. تحليل MalFGK _2-nanodisc الجسيمات. A. هلام تحليل التحول من ذكر حضنت مع كميات متزايدة من الجزيئات _2-nanodisc MalFGK. B. ATPase النشاط من MalFGK _2-nanodisc جزيئات بوصفها وظيفة من تركيز ذكر.

وصفنا إجراء بسيط لإعادة تشكيل المالتوز في نقل nanodiscs. الناقل هو أتباز نشطة ويمكن أن يعاد التفاعل مع شريك ذكر ملزمة للذوبان (الشكل 3). إعادة تشكيل ناجحة للنقل في nanodiscs فتح الطريق لتحليل إضافية البيوفيزيائية والكيميائية الحيوية. سوف تكون ذات أهمية خاصة في التحليل المنهجي أتباز ذالك والمالتوز نشاط النقل في صناعة المنظفات، وnanodiscs الحويصلية. نقل ABC تغيير التشكل خلال دورة النقل ولكن مساهمة الدهون لهذه التغييرات متعلق بتكوين ما زال يتعين اكتشافها.

صنع في nanodisc بسيط نسبيا، ولكن الانحرافات صغيرة من الظروف المثلى يمكن أن يؤدي إلى تجميع البروتين لا يشفى منه. في هذا التقرير، نؤكد على أهمية اختيار البروتين الصحيح: نسبة الدهون لأن الدهون كميات زائدة من شأنها أن تؤدي إلى الانتاج:ن من الجسيمات الحويصلية الكبيرة مثل polydisperse التي لا تستجيب للتأهيل البيوفيزيائية من nanodisc. A التحليل السابق يعمل MSP عالية جدا: نسبة الدهون لإعادة تشكيل نقل المالتوز (1/120 مقارنة ب 20/1 في تحليلنا) ولكن لم يتم تشكيل الجزيئات كذلك تتميز ^11. في أي حال، لا بد من تحليل دقيق للجودة المواد المعاد باستخدام تقنيات أخرى من الترشيح هلام، مثل تشتت الضوء الطيفي، تنبيذ فائق التحليلية أو ببساطة أكثر، الأم الكهربائي للهلام. تم تسليط الضوء على أهمية هذا لمراقبة الجودة خلال إعادة تشكيل رودوبسين جرثومي وف بروتين سكري ^12. يمكن معلمتين أخرى تؤثر بشكل كبير على نجاح إعادة: 1) نقاء الهدف البروتين الغشاء وعدم وجود المجاميع و2) نسبة البروتين الصحيح بين الغشاء والبروتين سقالة. وبالإضافة إلى ذلك، ونوع من فسفوليبيد أدرجت طn لالقرص، فضلا عن طول البروتين سقالة الغشاء، يمكن أن تسهم في كفاءة إعادة. قد معلمات أخرى مثل ذوبان والاستقرار من البروتين الغشاء في محلول منظف، والنظام الوقائي، ودرجة الحرارة وطول الوقت لإعادة بحاجة أيضا إلى تعديل عند تحسين بروتوكول إعادة. على سبيل المثال، البروتينات الغشاء سقالة من أطوال مختلفة تنتج nanodiscs من مختلف الأحجام ^1، والتي يمكن أن تساعد في إعادة تشكيل أكبر المجمعات البروتين الغشاء أو oligomers البروتين الغشاء.

تم بنجاح جنبا إلى جنب مع nanodisc أساليب البيوفيزيائية SPR من هذا القبيل، ITC، والتحليل الطيفي مضان ^12-16 للمساعدة في البحث الغشاء الذي يكافح مع المنهجية الكمية. مؤخرا، تم الجمع بين nanodisc مع مطياف الكتلة الكمية للمساعدة في تحديد interactomes البروتين الغشاء مع تغطية أفضل ودقة17. كان محدودا صناعة الأدوية من نفس الصعوبات التي يعاني منها الأوساط الأكاديمية في دراسة بروتينات الغشاء، على الرغم من أنه هو حقيقة أن أكثر الأدوية الشائعة وصفه البروتينات الغشاء الهدف (المستقبلات، وقنوات، نقل، وأجهزة الاستشعار). ويمكن توقع أن nanodisc سيساعد تطوير استراتيجيات فحص المخدرات التي تعمل مع بروتينات الغشاء المضمنة.

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وأيد هذا العمل من قبل المعهد الكندي للبحوث الصحية. وقد تم تمويل CSC زمالة ما بعد الدكتوراه من من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا. FD هو المستوى الثاني للبحوث كندا الرئاسة.