Western Blotting Utilizzando il Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Questo articolo descrive una tecnica standard occidentale-blotting utilizzando la procedura disponibile sul mercato elettroforesi NuPAGE Mini-Gel sistema da Invitrogen.

Western Blotting (o immunoblotting) è una procedura standard di laboratorio che consente agli investigatori di verificare l'espressione di una proteina, determinare la quantità relativa delle proteine ​​presenti in diversi campioni, e analizzare i risultati di esperimenti di co-immunoprecipitazione. In questo metodo, una proteina bersaglio viene rilevata con un anticorpo primario specifico in un dato campione di tessuto omogenato o estratto. Separazione delle proteine ​​in base al peso molecolare è realizzato utilizzando denaturazione SDS-PAGE. Dopo il trasferimento di una membrana, la proteina bersaglio è sondato con uno specifico anticorpo primario e rilevati da chemiluminescenza.

Fin dalla sua prima descrizione, la tecnica Western-blotting ha subito diversi miglioramenti, tra cui prefabbricati gel e di facile utilizzo dell'apparecchiatura. Nel nostro laboratorio, abbiamo scelto di utilizzare il commercio sistema di elettroforesi NuPAGE da Invitrogen. Si tratta di un innovativo pH neutro, discontinuo SDS-PAGE, prefabbricati mini-gel sistema. Questo sistema presenta diversi vantaggi rispetto alla tecnica tradizionale Laemmli tra cui: i) una maggiore durata di conservazione dei prefabbricati gel che vanno da 8 mesi a 1 anno, ii) una vasta gamma di separazione pesi molecolari 1-400 kDa a seconda del tipo di gel utilizzati, e iii) una maggiore versatilità (intervallo di percentuale di acrilamide, il tipo di gel, e la composizione ionica del tampone di corsa).

La procedura descritta in questo articolo il video utilizza il Bis-Tris sistema discontinuo buffer con 4-12% Bis-Tris gradiente di gel e MES esecuzione tampone, come illustrazione di come eseguire un western-blot utilizzando il sistema NuPAGE Invitrogen elettroforesi. Nel nostro laboratorio, abbiamo ottenuto buoni risultati e riproducibili per varie applicazioni biochimiche con questo metodo western blotting.

Gel elettroforesi

Nota tecnica: Prima di iniziare la procedura, i vostri campioni di proteine ​​pronto.

Durante questa prima fase, le proteine ​​nel campione sono separati in base al loro peso molecolare mediante elettroforesi su gel denaturante di poliacrilammide (PAG). Il NuPAGE ® Sample Buffer LDS caricato con solfato di litio Dodecyl (LDS) mantiene in uno stato di polipeptidi denaturati una volta il campione è stato riscaldato a 70 ° C per 10 minuti. Un forte agente riducente viene utilizzato in combinazione per rimuovere la struttura secondaria e terziaria (DTT, per rompere i legami disolfuro). Inoltre, le proteine ​​del campione si ricoprono in carica negativa LDS e quindi passare attraverso le maglie del gel acrilamide verso l'elettrodo con carica positiva. Questo permette la loro separazione in base al peso molecolare (misurato in Dalton chilo, kDa).

Dettagliate passo-passo i protocolli per la preparazione del campione e la procedura PAGE si possono trovare sul sito Invitrogen ^2, o nella guida tecnica NuPAGE ^3.

Consigli tecnici

1. Nel NuPAGE Invitrogen Bis-Tris sistema discontinuo buffer, la mobilità elettroforetica delle proteine ​​e la gamma successiva separazione del gel dipende da due fattori: i) la concentrazione acrylamid del gel (con una maggiore concentrazione di acrilamide traduce in una migliore risoluzione di minori peso molecolare delle proteine) e ii) lo ione finale del tampone di corsa, MOPS o MES. Di scegliere la combinazione appropriati per la gamma di separazione che si desidera ottenere, fare riferimento alla tabella di migrazione Gel ^1. Lo spessore del gel e il numero di pozzi dipende dal volume e la quantità di campioni che si prevede di carico, rispettivamente.
2. Quando si carica i campioni nei pozzetti del gel, almeno una corsia è riservata ad un marcatore di peso molecolare (o scala). Questi standard proteine ​​sono disponibili in commercio da più aziende e in genere costituiti da una miscela di proteine ​​macchiato aver definito pesi molecolari, in modo da formare bande visibili che consentono di seguire l'avanzamento della migrazione. Scegli una gamma di pesi molecolari che sia compatibile con la risoluzione gel.
3. Per ottenere un modello migratorio bella e anche noi consigliamo di caricare tutti i pozzi del gel con un volume analogo di campione o 1X tampone campione LDS.

Trasferimento

Nota tecnica: Prima di iniziare la fase di trasferimento, preparare il buffer di trasferimento (1X con il 10% metanolo) e pre-raffreddamento a 4 ° C in una stanza fredda.

Al fine di rendere le proteine ​​accessibile al rilevamento degli anticorpi, essi sono trasferiti da elettroblotting dal gel su una membrana di nitrocellulosa. Il legame alle proteine ​​è basata su interazioni idrofobiche, così come le interazioni di carica tra la membrana e proteine.

(Polivinilidene fluoruro (PVDF), membrana può anche essere usato come alternativa. In questo caso, la membrana PVDF deve essere pre-umido in metanolo per almeno 30 secondi prima dell'uso.)

Una dettagliata passo-passo protocollo della procedura di trasferimento può essere trovato in riferimento 4 se si utilizza il Bio-Rad Mini Trans-Blot cella elettroforetica di trasferimento, o nei riferimenti 2-3 se il laboratorio è dotato della Invitrogen XCell II ™ Blot Module.

Come risultato di questo processo, le proteine ​​sono esposte su un sottile strato superficiale e pronto per il rilevamento. L'efficacia complessiva uniformità e di trasferimento delle proteine ​​dal gel alla membrana possono essere controllate dalla colorazione della membrana tingere i reversibile Ponceau S.

Colorazione Ponceau S procedura (opzionale):

1. Dopo aver trasferito le proteine, la membrana posto in un vassoio di incubazione (proteine ​​rivolto verso l'alto).
2. Aggiungere abbastanza colorazione Ponceau S per coprire la membrana e incubare almeno 30 secondi e scuotendo con cautela.
3. Risciacquare con acqua distillata membrana fino a quando il fondo è chiara.
4. Decolorare la membrana con acqua distillata per 2-3 minuti.
5. Posizionare la membrana nella soluzione bloccante (vedi sotto).

Suggerimenti tecnici:

1. Si consiglia di etichettatura la membrana con una matita prima del trasferimento delle proteine ​​al fine di indicare il lato in cui sono state esposte le proteine ​​e l'orientamento dei tuoi campioni.
2. Entrambi Ponceau S colorazione e gli indicatori peso molecolare può essere utilizzata per tagliare la membrana dopo il trasferimento per sondare le parti risultante con anticorpi

Immunolocalizzazione:

Nota tecnica: questa procedura immunolocalizzazione viene fornito come direttiva. Ottimizzazione può essere richiesto per ogni formicaibody; informazioni specifiche si possono trovare nella maggior parte delle schede tecniche degli anticorpi commercialmente disponibili (ad esempio, di lavoro di diluizione, tempo di incubazione, ecc.)

Durante questo ultimo processo, la proteina bersaglio verrà rilevato utilizzando un anticorpo specifico e apparirà come una fascia sulla pellicola. La posizione della band è dipendente del peso molecolare della proteina bersaglio, mentre l'intensità banda dipende dalla quantità di proteina presente obiettivo.

In genere, questa si ottiene dopo tre sottofasi:

1. Blocco: per evitare la mancanza di specifiche interazioni degli anticorpi con la membrana (lo spazio in eccesso sulla membrana è ricoperta con una soluzione diluita di una proteina generica).
2. Probing: La proteina di interesse viene rilevato da uno specifico anticorpo primario . Dopo l'anticorpo primario non legato viene lavato via, la membrana è esposta a un anticorpo diversa legata al giornalista enzimi , perossidasi di rafano (HRP). Questo anticorpo secondario è diretto contro la specie-specifica porzione di anticorpo primario (ad esempio un anticorpo anti-coniglio secondari si legano a tutti i conigli di origine anticorpo primario).
3. Rilevamento: Un agente chemiluminescenza è usato come substrato che luminesce se esposti alla HRP sui anticorpo secondario. Questa reazione produce luminescenza in luogo e in proporzione alla quantità di proteine ​​sondato. La luce viene poi rilevata da pellicola fotografica.

Un generico passo-passo procedura è fornito di seguito. Altre procedure dettagliate si possono trovare nel ECL Plus Western Blotting di rilevamento manuale di istruzioni reagenti ⁵ o nella maggior parte scheda tecnica che accompagna gli anticorpi disponibili in commercio. Tempo di incubazione, diluizione degli anticorpi, e il blocco e soluzioni di lavaggio devono essere empiricamente ottimizzate per ogni anticorpo.

Immunolocalizzazione procedura:

1. Bloccare il legame aspecifico incubando con un volume sufficiente di soluzione di caseina PBS 1% di blocco per coprire l'intera membrana. Posto su una sedia a dondolo per almeno 30 minuti a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C.
2. Incubare la membrana con il tuo anticorpo primario (specifico per la proteina di interesse). L'anticorpo primario deve essere diluito in soluzione di bloccaggio. Per la maggior parte degli anticorpi, legame completo si ottiene dopo 1-2 ore di incubazione a temperatura ambiente sotto agitazione. In alternativa, la fase di incubazione può essere eseguita durante la notte a 4 ° C per aumentare il rapporto segnale-rumore.
3. Rimuovere la soluzione (scartare o tenere a 4 ° C a -20 ° C per uso ripetuto) e lavare rapidamente la membrana una sola volta. Poi 3X10 minuti con PBS, 0,05% Tween 20 (PBST) a temperatura ambiente con agitazione vigorosa.
4. Incubare la membrana con una HRP-coupled anticorpo secondario diluito in soluzione di bloccaggio. Scegli un anticorpo che riconosce la porzione IgG della specie in cui è cresciuta l'anticorpo primario. L'incubazione è effettuata per 1 ora a temperatura ambiente sotto agitazione.
5. Scartare la soluzione e lavare rapidamente la membrana una sola volta. Poi 3X10 minuti con PBST a temperatura ambiente con agitazione vigorosa.
6. Procedere alla rilevazione chemiluminescenza secondo le istruzioni del produttore. Usiamo il reagenti ECL Plus occidentale Detection Blotting di GE Healthcare (vedi riferimento 5 per istruzioni specifiche).
7. Posizionare la membrana in pellicola trasparente o un sacchetto e posto all'interno di una cassetta autoradiografia. Assicurati di drenare il liquido in eccesso e rimuovere tutte le bolle d'aria.
8. Esporre la pellicola fotografica a membrana in una stanza buia. Inizia con un tempo di esposizione 1 minuto e regolare in base all'intensità del segnale desiderato.

Suggerimenti tecnici:

1. Blocco di legame non specifico si ottiene mettendo la membrana in una soluzione diluita di proteine. Usiamo tipicamente l'1% di caseina, ma sieroalbumina bovina (~ 2% BSA) o non-grassa del latte secco (~ 5%) può essere utilizzato come alternativa.
2. Tris-Buffered Saline (TBS) può essere utilizzato durante tutta la procedura, invece di PBS. Si consiglia di utilizzare TBS se avete intenzione di sondare la membrana con anticorpi phosphospecific.
3. L'utilizzo di un bagliore-in-the-dark adesivo (ad esempio, è Stratagene Glogos ® II Markers Autorad) filettato sul fondo della cassetta autoradiografia vi aiuterà ad allineare il tuo film e la membrana durante la fase di analisi.

Analisi

Ora che avete esposto il vostro film, vi renderete conto che in termini pratici, non tutti i western di proteine ​​rivelano come una banda bel singolo. Additionabande l può anche apparire a causa del legame aspecifico degli anticorpi primario e secondario. Questo segnale di fondo può essere ridotto attraverso l'ottimizzazione della procedura di immunolocalizzazione. Inoltre, un controllo appropriato (ad esempio, le cellule untransfected, siRNA cellule trattate, ecc) sarà utile per determinare la specificità del vostro anticorpi e la posizione esatta della proteina bersaglio sulla membrana.

Dopo la marcatura sulla pellicola la posizione delle bande colorate standard di proteine ​​di membrana, la trama il log di ogni peso molecolare degli standard di proteine ​​(asse y) contro la loro mobilità corrispondente relativa (asse x). Mobilità relativa (Rf) è il termine utilizzato per il rapporto tra la distanza della proteina si è spostato dal suo punto di origine (parte superiore del gel) rispetto alla distanza del colorante inseguimento o un pennarello a basso peso molecolare è stato spostato (la parte anteriore gel) . Determinare la retta di regressione della curva standard per ottenere valori di pendenza e intercetta. Il peso molecolare sconosciuto (dimensione) della proteina bersaglio è stimato utilizzando il suo Rf e la seguente equazione modificata:

log = peso molecolare (pendenza) (mobilità o Rf della proteina bersaglio) + y intercetta

(Vedi riferimento 6 per istruzioni dettagliate).

Approssimazioni livello di espressione sono prese confrontando l'intensità banda della proteina bersaglio a quella di una proteina strutturale (per esempio, tubulina e actina) o di un prodotto come il gene housekeeping GAPDH. Questo cosiddetto "controllo di carico" non dovrebbe cambiare tra i campioni e si rivela con uno specifico anticorpo primario. L'immagine può essere ulteriormente analizzato da densitometria per valutare la quantità relativa di colorazione delle proteine ​​e quantificare i risultati in termini di densità ottica.

La procedura qui presentata usa un gel Bis-Tris con MES esecuzione buffer come un esempio di denaturazione PAGINA utilizzando il sistema di elettroforesi Invitrogen NuPAGE Novex. Inoltre, questo pre-cast sistema gel permette la separazione delle proteine ​​in denaturazione o non denaturazione condizioni e ospita una vasta gamma di pesi molecolari (1-200 kDa per il gel Bis-Tris di 36-400 kDa per la Tris- gel acetato). A seconda del vostro esperimento, si può scegliere di seguire solo una parte della tecnica di western blotting qui descritte e l'uso diretto procedure di colorazione gel (ad esempio, argento o colorazione Coomassie) o un metodo immunolocalizzazione alternativo (ad esempio, colorimetrica o fluorescente).

Noi abitualmente utilizza il sistema di elettroforesi Invitrogen NuPAGE Novex nel nostro laboratorio per varie applicazioni, alcuni esempi che si possono trovare nei riferimenti 7-9.