Western blot en utilisant l'Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels

Cet article technique décrit un standard occidental buvard procédure en utilisant l'électrophorèse commercialement disponibles NuPAGE Mini-Gel du système d'Invitrogen.

Western Blot (ou immuno-) est une procédure standard de laboratoire permettant aux enquêteurs de vérifier l'expression d'une protéine, de déterminer la quantité relative de la protéine présente dans les différents échantillons, et d'analyser les résultats des expériences de co-immunoprécipitation. Dans cette méthode, une protéine cible est détectée avec un anticorps primaire spécifique dans un échantillon donné d'homogénat de tissu ou de l'extrait. Séparation des protéines selon leur poids moléculaire est réalisé en utilisant dénaturant SDS-PAGE. Après transfert sur une membrane, la protéine cible est sondée avec un anticorps spécifique primaire et détecté par chimioluminescence.

Depuis sa première description, la technique de western-blot a subi plusieurs améliorations, dont préfabriqués gels et conviviale de l'équipement. Dans notre laboratoire, nous avons choisi d'utiliser le système NuPAGE commercialement disponible chez Invitrogen électrophorèse. Il s'agit d'un pH neutre, innovant, discontinue SDS-PAGE, préfabriqués mini-système de gel. Ce système présente plusieurs avantages par rapport à la technique traditionnelle de Laemmli notamment: i) une durée de conservation des gels préfabriqués allant de 8 mois à 1 an; ii) une gamme de séparation éventail de poids moléculaires de 1 à 400 kDa selon le type du gel utilisé, et iii) une plus grande polyvalence (gamme de pourcentage d'acrylamide, le type de gel, et la composition ionique du tampon d'exécution).

La procédure décrite dans cet article la vidéo utilise le système de tampon Bis-Tris discontinue avec 4-12% de Bis-Tris gels de gradient et MES courir tampon, comme une illustration de la façon d'effectuer un test western blot-en utilisant le système d'Invitrogen électrophorèse NuPAGE. Dans notre laboratoire, nous avons obtenu de bons résultats et reproductible pour diverses applications biochimiques en utilisant cette méthode western-blot.

L'électrophorèse sur gel

Note technique: Avant de commencer la procédure, vous avez votre échantillons de protéines prêt.

Durant cette première étape, les protéines de l'échantillon sont séparés selon leur poids moléculaire en utilisant électrophorèse sur gel dénaturant de polyacrylamide (PAGE). Le Tampon NuPAGE ® échantillon LDS chargé avec dodécyl sulfate de lithium (LDS) maintient polypeptides dans un état ​​dénaturé fois l'échantillon de protéine a été chauffé à 70 ° C pendant 10 minutes. Un agent réducteur fort est utilisé en conjonction d'enlever la structure secondaire et tertiaire (TNT, pour rompre les liaisons disulfure). En outre, les protéines de l'échantillon se recouvrent dans la LDS chargés négativement et donc passer à travers les mailles du gel d'acrylamide vers l'électrode chargée positivement. Cela permet leur séparation en fonction du poids moléculaire (mesurée en Daltons kilo, kDa).

Détaillées étape par étape, des protocoles pour la préparation de l'échantillon et la procédure page se trouve sur le site Invitrogen ^2, ou dans le guide NuPAGE technique ^3.

Conseils techniques

1. Dans le système d'Invitrogen NuPAGE Bis-Tris discontinue tampon, la mobilité électrophorétique des protéines et la gamme séparation ultérieure du gel dépend de deux facteurs: i) la concentration d'acrylamide du gel (avec une plus grande concentration d'acrylamide résultant en une meilleure résolution de la baisse des poids moléculaire des protéines) et ii) l'ion de fuite de la mémoire tampon de la course, MOPS ou MES. Pour choisir la combinaison appropriée pour la gamme de séparation que vous voulez atteindre, se référer au tableau migration du gel ^1. L'épaisseur du gel et du nombre de puits dépendra du volume et la quantité d'échantillons que vous envisagez de charge, respectivement.
2. Lorsque vous chargez vos échantillons dans les puits du gel, au moins une voie est réservée pour un marqueur de poids moléculaire (ou échelle). Ces normes de protéines sont disponibles commercialement auprès de plusieurs entreprises et sont généralement constitués d'un mélange de protéines colorées avoir défini poids moléculaire, de manière à former des bandes visibles qui vous permettent de suivre la progression de la migration. Choisissez une gamme de poids moléculaire qui est compatible avec la résolution de votre gel.
3. Pour parvenir à un modèle de migration de Nice et même, nous recommandons de charger tous les puits de votre gel avec un volume similaire de l'échantillon ou du tampon 1X échantillon LDS.

Transfert

Note technique: Avant de commencer l'étape de transfert, de préparer le tampon de transfert (1X avec du méthanol à 10%) et de pré-refroidir à 4 ° C dans une chambre froide.

Afin de rendre les protéines accessibles à la détection d'anticorps, ils sont transférés par électrotransfert du gel sur une membrane de nitrocellulose. La liaison aux protéines est basée sur des interactions hydrophobes, ainsi que des interactions de charges entre la membrane et les protéines.

(Polyfluorure de vinylidène (PVDF) peut également être utilisé comme une alternative. Dans ce cas, la membrane de PVDF doit être pré-humide dans le méthanol au moins 30 secondes avant l'utilisation.)

Un détail, étape par étape, le protocole de la procédure de transfert peut être trouvée dans la référence 4 si vous utilisez le Bio-Rad Mini Trans-Blot cellule de transfert électrophorétique, ou dans les références 2-3 si votre laboratoire est équipé de l'Invitrogen XCell II ™ Blot Module.

En conséquence de ce processus, les protéines sont exposées sur une mince couche de surface et prêt pour la détection. L'efficacité globale de l'uniformité et le transfert de protéines à partir du gel à la membrane peut être vérifiée par une coloration de la membrane réversibles Ponceau S colorant.

La procédure de coloration Ponceau S (facultatif):

1. Après le transfert des protéines, placer la membrane dans un bac d'incubation (protéines vers le haut).
2. Ajouter suffisamment de coloration Ponceau S pour couvrir la membrane et incuber au moins 30 secondes avec une légère agitation.
3. Rincer la membrane avec de l'eau distillée jusqu'à ce que le fond est clair.
4. Décolorer la membrane avec beaucoup d'eau distillée pendant 2-3 minutes.
5. Placer la membrane dans une solution de blocage (voir ci-dessous).

Conseils techniques:

1. Nous recommandons l'étiquetage de vos membrane avec un crayon avant le transfert de protéines afin de désigner le côté dans laquelle les protéines ont été exposées et l'orientation de vos échantillons.
2. Les deux taches Ponceau S et les marqueurs de poids moléculaire peut être utilisé pour couper la membrane après le transfert pour sonder les parties résultant avec différents anticorps

Immunodétection:

Note technique: Cette procédure immunodétection est fournie uniquement à titre indicatif. L'optimisation peut être exigée pour chaque fourmiiBODY; informations spécifiques peuvent être trouvées dans la plupart des fiches de données de l'anticorps disponibles dans le commerce (par exemple, le travail de dilution, le temps d'incubation, etc.)

Pendant ce dernier procédé, la protéine cible sera détecté en utilisant un anticorps spécifique et apparaîtra comme une bande sur le film. La position de la bande dépend du poids moléculaire de la protéine cible, tandis que l'intensité bande dépend de la quantité de protéine présente cible.

Typiquement, ceci est réalisé au bout de trois sous-étapes:

1. Blocage: Afin d'éviter des interactions non spécifiques de l'anticorps avec la membrane (l'espace excédentaire sur la membrane est recouverte d'une solution diluée d'une protéine de génériques).
2. Sondage: La protéine d'intérêt est détecté par un particulier d'anticorps primaires . Après l'anticorps primaires non liés est emporté, la membrane est exposée à un anticorps différent lié à la journaliste de l'enzyme , la peroxydase de raifort (HRP). Cet anticorps secondaire est dirigé contre la partie spécifique à l'espèce de l'anticorps primaire (par exemple un anticorps secondaire anti-lapin va se lier à n'importe quel lapin provenant d'anticorps primaires).
3. Détection: Un agent de chimiluminescence est utilisé comme un substrat qui luminescence lorsqu'ils sont exposés à l'HRP sur l'anticorps secondaire. Cette réaction produit de luminescence en place et en proportion de la quantité de protéines sondé. La lumière est ensuite détecté par un film photographique.

Un générique étape par étape la procédure est fournie ci-dessous. Autres procédures détaillées peuvent être trouvées dans la détection ECL Plus occidentaux manuel d'instruction Blotting Réactifs ⁵ ou dans la plupart des data-sheet accompagnant les anticorps disponibles dans le commerce. Le temps d'incubation, dilution de l'anticorps, et de blocage et des solutions de lavage doivent être empiriquement optimisés pour chaque anticorps.

Procédure d'immunodétection:

1. Bloquer la liaison non-spécifique par incubation avec un volume suffisant de solution de PBS à 1% de caséine bloquant pour couvrir toute la membrane. Placer sur une bascule pour au moins 30 min à température ambiante ou une nuit à 4 ° C.
2. Incuber la membrane avec votre anticorps primaire (spécifique pour la protéine d'intérêt). L'anticorps primaire doit être dilué dans une solution de blocage. Pour la plupart des anticorps, liaison complète est réalisée après 1-2 heures d'incubation à température ambiante sous agitation douce. Alternativement, l'étape d'incubation peut être effectuée durant la nuit à 4 ° C pour augmenter le rapport signal sur bruit.
3. Retirer la solution (jeter ou conserver à 4 ° C à -20 ° C pour une utilisation répétée) et laver rapidement la membrane une seule fois. Puis 3X10 minutes avec du PBS, 0,05% de Tween 20 (PBST) à température ambiante avec une agitation vigoureuse.
4. Incuber la membrane avec un anticorps secondaire couplé HRP dilué dans une solution de blocage. Choisissez un anticorps qui reconnaît la partie IgG de l'espèce où l'anticorps primaire a été soulevée. L'incubation est réalisée pendant 1 heure à température ambiante sous agitation douce.
5. Jeter la solution et laver rapidement la membrane une seule fois. Puis 3X10 minutes avec PBST à température ambiante avec une agitation vigoureuse.
6. Procéder à la détection chimioluminescente selon les instructions du fabricant. Nous utilisons des réactifs de détection ECL Plus occidentaux Blotting de GE Healthcare (voir référence 5 pour des instructions spécifiques).
7. Placez votre membrane en saran ou une poche et place à l'intérieur d'une cassette autoradiographie. Assurez-vous de drainer tout excès de liquide et de supprimer toutes les bulles d'air.
8. Exposer la pellicule photographique à la membrane dans une pièce sombre. Commencez avec un temps d'exposition 1 minute et ajuster en fonction de l'intensité du signal désiré.

Conseils techniques:

1. Blocage de la non-fixation spécifique est réalisé en plaçant la membrane dans une solution diluée de protéines. Nous utilisons généralement caséine à 1%, mais l'albumine sérique bovine (~ 2% de BSA) ou de lait écrémé sec (~ 5%) peut être utilisé comme une alternative.
2. Tris-Buffered Saline (SCT) peut être utilisé tout au long de la procédure au lieu de PBS. Nous recommandons l'utilisation du SCT si vous envisagez d'explorer votre membrane avec l'anticorps phosphospecific.
3. L'utilisation d'une lueur dans le noir autocollant (par exemple, Stratagene Glogos ® II Marqueurs Autorad) taraudés dans le fond de la cassette autoradiographie vous aidera à harmoniser vos films et vos membrane lors de l'étape d'analyse.

Analyse

Maintenant que vous avez exposé votre film, vous vous rendrez compte que, en termes pratiques, tous les westerns révèlent que la protéine une seule bande de Nice. Additionales bandes L peut aussi apparaître à cause de la liaison non spécifique des anticorps primaires et secondaires. Ce signal de fond peut être réduite en optimisant la procédure immunodétection. En outre, un contrôle approprié (par exemple, les cellules non transfectées, siARN cellules traitées, etc) sera utile pour déterminer la spécificité de vos anticorps et la localisation exacte de la protéine cible sur la membrane.

Après le marquage sur le film de la position des bandes colorées standards de protéines de la membrane, l'intrigue du journal de chaque poids moléculaire des normes de protéines (axe Y) contre leur mobilité relative correspondante (en abscisse). La mobilité relative (Rf) est le terme utilisé pour le ratio de la distance de la protéine a déplacé de son point d'origine (en haut du gel) par rapport à la distance la teinture de suivi ou un marqueur de faible poids moléculaire a déménagé (le front de gel) . Déterminer la droite de régression de la courbe standard pour obtenir des valeurs pour la pente et ordonnée à l'origine. Le poids moléculaire inconnue (de taille) de votre protéine cible est estimée à l'aide de son Rf et l'équation modifiée suivante:

log = poids moléculaire (pente) (Rf mobilité ou de la protéine cible) + ordonnée à l'origine

(Voir référence 6 pour des instructions détaillées).

Approximations niveau d'expression sont prises en comparant l'intensité de bande de la protéine cible à celle d'une protéine de structure (par exemple, la tubuline ou de l'actine) ou un produit du gène de ménage tels que la GAPDH. Ce qu'on appelle le «contrôle de chargement" ne devrait pas changer entre les échantillons et se révèle à l'aide d'un anticorps spécifique primaire. L'image peut être analysée par densitométrie pour évaluer la quantité relative de la coloration des protéines et de quantifier les résultats en termes de densité optique.

La procédure présentée ici utilise un gel de Bis-Tris avec MES Tampon comme un exemple de dénaturation PAGE en utilisant le système d'Invitrogen NuPAGE électrophorèse Novex. En outre, ce système de pré-gel permet la séparation des protéines fonte sous dénaturation ou conditions non dénaturantes ainsi que peut accueillir une large gamme de poids moléculaire (1 à 200 kDa pour les gels Bis-Tris à 36-400 kDa pour le Tris- des gels d'acétate). Selon votre expérience, vous pouvez choisir de suivre une partie seulement de la technique de western-blot décrites ici et de l'utilisation directe de procédés de coloration du gel (par exemple, d'argent ou de coloration de Coomassie) ou une méthode immuno alternatives (par exemple, colorimétrique ou fluorescent).

Nous utilisons régulièrement le système d'Invitrogen NuPAGE électrophorèse Novex dans notre laboratoire pour diverses applications, dont certains exemples peuvent être trouvés dans les références 7-9.