Isolamento di mouse cellule epiteliali delle vie respiratorie ed esposizione al fumo di sigaretta Sperimentale interfaccia Air Liquid

Le cellule epiteliali polmonari può essere isolato dal tratto respiratorio dei topi e colto in aria-liquido come un modello di differenziazione dell'epitelio respiratorio. Un protocollo è descritto per l'isolamento, la coltura e l'esposizione di queste cellule al fumo di sigaretta tradizionale, al fine di studiare le risposte molecolari di questa tossina ambientale.

Le cellule epiteliali polmonari può essere isolato dal tratto respiratorio dei topi e colto in aria-liquido (ALI) come un modello di differenziazione dell'epitelio respiratorio. Un protocollo è descritto per isolare queste cellule e di esporre al fumo di sigaretta mainstream (CS), al fine di studiare le risposte delle cellule epiteliali all'esposizione CS. Il protocollo si compone di tre parti: l'isolamento delle cellule epiteliali delle vie aeree da mouse trachea, la coltura di queste cellule in aria-liquido (ALI) come cellule altamente differenziate epiteliali, e la consegna del tradizionale CS calibrato a queste cellule in coltura. Il sistema di coltura ALI permette la cultura del epiteli delle vie respiratorie, in condizioni che si avvicinano maggiormente a loro ambiente fisiologico rispetto ai sistemi normali coltura liquida. Lo studio delle risposte cellulari e molecolari di esposizione ai polmoni CS è un componente fondamentale di comprendere l'impatto dell'inquinamento atmosferico ambientale sulla salute umana. I risultati della ricerca in questo settore possono in ultima analisi, contribuire alla comprensione della eziologia della malattia polmonare ostruttiva cronica (BPCO), e altre malattie legate al tabacco, che rappresentano gravi problemi di salute globale.

Il protocollo generale richiede 2 giorni per isolamento di cellule da tessuti animali, 5-10 giorni per la proliferazione cellulare, e un ulteriore 10-14 giorni per la differenziazione cellulare in aria-liquido. Un giorno in più è necessario per l'esposizione delle cellule e la raccolta di campioni.

1. Isolamento di mouse cellule epiteliali tracheobronchiale (MTEC).

Nota: Tutte le procedure descritte di seguito sono stati esaminati e approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso presso il Brigham and Women s Hospital / Area Harvard Medical School.

Prima di iniziare:

• Preparare Ham F12 supporti contenenti antibiotici. A 250 mL Ham F12 i media basale (Cellgro) aggiungere 2,50 ml di una X 100 penicillina / streptomicina (10 ² U/mL-10 ² mg / ml) soluzione e 250 microlitri di una soluzione di 1000 X Fungizone. Conservare a 4 ° C per un massimo di 4 settimane.
• Preparare una soluzione di 0,15% pronasi. Aggiungere 15 pronasi mg a 10 ml di Ham F12 supporti contenenti antibiotici. Fai aperta e tenerla in ghiaccio fino al momento dell'uso.
• Preparare una superficie pulita di lavoro e sterili strumenti chirurgici appropriati per la chirurgia per piccoli animali, e un cappuccio lamellare coltura di tessuti per l'isolamento delle cellule. Tutte le altre apparecchiature è considerato standard per la coltura di cellule animali tra cui umidificata CO ₂ incubatori, celle frigorifere, celle tavolo centrifughe, microscopio invertito, e pipetta di plastica monouso e articoli cultura.
• Preparare collagene I soluzione (50 mg / ml 0,02 N in acido acetico). Pipettare 1,0 ml soluzione di collagene in ciascun pozzetto di una piastra transwell 12 pozzetti (Corning). Avvolgerlo in parafilm e lasciate riposare per una notte su una superficie piana a temperatura ambiente.

1. Utilizzando un ceppo disponibile in commercio del mouse (cioè, C57BL / 6, maschio 6-8 settimane di età), eutanasia topo, utilizzando un metodo approvato di eutanasia, come la CO _2-indotta narcosi. Tipicamente 6 topi produrrà abbastanza cellule (1.5-2.0 x 10 ⁵ cellule / mouse) alle sementi un 12-pozzetti transwell.
2. Spruzzare il carcasse di animali con il 70% EtOH soluzione per sterilizzare il campo.
3. Con acqua pulita forbici e bisturi chirurgici, togliere la pelle intorno alla zona della trachea, ed esporre la trachea. Aperto l'addome, tagliare lungo lo sterno, e rimuovere la gabbia toracica. Rimuovere il tessuto fino alla fine della trachea è esposto.
4. Tracheas posto in una provetta da 50 ml conica contenente 30 ml Ham F12 supporti contenenti antibiotici, sul ghiaccio.
5. In una cappa sterile flusso lamellare, il trasferimento di tessuto tracheale in un piatto sterile 100 millimetri Petri contenenti 10 mL Ham F12 supporti contenenti antibiotici.
6. Delicatamente sezionare il tessuto connettivo con una pinza sterile e forbici chirurgiche.
7. Trasferimento di tessuto tracheale in un nuovo piatto 100 millimetri Petri contenenti 10 mL Ham F12 supporti contenenti antibiotici per risciacquare. Tagliare tracheas lungo l'asse verticale per esporre lumen.
8. Trasferimento tracheas in una provetta da 50 ml contenente 10 ml di soluzione pronasi 0,15% e incubare una notte a 4 ° C.
9. Il secondo giorno, sono pronti:
   • Preparare una soluzione DNAsi I. A 18 mL di Ham F12 supporti contenenti antibiotici aggiungere 2 mL di 10 mg / ml di albumina sierica bovina (BSA) soluzione madre, e 10 mg di greggio al pancreas DNAsi I. Make 1 ml aliquote e conservare a -20 ° C (scongelati in ghiaccio prima dell'uso).
   • Preparare Ham F12 supporti contenenti antibiotici con il 20% di siero fetale bovino (FBS). A 200 mL Ham F12 mezzi basale (Invitrogen), aggiungere 50 ml di calore FBS inattivato, 2,5 mL di una X 100 penicillina / streptomicina (10 ² U/mL-10 ² mg / ml) soluzione, e 250 microlitri di una soluzione di 1000 X Fungizone .
   • Preparare terreno base MTEC contenenti antibiotici. A 475,5 mL DMEM/F12 mezzi di base (Cellgro) aggiungere 7,5 ml soluzione 1 M HEPES, 10 ml di soluzione 200 mM glutamina, 2 ml di un 7,5% NaHCO ₃ soluzione, 5 mL di una X 100 penicillina / streptomicina soluzione, 500 microlitri di una soluzione di 1000 X Fungizone
   • Preparare MTEC medium/10% FBS. A 45 mL di medium MTEC base contenente antibiotici, aggiungere 5 ml di calore FBS inattivato.
10. Agitare delicatamente il tubo (a partire dal punto 1.8) 10-12 volte, e poi lasciate riposare per 30-60 minuti a 4 ° C.
11. Aggiungere 10 mL Ham F12 supporti contenenti il ​​20% FBS e antibiotici per il tubo e il rock 12 volte.
12. Preparare 3 15 ml provette coniche da 10 ml Ham F12 supporti contenenti il ​​20% FBS e antibiotici.
13. Rimuovere tracheas dalla soluzione pronasi, mettendo da parte questa soluzione sul ghiaccio. Trasferimento tracheas al primo tubo conico contenente F12 Ham e capovolgere tubo di 12 volte. Ripetere questa operazione altre due volte.
14. Combina soluzione pronasi con i tre surnatanti dal passaggio 1,13 in un tubo da 50 ml. Eliminare residui di tessuto.
15. Centrifugare a 1400rpm (390 xg; centrifuga Eppendorf 5810R dotato di un A-4-62 rotore) per 10 minuti a 4 ° C, il surnatante e gettarlo.
16. Delicatamente risospendere il pellet in 1 ml di soluzione DNAsi (100-200 microlitri / trachea)e incubare 5 minuti sul ghiaccio.
17. Centrifugare a 1400rpm (390 xg) per 5 minuti a 4 ° C, il surnatante e gettarlo.
18. Risospendere il pellet cellulare in 8 ml di mezzo MTEC contenente 10% FBS
19. Piastra di sospensione cellulare su piastre Primaria (Falcon). Incubare a 37 ° C in atmosfera del 95% di aria, 5% di CO ₂ per 5 ore (Nota: questo è un passo selezione negativa per fibroblasti).
20. Raccogliere sospensione cellulare da piatti e lavare piatti due volte con 4 ml MTEC contenente 10% FBS. Cellula sospensione piscina e lava insieme in una provetta da 50 ml.
21. Conserve 1 ml per cytospin e il conteggio delle cellule. Spin in una centrifuga da tavolo per 5 min a 5.000 giri (Eppendorf 5415D). Rimuovere 500 microlitri e risospendere pellet in surnatante rimanente. Usa 100 l per il conteggio delle cellule con il metodo Blu colorazione vitale tripan. Conserve 4 aliquote di 100 microlitri per l'analisi cytospin
22. Spin restanti 15 ml sospensione cellulare a 1400rpm (390 xg), a 4 ° C per 10 min.

2. Propagazione e Differenziazione dei MTEC Alla aria-liquido

Preparare soluzioni di riserva acido retinoico. Soluzione stock A: pesare acido retinoico al buio (Sig. 300,44 g / mol) di fare un 5 mM soluzione madre nel 95% EtOH. Conservare in un tubo di alluminio avvolto a -80 ° C. Se necessario, preparare Soluzione B (5 mM) aggiungendo 50 microlitri archivi A, 500 ul di soluzione BSA (100 mg / mL) e 49,5 ml di Hank soluzione salina bilanciata (HBSS). Conservare in un foglio avvolto tubo a -80 ° C per un massimo di 4 settimane.

Preparare medio proliferazione MTEC contenenti acido retinoico. A 45,7 mL supporti MTEC basale contenenti antibiotici, aggiungere 2,5 ml di siero FBS, 1 ml di acido retinoico Azione B, 250 microlitri soluzione di Insulina (2 mg / ml di insulina in 4 mM HCl), 250 microlitri soluzione del fattore di crescita epidermico (5 mg / mL di EGF in HBS contenente 1 mg / ml BSA), 200 ul estratto di ipofisi bovina (15 mg / ml in HBS contenente 1 mg / ml BSA), 50 ul di soluzione transferrina (5 mg / ml transferrina in HBS contenente 1 mg / mL di BSA ), 50 microlitri soluzione tossina del colera (100 mg / ml in HBS contenente 1 mg / ml BSA). Filtro sterilizzare finale preparazione media e utilizzare entro 2 giorni dalla preparazione.

1. Rimuovere la soluzione di collagene da piatti transwell, lasciate riposare sotto il cofano per 5 minuti, e lavare con PBS 2 volte.
2. In seguito a centrifugazione, risospendere il pellet cellulare in un volume adeguato di proliferazione dei media (500 mL) per facilitare la placcatura di 7,5 x 10 ⁴ -1,0 x10 ⁵ cellule per pozzetto. Pipettare 500 microlitri sospensione cellulare sulla superficie apicale dell'inserto transwell membrana in policarbonato. Aggiungere 1,5 mL di proliferazione dei media per il comparto basale del transwell.
3. Incubare le culture MTEC sommerso a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente il 95% di aria, 5% di CO ₂ per 7-10 giorni.
4. Aspettare tre giorni prima di cambiare i media la prima volta. Cambiare i media a giorni alterni. Monitorare le culture mediante ispezione visiva e la misurazione della resistenza delle cellule transepiteliale utilizzando un elettrodo (EVOM Ohmvoltometer, strumenti di precisione mondiale, Sarasota, FL).
5. Quando le cellule appaiono confluenti e resistenza epiteliale raggiunge le 1000 Ω / cm ^2, le cellule sono pronte per differenziare in ALI.
6. Preparare MTEC i media basale contenente il 2% NuSerum. Aggiungi NuSerum medio MTEC base alla concentrazione finale del 2% V / V. Aggiungi Archivi acido retinoico B ad una concentrazione finale di 1 x 10 ^-7 M prima dell'uso. Preparare fresco e consumare entro 2 giorni.
7. Lasciare cellula a differenziarsi per 10-14 giorni, rimuovendo i media apicale e la sostituzione dei media basale con 750 microlitri mezzi MTEC basale contenente il 2% di acido retinoico e Nuserum. Cambiare il supporto basale e lavare la parte apicale con MTEC contenente il 2% NuSerum a giorni alterni.

3. Applicazione di fumo di sigaretta a colture di cellule epiteliali

1. Esporre la parte apicale delle culture transwell al fumo di sigaretta tradizionale utilizzando un sistema a celle CS esposizione (EMI Instruments, Pittsburgh, PA). Vedere la Figura 1 per la fotografia degli apparecchi. Vedere la tabella di reagenti e attrezzature specifiche per le specifiche tecniche. In breve, l'apparato è costituito da una pompa peristaltica che fuma una sigaretta in ~ 7-8 sbuffi, disegno nel fumo tradizionale in una linea di polipropilene che è collegato ad una camera di esposizione ventilata. La camera di esposizione è mantenuta a 37 ° C con circolazione di acqua, e mantenuta a un clima di 5% CO ₂ su una linea del gas. Le cellule possono essere esposte al fumo utilizzando Kentucky 3R4F sigarette con filtro di ricerca di riferimento (Il Tabacco Research Institute, University of Kentucky, Lexington, KY). Tipicamente le cellule sono esposte al fumo 1-2 sigarette, cedendo 100-200 mg / m ³ di materiale particolato totale (TPM). Colture di controllo sono esposti ad aria della stanza per un periodo di esposizione equivalente.
2. Il TPM è misurata secondo il protocollo del produttore fornito con il TE10c-macchina fumo (Aziende Teague). In breve, un filtro (Pallflex) viene posto in un supporto in linea in acciaio inossidabile su un tubo di campionamento che porta dal porto di campionamento sulla camera di fumo ad una pompa a portata costante (unità di campionamento). Un tubo di efflusso collega l'unità di campionamento di un contatore del gas (contatore del gas a secco, ONM61, 67, AEM). Il filtro viene pesato prima e dopo il campionamento dei gas. Il materiale totale depositata sul filtro in mg è normalizzata per il volume totale di aria campionata.
3. Le cellule possono essere raccolte in qualsiasi momento (ad esempio, 0-24 ore) dopo l'esposizione per le procedure standard di cella analitica (cioè, analisi Western immunoblot, analisi di mRNA, ecc) o microscopia (ad esempio, la microscopia confocale o elettronica). I media cultura può anche essere analizzato per citochine o di rilascio per i test di citotossicità LDH.

4. Rappresentante Risultati

Successo isolamento epiteliali, la proliferazione e la differenziazione a ALI dovrebbe produrre un monostrato intatto con una morfologia ciottoli. Resistenza delle cellule Transepithelilal di culture sano dovrebbe essere di circa 1000-2000 Ω / cm ^2. La Figura 2 mostra un monostrato di cellule epiteliali respiratorie topo colorate per i marcatori delle cellule epiteliali e le ciglia in condizioni di controllo e dopo l'esposizione fumo di sigaretta. La figura 3 mostra microscopio elettronico rappresentante del sana culture MTEC, raffigurante ultrastruttura e la morfologia ciglia.

Figura 1. Preparazione delle cellule epiteliali procede attraverso tre fasi, una fase di isolamento, una fase di propagazione, e una fase di differenziazione in aria-liquido (schema). Cellule epiteliali sono isolati da topo trachea, seminate su transwells dove proliferano nella cultura sommersa, e quindi convertito in aria-liquido dove si differenziano completamente. Gli esperimenti sono tipicamente condotte il giorno ²⁴ di coltura continua. Il quadro raffigura un sistema modello per l'esposizione di cellule in coltura al fumo di sigaretta tradizionale. Una cultura transwell ALI sistema è collocato all'interno di un sistema modulare personalizzato di consegna fumo di sigaretta, che è controllato per temperatura, umidità e CO _2.

Figura 2 colture di cellule epiteliali sono state fissate e colorate per nuclei (Hoechst 33258), F-actina (verde, Alexa Fluor falloidina-488-coniugate). E l'indicatore di ciglia acetilata α-tubulina (rosso; Cy3 anticorpo secondario coniugato). I pannelli inferiori mostrano immagini equivalenti di cellule epiteliali preso 4 ore dopo l'esposizione al fumo di sigaretta (2 sigarette, 150 mg / m ^3). (B) lattato deidrogenasi (LDH) rilascio è stato misurato nel medio basale 24 ore dopo l'esposizione a dosi variabili di fumo di sigaretta come indicato.

Figura 3. Aria-liquido interfaccia culture di cellule epiteliali isolate da epitelio tracheale del mouse differenziarsi in diversi sottotipi che al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) hanno le caratteristiche di ciliate, cellule basali, e non ciliate ^1. Queste cellule caratterizzano pseudostratificato dell'epitelio respiratorio. Figura etichette corrispondono a: bb: basale, a: axoneme, m: i mitocondri, n: nucleo, s: substrato (policarbonato membrana), mv: microvili

Il protocollo descrive l'isolamento di mouse cellule epiteliali tracheali è adattato dai protocolli di Lei et al., ^1, e altri ^2-3 con modifiche. Come con qualsiasi isolamento protocollo descrive cellulare, l'aspetto più critico è quello di evitare la contaminazione da batteri patogeni o fungine mediante rigorose tecniche asettiche. Un secondo passo fondamentale è quello di evitare la contaminazione delle culture di fibroblasti, che possono essere evitati mediante dissezione attenta dei tracheas, e la selezione negativa, come descritto al punto 1.19. A condizione che le culture sono controllati, lavati e terreni di coltura rifornito a giorni alterni, seguendo le prime 72 ore di incubazione, le colture dovrebbero differenziare completamente in circa due settimane dall'inizio dello ALI.

La broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), che è in gran parte causati da esposizione cronica fumo di sigaretta, continua a rappresentare un grave problema sanitario globale ^4-7. BPCO, è caratterizzata da progressiva limitazione del flusso aereo, la perdita alveolare distruttivi (enfisema), ed esagerate risposte infiammatorie del polmone al fumo di sigaretta ^4-7. Un gran numero di studi ha utilizzato alveolare, bronchiale, e sistemi di cellule epiteliali delle vie aeree per tentare di risposte ai polmoni modello cellulare di CS. Molti di questi studi sono stati condotti in cellule epiteliali o linee trasformate (cioè, Beas-2b), vedi Refs ^8-11 per gli esempi. La cultura ALI transwell sistema consente la cultura di cellule epiteliali polmonari in modo che è più vicino al loro orientamento fisiologico delle vie aeree, di quella che può essere fornito da liquidi convenzionali (in immersione) cultura ^1-3. Anche se il protocollo descritto descrive l'applicazione di questo sistema di topo culture tracheale primaria ^1, in linea di principio altre cellule epiteliali primarie possono essere applicate (ad esempio, un mouse di tipo II le cellule epiteliali, cellule epiteliali bronchiali umane, ecc.) L'applicazione delle principali CS vivere per colture cellulari rappresenta un modello che forse si avvicina maggiormente all'esposizione umana ai CS di applicazione di estratto acquoso di fumo di sigaretta (CSE), che viene comunemente usato in studi cellulari di esposizione CS ^12-15. CSE rappresenta una frazione solubile di fumo mainstream che manca di componenti chimici del fumo tutto. Mentre entrambi i sistemi hanno dei limiti di esposizione CS, CSE ha il vantaggio di essere più facilmente calibrato, in quanto una singola preparazione può essere utilizzato per esperimenti multipli, e dosaggio si ottiene per diluizione ^15-16. D'altra parte, includiamo qui un metodo per quantificare la consegna tradizionale fumo sulla base di misure TPM. La spiegazione di risposte molecolari e cellulari di esposizione ad una tossina, in particolare CS come esemplificato in questo articolo, ulteriormente la comprensione degli effetti dell'inquinamento atmosferico sulla salute umana, in particolare l'eziologia delle malattie croniche del polmone.

Ringraziamo Emeka Ifedigbo per assistenza tecnica e il Dr. Shivraj Tyagi per la preziosa esperienza. Ringraziamo anche il Centro NeuroDiscovery Harvard per l'assistenza al microscopio. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da un American Heart Association Predoctoral concedere 09PRE2250120 a Hilaire Lam, e le sovvenzioni NIH, R01-HL60234, HL55330-R01, R01-HL079904, assegnato a AMK Choi.