בידוד של תאים אפיתל עכבר הנשימה וחשיפה לעשן סיגריות בבית ניסויית ממשק האוויר נוזלי

תאים אפיתל ריאתי יכול להיות מבודד דרכי הנשימה של עכברים תרבותי בממשק אוויר נוזלי כמודל של אפיתל הנשימה מובחן. פרוטוקול מתואר לבידוד, culturing וחשיפת תאים אלה לעשן סיגריות המיינסטרים, כדי ללמוד התגובות מולקולרית רעלן זה סביבתיים.

תאים אפיתל ריאתי יכול להיות מבודד דרכי הנשימה של עכברים תרבותי בממשק אוויר נוזלי (עלי) כמודל של אפיתל הנשימה מובחן. פרוטוקול מתואר לבידוד וחשיפת תאים אלה לעשן סיגריות המיינסטרים (CS), כדי ללמוד התגובות תא אפיתל חשיפה CS. פרוטוקול מורכב משלושה חלקים: בידוד של תאים אפיתל דרכי הנשימה של העכבר קנה הנשימה, את culturing של תאים אלה על הממשק אוויר נוזלי (עלי) כמו בתאי אפיתל הבדיל באופן מלא, ועל אספקת הזרם המרכזי CS מכויל תאים אלה בתרבית. מערכת התרבות עלי מאפשר התרבות של epithelia הנשימה בתנאים דומים יותר ההגדרה הפיזיולוגית שלהם מאשר מערכות תרבות נוזלי רגיל. המחקר של תגובות תאית ומולקולרית ריאות לחשיפה CS הוא מרכיב קריטי להבין את ההשפעה של זיהום אוויר איכות הסביבה על בריאות האדם. ממצאי המחקר בתחום זה עשוי בסופו של דבר לתרום להבנת האטיולוגיה של מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), ועוד מחלות הקשורות לטבק, המייצגים העיקריים לבעיות בריאות העולמי.

פרוטוקול הכולל דורש 2 ימים isolations תאים מרקמות בעלי חיים, 5-10 ימים עבור התפשטות תאים, ו נוסף 10-14 ימים התמיינות תאים על הממשק אוויר נוזלי. יום נוסף נדרש עבור חשיפות תא והקציר של דגימות.

1. בידוד של תאים עכבר Tracheobronchial אפיתל (MTEC).

הערה: כל הנהלים המתוארים להלן נבדקו ואושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת השתמש ב בריגהאם ובית החולים לנשים / שטח בית הספר לרפואה של הרווארד.

לפני שתתחיל:

• הכן F12 של שינקין מדיה המכילה אנטיביוטיקה. F12 כדי 250 מ"ל של Ham התקשורת הבסיסי (Cellgro) להוסיף 2.50 מ"ל של 100 X פניצילין / סטרפטומיצין (10 ² U/mL-10 ² מ"ג / מ"ל) פתרון 250 μL של פתרון X Fungizone 1000. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 שבועות.
• הכן פתרון של Pronase 0.15%. הוסף Pronase 15 מ"ג ל 10 מ"ל של מדיה F12 של שינקין המכילות אנטיביוטיקה. בצע טרי ולשמור על הקרח עד לשימוש.
• הכינו משטח עבודה נקי מכשירי ניתוח סטרילי המתאים לניתוח בעלי חיים קטנים, רקמה lamellar תרבות ברדס עבור isolations התא. כל הציוד אחרים נחשב סטנדרטי עבור התרבות התא החי כולל humidified ₂ חממות CO, חדר קר, תא השולחן צנטריפוגות, מיקרוסקופ הפוכה, ועל פיפטה פלסטיק חד פעמיות כלי התרבות.
• הכן קולגן אני הפתרון (50 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב 0.02 N חומצה אצטית). פיפטה 1.0 מ"ל פתרון קולגן לתוך הבאר כל אחד 12 גם transwell צלחת (קורנינג). עטוף parafilm ולתת לעמוד במשך הלילה על משטח שטוח בטמפרטורת החדר.

1. שימוש זן, זמין מסחרית העכבר (כלומר, C57Bl / 6, זכר 6-8 שבועות), להרדים עכברים באמצעות שיטה המאושר של המתת חסד כגון CO _2-Induced הרדמה. בדרך כלל 6 עכברים תניב מספיק תאים (1.5-2.0 x 10 ⁵ תאים / עכבר) כדי זרע צלחת 12-transwell היטב.
2. רסס את פגרי בעלי חיים עם פתרון EtOH 70% לעקר את השדה.
3. עם מספריים כירורגיות נקי אזמל, להסיר את העור מסביב לאזור קנה הנשימה, ולחשוף את קנה הנשימה. פתח את הבטן, חותכים לאורך עצם החזה, ולהסיר את כלוב הצלעות. הסרה של רקמת עד תום את הקנה חשוף.
4. המקום וקנה הנשימה לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל המכיל 30 מ"ל של Ham F12 מדיה המכילה אנטיביוטיקה, על הקרח.
5. בתוך מכסה המנוע לזרום סטרילי lamellar, העברת רקמות קנה הנשימה אל צלחת פטרי 100 מ"מ סטרילי המכיל 10 מ"ל של Ham F12 מדיה המכילה אנטיביוטיקה.
6. בעדינות לנתח רקמת החיבור עם מלקחיים ומספריים כירורגי סטרילי.
7. העברת רקמות קנה הנשימה אל צלחת פטרי חדש 100 מ"מ המכילים 10 מ"ל של Ham F12 מדיה המכילה אנטיביוטיקה לשטוף. גזור וקנה הנשימה לאורך ציר אנכי לחשוף לומן.
8. העברת וקנה הנשימה לצינור 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל פתרון Pronase 0.15% ו דגירה לילה בשעה 4 ° C.
9. ביום השני, יש להכין:
   • הכן פתרון אני DNAse. כדי mL 18 של Media F12 של חם המכיל אנטיביוטיקה להוסיף 2 מ"ל של 10 מ"ג / מ"ל ​​שור פתרון סרום (BSA) אלבומין מניות, ו -10 מ"ג הגולמי בלבלב DNAse I. הפיכת aliquots 1 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C (מופשר על קרח לפני השימוש).
   • הכן F12 של שינקין מדיה המכילה אנטיביוטיקה עם סרום 20% שור העובר (FBS). F12 כדי 200 מ"ל של Ham התקשורת הבסיסי (Invitrogen) להוסיף 50 מ"ל חום FBS מומת, 2.5 מ"ל של 100 X פניצילין / סטרפטומיצין (10 ² U/mL-10 ² מ"ג / מ"ל) פתרון, ו 250 μL של פתרון X Fungizone 1000 .
   • הכן בינוני MTEC בסיסי המכיל אנטיביוטיקה. כדי 475.5 מ"ל DMEM/F12 התקשורת הבסיסית (Cellgro) להוסיף 7.5 מ"ל 1 M פתרון HEPES, 10 מ"ל של תמיסת 200 mM גלוטמין, 2 מ"ל של פתרון 7.5% NaHCO _3, 5 מ"ל של 100 X פניצילין / פתרון סטרפטומיצין, 500 μL של פתרון X Fungizone 1000
   • הכן MTEC medium/10 FBS%. עד 45 מ"ל של מדיום MTEC הבסיסי המכיל אנטיביוטיקה, מוסיפים 5 מ"ל FBS חום מומת.
10. בעדינות את הסלע צינור (מ שלב 1.8) 10-12 פעמים, ואחר כך לתת לזה לעמוד 30-60 דקות 4 ° C.
11. הוסף 10 מ"ל של Ham F12 מדיה המכילה 20% FBS ואנטיביוטיקה אל הצינור רוק 12 פעמים.
12. הכן 3 צינורות חרוטי 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של Ham F12 מדיה המכילה 20% FBS ואנטיביוטיקה.
13. הסר וקנה הנשימה מפתרון Pronase, נתעלם פתרון זה על הקרח. העברת וקנה הנשימה אל צינור חרוטי first המכיל F12 של נקניק להפוך צינור 12 פעמים. חזור על תהליך זה פעמיים נוספות.
14. שילוב הפתרון Pronase עם שלושת supernatants משלב 1.13 לתוך צינור one 50 מ"ל. בטל רקמות הנותרים.
15. צנטריפוגה על 1400rpm (390 XG; Eppendorf צנטריפוגות 5810R מצויד הרוטור A-4-62) עבור 10 דקות ב 4 ° C, וזורקים supernatant.
16. בעדינות resuspend גלולה בפתרון DNAse 1 מ"ל (100-200 μL / קנה הנשימה)ו דגירה 5 דקות על הקרח.
17. צנטריפוגה על 1400rpm (390 XG) במשך 5 דקות ב 4 ° C, וזורקים supernatant.
18. Resuspend התא גלולה במדיום 8 MTEC מ"ל המכיל 10% FBS
19. תא פלייט השעיה על צלחות Primaria (Falcon). לדגור על 37 מעלות צלזיוס באווירה של אוויר 95%, 5% CO ₂ למשך 5 שעות (הערה: זהו צעד סלקציה שלילית עבור פיברובלסטיים).
20. איסוף ההשעיה התא צלחות לשטוף צלחות פעמיים עם 4 מ"ל MTEC המכיל 10% FBS. תא בריכת ההשעיה ושוטף יחד צינור חרוטי 50 מ"ל.
21. לחסוך 1 מ"ל עבור cytospin והספירה התא. ספין בצנטריפוגה השולחן במשך 5 דקות ב 5000 סל"ד (Eppendorf 5415D). הסר μL 500 ו resuspend גלולה ב supernatant הנותרים. השתמש 100 μL עבור ספירת תאים בשיטת כחול Trypan מכתים חיוני. לחסוך 4 aliquots של μL 100 לניתוח cytospin
22. ספין הנותרים 15 תא ההשעיה מ"ל ב 1400rpm (390 XG), ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

2. ריבוי והתמיינות של MTEC בממשק אוויר נוזלי

הכן retinoic מניות פתרונות חומצה. פתרון במלאי: לשקול את החומצה הרטינואית בחושך (מר 300.44 g / mol) לעשות 5 מניות פתרון מ"מ EtOH 95%. חנות בתוך שפופרת עטוף בנייר ב -80 ° C. לפי הצורך, להכין פתרון במלאי B (5 מיקרומטר) על ידי הוספת 50 μL במלאי, 500 μL פתרון BSA (100 מ"ג / מ"ל) ו 49.5 פתרון מאוזן מ"ל של האנק מלח (HBSS). חנות בנייר כסף עטוף צינור ב -80 ° C עד 4 שבועות.

הכן בינוני MTEC התפשטות המכילים חומצה רטינואית. כדי 45.7 מ"ל התקשורת MTEC הבסיסי המכיל אנטיביוטיקה, להוסיף חום מומת 2.5 FBS מ"ל, 1 מ"ל retinoic חומצה במלאי B, 250 פתרון אינסולין μL (2 מ"ג / מ"ל ​​אינסולין 4 מ"מ HCl), 250 גורם μL עוריות צמיחה פתרון (5 מיקרוגרם / מ"ל ב EGF בהרוורד המכילה 1 מ"ג / מ"ל ​​BSA), 200 μL לחלץ יותרת המוח שור (15 מ"ג / מ"ל ​​ב בהרוורד המכילה 1 מ"ג / מ"ל ​​BSA), 50 μL פתרון transferrin (5 מ"ג / מ"ל ​​transferrin ב בהרוורד המכילה 1 מ"ג / מ"ל ​​BSA ), 50 μL פתרון כולרה טוקסין (100 מ"ג / מ"ל ​​ב בהרוורד המכילה 1 מ"ג / מ"ל ​​BSA). סנן לעקר הסופי הכנה התקשורת ולהשתמש בתוך 2 ימי הכנה.

1. הסר פתרון קולגן מהצלחות transwell, בואו לעמוד מתחת למכסה המנוע של 5 דקות, לשטוף עם PBS 2 פעמים.
2. בעקבות צנטריפוגה, resuspend התא גלולה בהיקף מתאים של הפצת מדיה (500 μL) כדי להקל על ציפוי של 7.5 x 10 ⁴ -1.0 x10 ⁵ תאים לכל טוב. פיפטה 500 תא ההשעיה μL על פני השטח של apical להכניס את קרום transwell פוליקרבונט. הוסף 1.5 מ"ל של התקשורת התפשטות לתא הבסיסי של transwell.
3. דגירה התרבויות MTEC שקוע ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified אוויר המכיל 95%, 5% CO ₂ עבור 70-10 ימים.
4. חכו שלושה ימים לפני שינוי התקשורת בפעם הראשונה. שינוי התקשורת בכל יום אחר. צג תרבויות על ידי בדיקה ויזואלית של מדידת התנגדות תא transepithelial באמצעות אלקטרודה (EVOM Ohmvoltometer, מכשירים Precision העולם, סרסוטה, פלורידה).
5. כאשר תאים להופיע ומחוברות והתנגדות אפיתל מגיע Ω 1000 / ² ס"מ, התאים מוכנים לבדל את עלי.
6. הכן התקשורת הבסיסי המכיל MTEC NuSerum 2%. הוסף NuSerum עד בינוני MTEC בסיסית ריכוז סופי של 2% V / V. הוסף B retinoic מלאי חומצה בריכוז הסופי של 1 מ ^-7 X 10 לפני השימוש. הכן טרי ולהשתמש בתוך 2 ימים.
7. אפשר להבדיל בין תא עבור 10-14 ימים, על ידי הסרת התקשורת apical והחלפת התקשורת הבסיסי עם 750 התקשורת μL הבסיס MTEC המכילים חומצה רטינואית Nuserum ו 2%. שינוי בתקשורת הבסיס לשטוף את הצד apical עם MTEC NuSerum המכיל 2% בכל יום אחר.

3. יישום של עשן סיגריות כדי לתאי האפיתל Cultured

1. לחשוף את הצד apical של התרבויות transwell לעשן סיגריות המיינסטרים באמצעות חשיפת תא CS המערכת (EMI מכשירים, פיטסבורג, פנסילבניה). ראה איור 1 עבור תצלום של המנגנון. ראה טבלה של חומרים כימיים מסוימים וציוד מפרטים טכניים. בקיצור, המנגנון מורכב משאבה peristaltic אשר כל מעשן סיגריה ~ 7-8 פחזניות, ציור בעשן המיינסטרים לקו פוליפרופילן שמחובר לחדר חשיפה פרקו. החדר חשיפה נשמר 37 ° C על ידי במחזור מים, שמרו על אווירה של 5% CO ₂ על קו גז. התאים יכולים להיות חשופים לעשן באמצעות קנטאקי 3R4F מחקר התייחסות סיגריות פילטר (טבק מכון המחקר, אוניברסיטת קנטאקי, לקסינגטון, KY). בדרך כלל התאים נחשפים לעשן סיגריות 1-2, מניב 100-200 מ"ג / מ ³ של חומר חלקיקי הכולל (TPM). תרבויות בקרה נחשפים לאוויר החדר לתקופה המקבילה חשיפה.
2. TPM נמדדת על פי פרוטוקול של היצרן המסופק עם TE-10c מכונת עישון (Enterprises טיג). בקיצור, פילטר (Pallflex) ממוקם מחזיק פלדה מוטבעות חלד על צינור דגימה המובילים מנמל הדגימה על חדר עישון להזרים זרם קבוע (יחידת דגימה). יצוא צינור המחבר את יחידת דגימה של מטר גז (גז יבש Meter, ONM61, 67, AEM). המסנן נשקל לפני ואחרי הדגימה גז. החומר הכולל שהונח על המסנן מ"ג הוא מנורמל עבור מהנפח הכולל של האוויר שנדגמו.
3. תאים לאחר מכן ניתן לקצור בכל נקודת זמן (כלומר, 0-24 שעות) חשיפה לפרסם נהלים אנליטיים תא רגיל (כלומר, המערבי ניתוח immunoblot, ניתוח ה-mRNA, וכו ') או במיקרוסקופ (כלומר, מיקרוסקופיה confocal או אלקטרון). התקשורת יכולה להיות גם תרבות ניתח עבור ציטוקינים או לשחרר LDH עבור מבחני cytotoxicity.

4. נציג תוצאות

בידוד אפיתל ריבוי מוצלח, והבחנה ב עלי צריך להניב monolayer שלם עם מורפולוגיה המרוצף. עמידות תא Transepithelilal של תרבויות בריא צריך להיות בערך 1000-2000 Ω / ² ס"מ. איור 2 מתאר monolayer של תאים אפיתל הנשימה עכבר מוכתם עבור תא אפיתל סמנים cilia בתנאים מלאה אחרי חשיפה לעשן סיגריות. איור 3 מראה micrographs אלקטרונים מייצג של תרבויות MTEC בריאה, המתארים ultrastructure ומורפולוגיה cilia.

באיור 1. הכנת התמורה לתאי האפיתל באמצעות שלושה שלבים, שלב הבידוד, שלב התפשטות, ואת שלב התמיינות בממשק אוויר נוזלי (ערכת). תאים אפיתל מבודדים העכבר קנה הנשימה, seeded על transwells שם הם מתרבים בתרבות שקוע, ולאחר מכן להמיר לתוך ממשק האוויר מלא נוזל שבו הם מבחינים. הניסויים נערכים בדרך כלל ביום ^ה -24 של התרבות רציפה. התמונה מתארת ​​מערכת מודל לחשיפה של תאים בתרבית לעשן סיגריות המיינסטרים. מערכת עלי transwell תרבות ממוקם בתוך מערכת מודולרית המותאמת אישית עשן סיגריות משלוח הנשלטת על טמפרטורה, לחות ו-CO _2.

איור 2 בתרביות תאים אפיתל קובעו ונצבעו עבור גרעינים (Hoechst 33,258), F-אקטין (ירוק; אלקסה פלואוריד Phalloidin-488-מצומדות). וכן את הסמן cilia acetylated-α טובולין (אדום; Cy3-מצומדות נוגדנים משני). לוחות נמוך להראות תמונות שוות ערך לתאי האפיתל נלקחו 4 שעות אחרי חשיפה לעשן סיגריות (2 סיגריות, 150 מ"ג / מ ^3). (ב) לקטט דהידרוגנז LDH () שחרור נמדדה בינוני הבסיס 24 שעות לאחר החשיפה מינונים שונים של עשן סיגריות כפי שצוין.

איור 3. אוויר נוזלי תרבויות ממשק של תאים אפיתל מבודד אפיתל העכבר קנה הנשימה להבחין ב תת מספר על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים (TEM) יש את המאפיינים של התאים הבזליים ריסי, ולא ריסי ^1. תאים אלה מאפיינות אפיתל הנשימה pseudostratified. תוויות איור מתאימות: bb: הגוף הבסיסיים,: axoneme, מ ': המיטוכונדריה, n: גרעין, s: המצע (פוליקרבונט ממברנה), mv: microvili

הפרוטוקול מתאר בידוד של תאים אפיתל העכבר קנה הנשימה מותאמת הפרוטוקולים של אתה et al., ^1, ועוד ^2-3 עם שינויים. כמו בכל isolations פרוטוקול המתאר התא, ההיבט הקריטי ביותר הוא להימנע זיהום חיידקי או פטרייתי פתוגנים על ידי שימוש בטכניקות aseptic קפדנית. הצעד השני הוא קריטי כדי למנוע זיהום פיברובלסטים של תרבויות, אשר יכול להימנע על ידי דיסקציה זהירה של וקנה הנשימה, ואת סלקציה שלילית כמתואר שלב 1.19. ובלבד התרבויות מנוטרים, שטף, והתקשורת תרבות מתחדש בכל יום אחר לאחר דגירה 72 שעות ראשונית, תרבויות יש להבדיל באופן מלא בתוך כשבועיים מן החניכה של עלי.

מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), אשר נגרמת בעיקר על ידי חשיפה כרונית לעשן סיגריות, ממשיכה להוות בעיה בריאותית משמעותית בעולם ^4-7. COPD, מאופיין על ידי הגבלת זרימת אוויר מתקדמת, אובדן מכתשיים הרסני (אמפיזמה), ותגובות דלקתיות מוגזמת של הריאה לעשן סיגריות ^4-7. מספר רב של מחקרים השתמשו מכתשיים, הסימפונות, וכן מערכות תא אפיתל דרכי הנשימה כדי לנסות ריאות מודל התגובות התא CS. רבים המחקרים הללו נערכו בתא האפיתל או קווי טרנספורמציה (כלומר, Beas-2b), ראה השופטים ^8-11 דוגמאות. מערכת transwell עלי התרבות מאפשר התרבות של תאים אפיתל ריאתי בצורה שהיא קרובה יותר לכיוון פיזיולוגי שלהם בדרכי הנשימה, יותר מזה אשר יכול להיות מסופק על ידי נוזל קונבנציונאלי (שקוע) תרבות ^1-3. אף על פי פרוטוקול בהשתתפות מתאר את היישום של מערכת זו לתרבויות העכבר קנה הנשימה העיקרי ^1, באופן עקרוני אחרים לתאי האפיתל העיקרי יכול להיות מיושם (כלומר, העכבר סוג תאים II אפיתל, האדם תאים אפיתל הסימפונות, וכו '). היישום של המיינסטרים CS לחיות בתרביות תאים מייצג מודל שאולי נוסף קרוב החשיפה האנושית CS מאשר יישום של תמצית מימית עשן הסיגריות (CSE), אשר נמצא בשימוש נפוץ במחקרים הסלולר של חשיפה CS ^12-15. CSE מהווה חלק מסיסים עשן הזרם המרכזי כי חסרה רכיבים כימיים רבים של עשן כולו. בעוד שתי מערכות חשיפה CS יש מגבלות, מנוע החיפוש המותאם אישית יש את היתרון של להיות מכויל בקלות רבה יותר, שכן הכנה יחיד יכול לשמש בניסויים רבים, מינון מושגת על ידי דילול ^15-16. מצד שני, אנו כוללים כאן שיטה לכימות משלוח עשן הזרם המרכזי המבוסס על מדידות TPM. הבהרה התגובות מולקולרית תאית חשיפה רעלן, בפרט CS כפי שהודגם במאמר זה, יהיה עוד יותר את ההבנה של ההשפעה של זיהום האוויר על בריאות האדם, בפרט האטיולוגיה של מחלות כרוניות של הריאה.

אנו מודים Emeka Ifedigbo לקבלת סיוע טכני ד"ר Shivraj Tyagi עבור המומחיות יקר. כמו כן, אנו מודים מרכז NeuroDiscovery הרווארד לסיוע עם מיקרוסקופ. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי איגוד הלב האמריקני Predoctoral מענק 09PRE2250120 אל הילר לם, ו-NIH מענקים, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, הוענק AMK צ'וי.