Corsa di modellazione in Mouse - Medio occlusione dell'arteria cerebrale con il Modello Filament

Occlusione filamentosa dell'arteria cerebrale media è un modello comune per lo studio di ictus ischemico nei topi.

L'ictus è tra le più frequenti cause di morte e disabilità adulta, soprattutto nei paesi altamente sviluppati. Tuttavia, le opzioni di trattamento fino ad oggi sono molto limitate. Per soddisfare la necessità di nuovi approcci terapeutici, la ricerca sperimentale corsa impiega spesso modelli di roditori di ischemia cerebrale focale. La maggior parte dei ricercatori utilizzano occlusione permanente o transitoria dell'arteria cerebrale media (MCA) in topi o ratti.

Occlusione prossimale dell'arteria cerebrale media (MCA) attraverso la tecnica di sutura intraluminale (il cosiddetto filo di sutura o modello) è probabilmente il modello più frequentemente utilizzati nella ricerca sperimentale ictus. Il modello intraluminale MCAO offre il vantaggio di indurre riproducibile ischemia transitoria o permanente del territorio MCA in maniera relativamente non invasiva. Approcci intraluminale interrompere il flusso di sangue di tutto il territorio di questa arteria. Filamento occlusione così gli arresti di flusso prossimale al lenticolo-striata arterie, che forniscono i gangli della base. Filamento occlusione dei risultati MCA nelle lesioni riproducibile nella corteccia e nello striato e può essere permanente o transitoria. Al contrario, i modelli inducono distale (per la ramificazione della lenticolo-striata arterie) MCA occlusione tipicamente striato di ricambio e soprattutto coinvolgere la neocorteccia. Inoltre questi modelli hanno bisogno di craniectomia. Nel modello ha dimostrato in questo articolo, un filamento di silicio ricoperto viene introdotto in arteria carotide comune e avanzate lungo l'arteria carotide interna nel circolo di Willis, dove blocca l'origine dell'arteria cerebrale media. Nei pazienti, occlusioni dell'arteria cerebrale media sono tra le cause più comuni di ictus ischemico. Dal momento che diversi intervalli ischemico possono essere scelti liberamente in questo modello a seconda del punto di tempo di riperfusione, lesioni ischemiche con vari gradi di gravità può essere prodotta. Riperfusione con la rimozione del filamento occlusione, almeno in parte i modelli il ripristino del flusso sanguigno dopo spontanei o terapeutici (tPA) lisi di un coagulo tromboembolici negli esseri umani.

In questo video vi presentiamo la tecnica di base così come le insidie ​​maggiori e fattori di confondimento che possono limitare il valore predittivo di questo modello.

Di garantire alta qualità e riproducibilità, si consiglia l'uso di Procedure Operative Standard (SOP). In questo video, pubblicato SOP sviluppati e utilizzati nel nostro laboratorio vengono applicate ^1.

1. Medio occlusione dell'arteria cerebrale

1. I topi vengono anestetizzati con un adeguato regime anestetico a consultarsi con il personale veterinario. (Induzione Per esempio con 1,5 - 2% isoflurano e manutenzione con 1,0 - 1,5% isoflurano in 2 / 3 N2O e 1 / 3 O2 utilizzando un vaporizzatore).
   1. La temperatura corporea dei topi è mantenuta a 36,5 ° C ± 0,5 ° C durante l'intervento con una piastra di riscaldamento. Una controllata pad riscaldamento feedback, che riscalda in base alla temperatura rettale del mouse, è altamente raccomandato.
   2. Disinfettare la cute e del pelo circostante con un agente appropriato (per esempio alcool etilico 70%) e asciugare successivamente.
2. Una incisione del collo linea mediana è fatto e dei tessuti molli sono separati.
3. La sinistra arteria carotide comune (LCCA) è attentamente sezionato libero dai nervi circostanti (senza danneggiare il nervo vagale) e una legatura è fatta utilizzando 6.0/7.0 stringa. Stringa 5.0 può anche essere usato.
4. La sinistra carotide esterna (LECA) è quindi separato ed un secondo nodo è fatto.
5. Successivamente, la carotide interna sinistra (LICA) è isolato e un nodo viene preparato con un filamento 6.0.
6. Dopo aver ottenuto buona vista della carotide interna sinistra (LICA) e l'arteria sinistra pterigopalatina (LPA), entrambe le arterie vengono ritagliate, con una clip microvascolare.
7. Un piccolo foro è tagliata nella LCCA prima che si biforca a LECA e la LICA. Un monofilo in nylon 8,0 rivestito con miscela indurente silicio (vedi sotto) viene introdotto nel LICA, fino a toccare il clip. L'attenzione deve essere pagato non entrare l'arteria occipitale. (Figura 1)
8. Le arterie tagliate sono aperti, mentre il filamento è inserito nella LICA per occludere l'origine della LMCA nel circolo di Willis.
9. Il terzo nodo sulla LICA è chiuso per riparare il filamento in posizione.
10. I topi ricevere 0,5 ml di soluzione fisiologica per via sottocutanea come riempimento del volume. Per alleviare il dolore, lidocaina gel topico nella ferita.
11. Se la riperfusione è destinato, topi soggiornare per 30-90 occlusione min in una gabbia riscaldata, la ferita potrebbe essere chiuso con una piccola clip di sutura. In seguito, una seconda anestesia viene eseguita, il nodo terzo sulla ICA è momentanea aperto e il filamento ritirata.
12. Le suture rimanenti sono accorciati e la pelle è adattata con una sutura chirurgica.
13. Tutti gli animali ricevono un rifornimento secondo volume come sopra descritto.
14. Gli animali vengono messi in una gabbia riscaldata per due ore per controllare la temperatura corporea.
    1. Gli animali devono essere controllate ogni giorno dopo l'intervento per i segni di disagio. I topi potrebbero mostrare una certa perdita di peso dopo chirurgia. Essi ricevono cibo purè in un piatto di Petri-posta al piano per incoraggiare un'alimentazione. Il cibo è sostituito al giorno per sette giorni.

2. Operazione Sham

1. Per le operazioni di finzione il filamento si inserisce per occludere LMCA e ritirati immediatamente per consentire riperfusione istantaneo (1,8). L'operazione successiva è identica a quella effettuata sugli animali sottoposti a ischemia cerebrale (1,9-1,14), tra cui una seconda anestesia.

3. Preparazione del filamento

1. Sterilità del filamento deve essere considerato. L'utilizzo di attrezzature sterilizzate e una gestione appropriata del filamento è poi un prerequisito per un intervento chirurgico sterile. Disinfezione del filamento è difficile, dal momento che molti dei metodi di sterilizzazione comune può peggiorare la qualità del filamento. Tuttavia i metodi come le radiazioni, per esempio con raggi UV o raggi γ, o sterilizzazione chimica, per esempio con gas altamente reattivi come l'ossido di etilene, sono applicabili.
2. 8,0 filamenti di nylon è tagliato in lunghezza di 11 mm sotto il microscopio
3. La punta filamento deve essere rivestito completamente e in modo uniforme su una lunghezza di 8 mm con una miscela indurente di Xantopren M mucosa ed attivatore NF Optosil

4. Rappresentante Risultati

A seconda della durata della limitazione del flusso sanguigno, motori e comportamentali differenti risultato deficit. Sia dopo 30 e 60 min di ischemia cerebrale, gli animali in molti casi mostrano resistenza ridotta a spinta laterale e girando a causa di disturbi nella locomozione. Manifestano lievi lesioni come posizione flessori nella parte anteriore limbs. Questi segni facilmente osservabile può essere utilizzato come un punteggio di base per il successo dell'operazione ^2.

Morfologicamente la lesione può essere valutata utilizzando istologia o risonanza magnetica (MRI). Sessanta minuti di occlusione dell'arteria cerebrale media produce pannecrosis tessuto in una zona che comprende sia il corpo striato e la neocorteccia, mentre 30 minuti di ischemia causa la morte delle cellule neuronali principalmente limitato a corpo striato. ³ (Figura 2) In termini di volume dell'infarto, ci aspettiamo una deviazione standard inferiore al 30% in una serie di operazioni. La mortalità dipende dal tempo di occlusione con circa il 5% dopo 30 min di ischemia e 10 - 20% dopo 60 min.

Un'altra possibilità minima invasività è l'uso di flussimetria laser Doppler (LDF) durante l'operazione, che consente un controllo diretto del suo successo. In un singolo animale, la riduzione a 10 - 20% dei valori preocclusion indica chiaramente l'induzione di successo di focale ischemia cerebrale ⁴ Tuttavia, LDF non può essere usato come metodo di confronto interindividuale, dal momento che LDF può solo misurare i cambiamenti quantitativi (in percentuale) di sangue. flusso all'interno di un volume del tessuto di piccole e limitate campione. Non dà informazioni sulla portata spaziale della riduzione del flusso sanguigno ^5.

Ci sono diversi test per valutare gli aspetti comportamentali dopo l'ictus, tra cui l'analisi dell'andatura ^6,7, rotarod ^8, Polo di test ^9,10, test di rimozione adesivo ^11,12, test scala ^13,14, gradino prova scaletta ^15,16 e il labirinto ad acqua di Morris ^17. In tutti questi test, i topi sottoposti a MCAo eseguire meno successo rispetto agli animali di controllo.

Figura 1. Schema dell'architettura nave che irrorano il cervello (raffigurato in background) nel topo. Ceppi diversi può mostrare variazioni, ad esempio, l'arteria occipitale lascia a volte da l'arteria carotide interna.

Figura 2. Illustrazione schematica di dimensioni lesione tipica dopo diversi momenti di riperfusione nel modello prossimale MCAo. Nel mezzo, il corso tipico di attività funzionale e flusso ematico cerebrale dopo MCAo sono raffigurati. (MCAo: occlusione dell'arteria cerebrale media, LDF: misura laser Doppler)

Il modello di transitorio, MCA occlusione prossimale ^18,19 imita presentati qui uno dei più comuni tipi di ictus ischemico nei pazienti. ²⁰ Sulla base di tempi di riperfusione variabile, il modello offre vari gradi di danni che vanno da attacco ischemico transitorio (TIA) a grandi infarti, compresi i pezzi più importanti dell'emisfero ischemico. Questo consente al ricercatore di studio diversi meccanismi fisiopatologici dopo l'ictus. ^20,21

Intervento può essere eseguito in un breve periodo di tempo e produce lesioni altamente riproducibili. Tuttavia, questo richiede un controllo accurato dei fattori di confondimento. ²² piccole differenze nella tecnica di funzionamento può spiegare effetti diversi sulla infarto. ^23,24, inoltre, a causa di variazioni in anatomia vascolare cerebrale, diversi ceppi di topi mostrano un risultato diverso. ^25,26 Corpo temperatura influisce danni neurologici, con ipotermia porta a lesioni più piccole ²⁷ e ipertermia più gravi deficit. ^{28 Di} conseguenza, il controllo della temperatura e la manutenzione è molto importante in questo modello. ²⁹ Inoltre, la pressione sanguigna e dei gas del sangue sono importanti fattori di confondimento dei risultati e la necessità di essere monitorato. ^30,31 L'uso di metodi invasivi e veloce minima (misurazione non invasiva della pressione sanguigna, adatte e facilmente accessibili i siti di raccolta del sangue) è raccomandato. La scelta della anestesia è anche molto importante, in quanto alcuni possono avere degli effetti neuroprotettivi, e / o vasodilatatori, come ad esempio isoflurano. ^{32 Di} conseguenza, l'esposizione ad anestesia deve essere il più breve possibile e standardizzati. Escludiamo animali che hanno subito un intervento chirurgico per più di 15 min.

Rasatura del sito chirurgico produce microabrasions e l'infiammazione e rilascia frammenti di capelli. Questo potrebbe ulteriormente aumentare l'infiammazione e favorire infezioni locali, che potrebbero ripercuotersi sulla fisiopatologia ictus. Condizioni abitative, in particolare l'uso di arricchimento, può influire sull'esito ictus e devono essere standardizzati e descritti in rapporti di ricerca. ^6,33,34 L'uso di arricchimento ambientale e il suo effetto sulla riproducibilità è una questione di discussione. ³⁵ Un altro fattore confondente importante è il Corsa rischio indotto di infezione soprattutto dopo lunghi periodi di ischemia ^36, che conduce alla morbilità supplementare e un aumento della mortalità. ^37,38 Come diventare infezioni sintomatiche al giorno verso le 3 a 5, questo ha conseguenze importanti per un lungo periodo di follow-up in tali modelli.

Per produrre risultati rilevanti per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per l'ictus, normazione e controllo qualità è molto importante in studi preclinici ricerca traslazionale corsa ³⁹ "Good Laboratory Practice" ^40,41 mandati.:

1. una descrizione appropriata e dettagliata degli animali utilizzati;
2. calcolo della dimensione del campione e la segnalazione delle dimensioni effetto atteso;
3. criteri di inclusione ed esclusione, impostare prima dello studio;
4. randomizzazione della ripartizione in gruppi;
5. occultamento di allocazione relativamente agli investigatori;
6. segnalazione animali esclusi dall'analisi;
7. valutazione in cieco degli esiti;
8. segnalazione di potenziali conflitti di interesse e fondi di studio.

Questo lavoro è stato finanziato dal Settimo programma quadro della Comunità europea (FP7/2007-2013) in convenzione di sovvenzione n ° 201024 en ° 202213 (Rete europea Stroke). Ulteriori finanziamenti è stato dato dal Bundesministerium für Bildung und Forschung (Center for Stroke Research Berlino), e la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Exzellenzcluster NEUROCURE).

Gli autori desiderano ringraziare Mareike Thielke (Dip. di Neurologia Sperimentale, Charité di Berlino) per il sostegno durante l'operazione e Elke Ludwig (Charité Video Services) per produrre l'animazione.