דוגמנות שבץ בעכברים - העורקים התיכון ספיגה מוחין עם דגם נימה

פילמנטיות חסימה של עורק המוח התיכון הוא מודל משותף לחקר שבץ איסכמי בעכברים.

שבץ מוחי הוא בין הגורמים השכיחים ביותר למוות ונכות מבוגר, במיוחד במדינות מפותחות. עם זאת, אפשרויות הטיפול עד כה מוגבלים מאוד. כדי לענות על הצורך גישות טיפוליות הרומן, שבץ מחקר ניסיוני לעתים קרובות מעסיקה מודלים מכרסמים ischaemia מוחי מוקדי. רוב החוקרים להשתמש חסימה קבועה או חולפת של עורק המוח האמצעי (MCA) בעכברים או חולדות.

חסימה הפרוקסימלי של עורק המוח האמצעי (MCA) באמצעות טכניקת תפר intraluminal (מה שנקרא חוט להט או מודל תפר) הוא כנראה דגם הנפוצות ביותר בשימוש במחקר ניסיוני שבץ. המודל intraluminal MCAO מציעה את היתרון של גרימת ischaemia חולפת או קבועה לשחזור השטח MCA בצורה יחסית לא פולשנית. גישות Intraluminal לקטוע את זרימת הדם בכל השטח של העורק הזה. נימה חסימה ובכך מעצרים תזרים הפרוקסימלי של lenticulo-מפוספסים העורקים, אשר מספקים את הגרעינים הבזליים. נימה חסימה של תוצאות MCA בנגעים לשחזור בקליפת המוח ואת בסטריאטום והוא יכול להיות קבוע או חולף. לעומת זאת, מודלים גרימת דיסטלי (עם הסתעפות של lenticulo-מפוספסים העורקים) MCA חסימה בדרך כלל לחסוך בסטריאטום ובעיקר לערב את הניאוקורטקס. בנוסף המודלים האלה דורשים craniectomy. במודל הפגינו במאמר זה, חוט סיליקון מצופה מוחדר לעורק התרדמה המשותף ומתקדם לאורך בעורק התרדמה הפנימי לתוך המעגל של ויליס, שם הוא חוסם את מקורו של עורק המוח האמצעי. בחולים, occlusions של עורק המוח האמצעי הם בין הגורמים השכיחים ביותר של שבץ איסכמי. מאז במרווחים משתנים איסכמי ניתן לבחור בחופשיות במודל זה תלוי בנקודת הזמן של reperfusion, נגעים איסכמיים בדרגות שונות של חומרה יכול להיות מיוצר. Reperfusion על ידי הסרת החוט occluding לפחות חלקית מודלים החזרת זרימת הדם לאחר תמוגה (tPA) ספונטני או טיפולית של קריש תרומבואמבוליים בבני אדם.

בסרט זה נציג את הטכניקה הבסיסית, כמו גם את החסרונות העיקריים לערפלנים אשר עלולה להגביל את ערך החיזוי של המודל הזה.

כדי להבטיח איכות reproducibility גבוהה, אנו ממליצים על שימוש נהלי עבודה סטנדרטיים (SOP). בסרטון הזה, SOPs שפורסם התפתח בשימוש במעבדה שלנו מוחלים ^1.

1. התיכון חסימת העורקים מוחין

1. עכברים הם מורדמים עם המשטר הרדמה המתאים להתייעץ עם צוות וטרינרי. (אינדוקציה למשל עם 1.5 - 2% Isoflurane ותחזוקה עם 1.0-1.5% Isoflurane ב 2 / 3 N 2 O ו - 1 / 3 O2 שימוש במכשיר אידוי).
   1. טמפרטורת הגוף של העכברים נשמר 36.5 ° C ± 0.5 מעלות צלזיוס במהלך הניתוח עם צלחת החימום. חימום מבוקר משוב כרית, אשר מחמם על פי הטמפרטורה בפי הטבעת של העכבר, מומלץ מאוד.
   2. לחטא את העור שמסביב פרווה עם סוכן מתאים (למשל 70% אתיל אלכוהול) ויבש אותו לאחר מכן.
2. חתך בצוואר קו האמצע הוא עשה את הרקמות הרכות נמשכים מזה.
3. עורק התרדמה השמאלי משותף (LCCA) הוא גזור בקפידה ללא העצבים הסובבים (מבלי לפגוע עצב מחנק) ו ליגטורה נעשית באמצעות 6.0/7.0 מחרוזת. מחרוזת 5.0 יכול לשמש גם.
4. עורק התרדמה השמאלי חיצוני (LECA) מופרד אז הקשר השני הוא עשה.
5. בשלב הבא, עורק התרדמה הפנימי השמאלי (LICA) מופרד קשר מוכנה עם נימה 6.0.
6. לאחר השגת תצפית טובה על עורק התרדמה הפנימי השמאלי (LICA) ואת pterygopalatine העורק השמאלי (אמ"ע), העורקים הן מקוטע, באמצעות קליפ כלי הדם.
7. חור קטן הוא חתך LCCA לפני שהוא bifurcates את LECA ואת LICA. Monofilament עשוי ניילון 8.0 מצופה בתערובת hardener סיליקון (ראו להלן) הוא הציג אז אל LICA, עד שייעצר על קליפ. שימו לב יש לשלם לא להיכנס עורק העורפית. (איור 1)
8. העורקים מקוטע נפתחים בעוד נימה מוכנס לתוך LICA כדי לחסום את המקור של LMCA במעגל של ויליס.
9. הקשר השלישי על LICA סגור כדי לתקן את הסיב בעמדה.
10. העכברים לקבל 0.5 מ"ל תמיסת מלח תת עורי כמו חידוש נפח. להקלה על הכאב, לידוקאין הוא ג'ל למריחה על העור, בתוך הפצע.
11. אם reperfusion נועד, עכברים להישאר 30-90 דקות חסימה בכלוב מחומם, הפצע יכול להיות סגור עם קליפ תפר קטן. לאחר מכן, הרדמה השני הוא ביצע, את הקשר השלישי הרשפ"ת היא רגעית נפתחה החוט נסוגה.
12. התפרים הנותרים הם קיצרו את העור מותאם עם תפר כירורגי.
13. כל בעלי החיים מקבלים חידוש הכרך השני כמתואר לעיל.
14. חיות הן לשים בכלוב מחומם למשך שעתיים כדי לשלוט על טמפרטורת הגוף.
    1. בעלי חיים חייבים להיבדק מדי יום לאחר הניתוח סימנים של אי נוחות. העכברים יכול להראות כמה אובדן משקל שלאחר הניתוח. הם מקבלים מזון מחית בצלחת פטרי, שהונח על הרצפה כדי לעודד אכילה. האוכל מוחלף מדי יום במשך שבעה ימים.

2. שאם מבצע

1. עבור פעולות זיוף החוט מוכנס כדי לחסום LMCA ומסוגר באופן מיידי כדי לאפשר reperfusion מיידיות (1.8). המבצע הבאים זהה לזו של בעלי חיים שעברו ischaemia מוחין (1.9-1.14) כולל הרדמה השני.

3. הכנת החוט

1. עקרות של החוט צריך להיחשב. שימוש בציוד עיקור וכן וטיפול הולם נימה לאחר מכן היא תנאי הכרחי ניתוח סטרילי. חיטוי של נימה היא קשה, שכן רבות מהשיטות הנפוצות עיקור עלולה להחמיר את איכות החוט. אולם שיטות כגון קרינה, למשל עם אור UV או קרני γ, או עיקור כימי, למשל עם גזים תגובתי כגון אתילן אוקסיד, תקפים.
2. 8.0 חוט ניילון הוא חתך לתוך באורכים של 11 מ"מ מתחת למיקרוסקופ
3. קצה החוט חייב להיות מצופה לחלוטין באופן שווה על פני אורך של 8 מ"מ בתערובת של hardener Xantopren M רירית Activator NF Optosil

4. נציג תוצאות

בהתאם תקופת ההגבלה זרימת הדם, מנוע שונה והתנהגותיים בעקבות גירעונות. גם אחרי 30 ו - 60 דקות של ischaemia מוחין, חיות ברוב המקרים להראות התנגדות ירד לדחוף לרוחב והקיפו בשל הפרעה לתנועה. פצעים קלים להתבטא במצב מכופף את li מולMBS. סימנים אלו נצפות בקלות יכול לשמש ציון בסיסי להצלחת המבצע. ²

מורפולוגית הנגע ניתן להעריך או באמצעות היסטולוגיה או תהודה מגנטית (MRI). שישים דקות חסימה של עורק המוח האמצעי מייצרת pannecrosis רקמה בשטח כולל בסטריאטום והן הניאוקורטקס, ואילו 30 דקות של ischaemia לגרום מוות של תאים עצביים בעיקר מוגבל בסטריאטום. ³ (איור 2) מבחינת היקף האוטם, אנו מצפים סטיית תקן נמוכה יותר מאשר 30% בערכה של פעולות. התמותה תלויה בזמן עם חסימה סביב 5% לאחר 30 דקות של ischaemia ו 10 - 20% לאחר 60 דקות.

אפשרות נוספת פולשני מינימלי הוא השימוש לייזר דופלר flowmetry (LDF) במהלך המבצע, המאפשר שליטה ישירה של ההצלחה שלה. בשנת חיה בודדים, הפחתה עד 10 - 20% של ערכים preocclusion מצביע בבירור על גיוס מוצלח של איסכמיה מוחית מוקד ⁴ עם זאת, LDF אינו יכול לשמש כאמצעי להשוואות interindividual, מאז LDF יכול רק למדוד שינויים כמותיים (באחוזים) של דם. הזרימה בתוך נפח קטן ומוגבל דגימת רקמות. זה לא נותן מידע על היקף המרחבי של הפחתת זרימת הדם. ⁵

ישנן מספר בדיקות כדי להעריך את ההיבטים ההתנהגותיים לאחר שבץ, ניתוח כולל הילוך ^6,7, Rotarod ^8, הקוטב מבחן ^9,10 הבדיקה, הסרת דבק ^{11,12, 13,14} גרם מדרגות מבחן, מבחן שלב בסולם ^15,16 ו מבוך מוריס מים ^17. בכל המבחנים הללו, עכברים נתון MCAo לבצע בהצלחה פחות מאשר בעלי חיים שליטה.

באיור 1. Scheme של ארכיטקטורת כלי לספק את המוח (מתואר ברקע) ב העכבר. זנים שונים עשויים להציג וריאציות, למשל העורק העורפית לפעמים עלים בעורק התרדמה הפנימי.

איור 2. איור סכמטי של נגעים גדלים בדרך כלל אחרי נקודות זמן שונות של reperfusion במודל MCAo הפרוקסימלי. באמצע, במהלך אופייני של פעילות פונקציונלית זרימת הדם במוח לאחר MCAo מתוארים. (MCAo: חסימה בעורק המוח התיכון, LDF: לייזר דופלר למדידת זרם)

המודל של חולף, הפרוקסימלי MCA חסימה ^18,19 המוצגים כאן מחקה את אחד הסוגים הנפוצים ביותר של שבץ איסכמי בחולים. סמך ²⁰ פעמים reperfusion משתנה, המודל מציע דרגות שונות של נזק החל התקף איסכמי חולף (TIA) גדולים אוטמים כולל החלקים העיקריים של האונה איסכמי. זו מאפשרת לחוקר לבחון מנגנוני pathophysiological שונה לאחר שבץ. ^20,21

הניתוח יכול להתבצע בתוך פרק זמן קצר ומייצרת נגעים לשעתקו מאוד. עם זאת, זה דורש בקרה מעמיקה של לערפלנים. ²² הבדלים קטנים בטכניקת הניתוח עשוי להסביר את השפעות שונות על האוטם. ^23,24 יתר על כן, בשל סטיות באנטומיה של כלי הדם המוחיים, עכבר זנים שונים להראות תוצאה אחרת. ^25,26 גוף הטמפרטורה משפיעה על נזק נוירולוגי, עם היפותרמיה המוביל נגעים קטנים ²⁷ ו היפרתרמיה כדי גירעונות חמורים יותר. ²⁸ לפיכך, בקרת טמפרטורה ותחזוקה רלוונטי ביותר במודל זה. ²⁹ בנוסף, לחץ הדם ואת גזי הדם לערפלנים חשוב של התוצאה ואת הצורך להיות במעקב. ^30,31 שימוש בשיטות פולשניות מהיר מינימלי (לא פולשנית למדידת לחץ דם, מתאים וקל נגיש אוסף אתרים דם) מומלץ. הבחירה של ההרדמה הוא גם חשוב מאוד, כמו כמה יש תופעות neuroprotective, ו / או להיות vasodilators, כמו למשל Isoflurane. ³² כתוצאה מכך, החשיפה הרדמה צריך להיות קצר ככל האפשר סטנדרטית. אנו לא כוללים חיות אשר עברו ניתוח דקות יותר מ 15.

גילוח באתר כירורגית מייצרת microabrasions ודלקת ומשחרר שברי שיער. זה עשוי להגביר את הדלקת לטפח זיהום מקומי, אשר עשוי להשפיע על פתופיזיולוגיה שבץ. תנאי הדיור, במיוחד את השימוש העשרה, עשוי להשפיע על התוצאה שבץ צריך להיות סטנדרטי המתואר דוחות מחקר. ^6,33,34 השימוש העשרת הסביבה והשפעתה על reproducibility היא עניין של דיון. Confounder ³⁵ נוסף חשוב הוא הסיכון הנגרם משבץ עבור זיהום במיוחד לאחר פעמים יותר של ischaemia ^36, אשר מוביל לתחלואה ותמותה מוגברת נוספים. ^37,38 כמו זיהומים להיות סימפטומטי בסביבות יום 3-5, זה יש השלכות חשובות לטווח ארוך מעקב מודלים כאלה.

כדי לייצר תוצאות רלוונטיות לפיתוח אסטרטגיות טיפול חדשנית סטנדרטיזציה שבץ, בקרת איכות חשוב ביותר במחקר קליני שבץ translational ³⁹ "נהלי מעבדה תקינים" ^40,41 מנדטים.:

1. תיאור הולם ומפורט של בעלי החיים המשמשים;
2. גודל המדגם חישוב ודיווח על גודל ההשפעה הצפויה;
3. הכלה והדרה קריטריונים, הקים לפני המחקר;
4. אקראיות ההקצאה לקבוצות;
5. הקצאת הסתרה לגבי החוקרים;
6. דיווח חיות מחוץ ניתוח;
7. הערכה עיוור התוצאה;
8. דיווח התנגשויות פוטנציאליות של עניין מימון ללימודים.

עבודה זו מומנה על ידי תוכנית המסגרת השביעית של הקהילה האירופית (FP7/2007-2013) מענק לפי הסכם n ° 201024 ו n ​​° 202213 (רשת שבץ האירופי). מימון נוסף ניתנה על ידי für Bundesministerium Bildung und Forschung (המרכז לחקר שבץ ברלין), ואת Forschungsgemeinschaft דויטשה (Exzellenzcluster NEUROCURE).

המחברים מבקשים להודות Mareike Thielke (Dep. עבור Experimental Neurology, Charité ברלין) על התמיכה במהלך המבצע אלקה לודוויג (Charité שירותי וידאו) להפקת האנימציה.