Sviluppo di imaging automatizzati e analisi chimiche per gli schermi zebrafish.

Riportiamo lo sviluppo di un sistema automatizzato per l'imaging e l'analisi di zebrafish embrioni transgenici in piastre a pozzetti multipli. Questo dimostra la capacità di misurare gli effetti dose-dipendente di una piccola molecola, BCI, sull'espressione del gene del fattore di crescita dei fibroblasti giornalista e fornire tecnologia per stabilire high-throughput schermi chimici zebrafish.

Dimostriamo l'applicazione di image-based di alto contenuto di screening (HCS) metodologia per identificare piccole molecole in grado di modulare l'FGF / RAS / MAPK in embrioni di zebrafish. L'embrione di zebrafish è un sistema ideale per in vivo di alto contenuto schermi chimici. L'1-day embrione è di circa 1 mm di diametro e può essere facilmente disposte in piastre a 96 pozzetti, un formato standard per lo screening ad alto rendimento. Durante il primo giorno di sviluppo, gli embrioni sono trasparenti con la maggior parte dei principali organi presenti, permettendo così la visualizzazione della formazione di tessuto durante l'embriogenesi. La completa automazione degli schermi chimici zebrafish è ancora una sfida, tuttavia, in particolare nello sviluppo di acquisizione delle immagini e analisi automatizzate. Abbiamo generato in precedenza una linea giornalista transgenico che esprime la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo di attività FGF e dimostrato la loro utilità negli schermi chimici

1) Impostare accoppiamenti zebrafish e trattamento BCI.

1. Due giorni prima del trattamento, identificare omozigoti maschi Tg (dusp6: d2eGFP) ^PT6 zebrafish e luogo singolarmente in vasche di accoppiamento ^1. Aggiungi separatore e un tipo di pesce selvatico AB * femminile e lasciare in gabbie di accoppiamento durante la notte.
2. La mattina seguente togliere il separatore e raccogliere embrioni dopo 1 ora. Trasferimento degli embrioni a 100 mm con piatti E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4), soluzione e incubare a 28 ° C per 6 ore. Rimuovere morto e non fecondate embrioni, aggiungere soluzione fresca E3, e incubare una notte.
3. Ordina embrioni transgenici per equivalente stadio (24hpf) e di espressione GFP uniforme. Embrioni Array individualmente in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti.
4. Rimuovere l'eccesso di soluzione E3 con una micropipetta. Aggiungere 200μl di soluzione E3 con un pipettatore multicanale in ciascun pozzetto.
5. Aggiungere i seguenti composti elencati:
   
   

   1

   2

   3

   4

   5

   6

   7

   8

   9

   10

   11

   12

   A

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0.5mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0.5mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl DMSO

   B

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0.5mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0.5mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl DMSO

   C

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0.5mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0.5mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl DMSO

   D

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0.5mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0.5mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl DMSO

   E

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0.5mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0.5mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl DMSO

   F

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0.5mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0.5mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl DMSO

   G

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0.5mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0.5mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mM)

   2μl DMSO

   H

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0.5mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl BCl (0.1mm)

   2μl BCl (0.5mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl DMSO

   Concentrazioni finali sono 1μM, 5 micron, 10μM, 20μM, BCI 25 micron in 1% di DMSO. Piastra di copertura in fogli di alluminio e incubare per 6 ore a 28 ° C.

2) imaging automatico di piastre a 96 pozzetti e analisi.

1. Aggiungere 10μl di tricaine (0.61mM) in ciascun pozzetto per anestetizzare gli embrioni 30hpf.
2. Piatto di carico in Molecular Devices ImageXpress Ultra.
3. Aprire Metaxpress software. Scegliere una configurazione con un obiettivo 4x e diametro massimo foro stenopeico, configurare laser messa a fuoco automatica per rilevare fondo piatto, e determinare ottimale Z-piano per rilevare le regioni di interesse. Acquisire immagini a eccitazione / emissione di lunghezze d'onda di 488/525 nm (GFP). Impostare la scansione area come un unico sito di 2000x2000 pixel (4 x 4 mm) senza binning. Configurare potenza del laser e guadagno in modo che le regioni più luminose nelle immagini di controllo positivo non saturare. Confermare l'acquisizione corretta di immagini in diversi pozzetti di controllo positivi e negativi.
4. Avviare la scansione piatto. Lo strumento automaticamente acquisire immagini da tutti i pozzetti e archiviarli in un database SQL Server.
5. Caricare immagini in Developer Definiens utilizzando il modulo applicativo Cellenger e un filtro di importazione che riconosce il formato di immagine e la struttura del file generato dalla piattaforma Molecular Devices ImageXpress Ultra.
6. Elaborare le immagini con un algoritmo progettato Technology Network Cognizione (designato anche un insieme di regole). L'algoritmo che abbiamo sviluppato in base personalizzati su un insieme di regole recentemente pubblicato ^2, è stato progettato per identificare automaticamente embrione, tuorlo, e la testa, e di quantificare la luminosità e la zona di GFP che esprimono le strutture testa. Wells in cui viene rilevato nessun embrione o in cui la testa non può essere assegnato senza ambiguità (ad esempio, con tossicità composto alta o immagini sfocate) sono esclusi dall'analisi. Configurare l'algoritmo utilizzando diverse immagini di controllo negativo (veicolo trattati) e le immagini di controllo positivo (BCI trattati) in modo tale che la testa e tuorlo sono identificati correttamente in entrambi. Impostare una "testa di strutture" soglia di rilevamento come multipli di intensità medio tuorlo fino rilevamento di strutture testa brillanti partite osservazione visiva. Definire i parametri per l'esportazione. In questo esempio, il parametro più informativo è stata la luminosità totale integrata di GFP-positive regioni all'interno della testa, di seguito definito "totale luminosità testa strutture" (Figura 1).
   
   
   Figura 1
   Grafico depicitng gli effetti dose-dipendente della BCI sull'espressione GFP negli embrioni transgenici.
7. Eseguire l'algoritmo su tutte le immagini utilizzando la piastra integrata job scheduler. Il software Definiens utilizza il calcolo distribuito su diversi processori ("motori"), che consente l'analisi simultanea di più immagini. L'algoritmo calcola le misure numeriche sulla base dei risultati della analisi delle immagini, che vengono salvati nel database insieme ad una copia dell'immagine trattati, con l'analisi applicata.

Rappresentante dei risultati:

Dopo tutte le immagini sono analizzate, i dati possono essere visualizzati all'interno Cellenger o esportati a software di terze parti (Excel, GraphPad Prism) per ulteriori analisi e di rappresentazione grafica. La figura 2 mostra le immagini archiviate scansione da un veicolo e un trattato BCI-trattati bene, con e senza CNT analisi applicata. La figura 1 documenta un effetto dose-dipendente della BCI sull'espressione genica giornalista GFP nel Tg (dusp6: d2EGFP) ^PT6 embrioni. La concentrazione di richieste per provocare una risposta mezzo massimo (EC50) è stato di circa 12 micron.


Figura 2
Immagine di acquisizione automatica e l'analisi di embrioni di zebrafish transgenico. (A) veicolo DMSO trattati Tg (dusp6: d2eGFP) ^PT6 embrione a 30hpf. (B) gli embrioni transgenici trattati con spettacolo 20μM BCI aumenti di espressione GFP. (C) Immagine di embrione da (A) dopo l'esecuzione Definiens insieme di regole per trovare espressione GFP nella testa. Macchie arancione indicano dove il software misura l'intensità GFP. (D) Immagine di embrione da (B) dopo l'esecuzione Definiens insieme di regole per trovare espressione GFP nella testa. Macchie arancione indicano dove il software misura l'intensità GFP. Si noti che l'insieme di regole è stata in grado di trovare uno spazio allargato di espressione GFP nell'embrione trattati.

Un fattore importante che limita la velocità di schermi chimici zebrafish è la mancanza di una metodologia per elaborare sistematicamente le piastre a 96 pozzetti per l'imaging e analisi. Poiché le immagini degli organismi multicellulari sono complessi, a basso contrasto, e di natura eterogenea, esistenti algoritmi di analisi delle immagini non riescono a individuare e quantificare le strutture specifiche all'interno dell'organismo. La maggior parte pubblicati schermi chimici zebrafish quindi coinvolgere l'esame visivo di singoli pozzi da parte di personale dedicato tutta la procedura. Questo impedisce che di solito la generazione di letture numeriche e una completa archiviazione delle immagini dello schermo e dati. Inoltre, la valutazione manuale eliminates alcuni vantaggi chiave di image-based di screening, cioè la capacità di condurre analisi retrospettive di prestazioni dello schermo, per esaminare i cambiamenti fenotipici che non erano l'obiettivo primario della campagna di screening (per esempio, la tossicità o difetti di sviluppo) e di attraversare di riferimento dei dati di screening con schermi passate o future utilizzando la stessa libreria composto.

In questo rapporto si evidenzia la metodologia per l'imaging e l'analisi automatizzata di embrioni di zebrafish in piastre a pozzetti multipli senza l'intervento dell'utente. Noi la cattura delle immagini automatico su un laser a scansione confocale ImageXpress Ultra lettore (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) per l'immagine Tg (dusp6: d2EGFP) ^PT6 embrioni in 96 pozzetti e sviluppato un algoritmo di analisi di immagine basato sulla tecnologia Cognizione Definiens 'di rete che GFP quantificati espressione nelle teste degli embrioni transgenici. Il metodo consegnato risposte classificato e quantificato in vivo di una piccola molecola attivatore di FGF segnalazione. Risultati simili sono stati ottenuti con l'epifluorescenza a base ArrayScan II (Cellomics Inc., Pittsburgh PA) documenta che è possibile implementare la cattura automatica delle immagini di embrioni di zebrafish su una varietà di lettori di piastre in commercio ^2. Lo sviluppo della metodologia per analizzare automaticamente le immagini organismo pluricellulare eliminato la necessità di segnare visivo da un osservatore umano e ha permesso la generazione e l'archiviazione di dati numerici e immagini per l'analisi retrospettiva e confronti con schermi futuro.

Questo lavoro è finanziato dal NICHD / NIH (1R01HD053287) per Hukriede, NCI / NIH (P01 CA78039) per Vogt, e NHLBI / NIH (1R01HL088016) per Tsang.