Entwicklung von automatisierten Imaging und Analyse für Zebrafisch chemische Bildschirme.

Wir berichten über die Entwicklung eines Systems zur automatisierten Abbildung und Analyse von Zebrafisch-transgenen Embryos in Mikrotiterplatten. Dies demonstriert die Fähigkeit, dosisabhängige Wirkung eines kleinen Moleküls, BCI, auf Fibroblast Growth Factor Expression des Reportergens zu messen und Technologie für den Aufbau High-Throughput-Zebrafisch chemische Bildschirme.

Wir demonstrieren die Anwendung der Image-basierten High-Content-Screening (HCS)-Methode, um kleine Moleküle, die Modulation der FGF / RAS / MAPK-Weg kann in Zebrafisch-Embryonen zu identifizieren. Der Zebrafisch Embryo ist ein ideales System für In-vivo-High-Content-chemischen Bildschirme. Die 1-Tage alten Embryo ist ca. 1mm im Durchmesser und lässt sich einfach in 96-Well-Platten, ein Standardformat für das Hochdurchsatz-Screening angeordnet werden. Während der ersten Tage der Entwicklung, sind Embryonen transparent mit den meisten der wichtigsten Organe vorhanden, so dass Visualisierung von Gewebe-Bildung während der Embryogenese. Die vollständige Automatisierung der Zebrafisch-chemischen Bildschirmen ist immer noch eine Herausforderung, aber vor allem in der Entwicklung von automatisierten Bildaufnahme und-analyse. Wir zuvor generierte eine transgene Reporter Linie, grün fluoreszierende Protein (GFP) bringt unter der Kontrolle von FGF-Aktivität und demonstriert deren Nutzen in der chemischen-Bildschirme

1) Stellen Sie Zebrafisch Paarungen und BCI-Behandlung.

1. Zwei Tage vor der Behandlung, zu identifizieren homozygoten männlichen Tg (dusp6: d2EGFP) ^pt6 Zebrafisch und Ort individuell in Paarung Tanks ^1. Add-Separator und einer Wildtyp-AB * weiblichen Fische und lassen Sie bei der Paarung Käfigen übernachten.
2. Am nächsten Morgen nehmen Sie die Trennzeichen und sammeln Embryonen nach 1 Stunde. -Embryonen zu 100mm Gerichte mit E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4), Lösung, Inkubation bei 28 ° C für 6 Stunden. Entfernen Sie leere und unbefruchtete Embryonen, fügen frische E3-Lösung und Inkubation über Nacht.
3. Sortieren transgenen Embryonen für ähnliche Stufe (24hpf) und einheitliche GFP-Expression. Array Embryonen einzeln in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte.
4. Entfernen Sie überschüssiges E3-Lösung mit der Pipette. Add 200 ul der E3-Lösung mit einem Multi-Kanal-Pipette in jede Vertiefung.
5. Fügen Sie die folgenden Verbindungen als aufgelistet:
   
   

   1

   2

   3

   4

   5

   6

   7

   8

   9

   10

   11

   12

   A

   2μl DMSO

   2μl BCl (0,1 mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl BCl (0,1 mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl DMSO

   B

   2μl DMSO

   2μl BCl (0,1 mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl BCl (0,1 mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl DMSO

   C

   2μl DMSO

   2μl BCl (0,1 mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl BCl (0,1 mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl DMSO

   D

   2μl DMSO

   2μl BCl (0,1 mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl BCl (0,1 mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl DMSO

   E

   2μl DMSO

   2μl BCl (0,1 mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl BCl (0,1 mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl DMSO

   F

   2μl DMSO

   2μl BCl (0,1 mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl BCl (0,1 mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl DMSO

   G

   2μl DMSO

   2μl BCl (0,1 mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl BCl (0,1 mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mM)

   2μl DMSO

   H

   2μl DMSO

   2μl BCl (0,1 mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl BCl (0,1 mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1mm)

   2μl BCl (2mm)

   2μl BCl (2,5 mm)

   2μl DMSO

   Endkonzentrationen sind 1 &mgr;, 5 um, 10 um, 20 um, 25 um BCI in 1% DMSO. Abdeckplatte in Alufolie und inkubieren für 6 Stunden bei 28 ° C.

2) Automated Imaging von 96-Well-Platten und-analyse.

1. Add 10 &mgr; l der Tricaine (0,61 mm) in jede Vertiefung zu 30hpf Embryonen zu betäuben.
2. Lastplatte in Molecular Devices ImageXpress Ultra.
3. Öffnen Metaxpress Software. Wählen Sie eine Konfiguration mit 4-fach Objektiv und maximale Durchmesser der Blende, konfigurieren Laserautofokus auf Plattenboden erkennen und bestimmen optimale Z-Ebene in Regionen von Interesse zu erkennen. Erwerben Sie Bilder auf Anregung / Emissionswellenlängen 488/525 nm (GFP). Set Scan-Bereich als eine einzige Stelle 2000x2000 Pixel (4 x 4 mm) ohne Binning. Konfigurieren Laserleistung und gewinnen, so dass hellsten Regionen in positive Kontrolle Abbildungen müssen nicht sättigen. Überprüfen Sie die Bildaufnahme in mehreren positiven und negativen Kontroll-Wells.
4. Starten Platte zu scannen. Das Gerät wird automatisch erwerben Bildern aus allen Vertiefungen und archivieren sie in einer SQL Server-Datenbank.
5. Bilder hochladen in Definiens Developer mit dem Cellenger application module und ein Import-Filter, der Bild-Format und Datei-Struktur, die durch die Molecular Devices ImageXpress Ultra-Plattform generiert erkennt.
6. Prozess Bilder mit einer speziell entworfenen Cognition Network Technology Algorithmus (auch als einen Regelsatz). Der Algorithmus, den wir Sitte auf einer kürzlich veröffentlichten Regelsatz ^2-Basis entwickelt wurde, ist entworfen, um automatisch zu identifizieren Embryo, Eigelb, und Kopf, und die Helligkeit und den Bereich der GFP-exprimierenden Kopf Strukturen zu quantifizieren. Wells, in denen kein Embryo nachgewiesen ist oder wo der Kopf kann nicht eindeutig zugeordnet werden (z. B. mit hoher Verbindung Toxizität oder unscharfe Bilder) werden aus der Analyse ausgeschlossen. Konfigurieren Sie den Algorithmus mit mehreren negativen Kontrolle Bilder (Fahrzeug behandelt) und der positiven Kontrolle Bilder (BCI) behandelt, so dass Kopf und Eigelb richtig in beide identifiziert. Setzen Sie ein "Kopf-Strukturen" Nachweisgrenze als Vielfaches der mittleren Eigelb Intensität bis zur Erkennung von hellen Kopf Strukturen entspricht die visuelle Beobachtung. Definieren Sie Parameter für den Export. In diesem Beispiel wurde die informative Parameter die gesamte integrierte Helligkeit des GFP-positive Regionen innerhalb des Kopfes, nachfolgend als "totalen Kopf Strukturen Helligkeit" (Abbildung 1).
   
   
   Abbildung 1
   Graph depicitng die dosisabhängige Wirkung von BCI auf GFP-Expression in transgenen Embryos.
7. Führen Sie den Algorithmus, der auf allen Platten Bilder mit der integrierten Job-Scheduler. Die Definiens-Software verwendet verteiltes Rechnen auf mehreren Prozessoren ("Engines"), wodurch die gleichzeitige Analyse mehrerer Bilder. Der Algorithmus berechnet numerische Maßnahmen auf die Ergebnisse der Bildanalyse, die in der Datenbank gespeichert sind zusammen mit einer Kopie des zu bearbeitenden Bildes mit der Analyse angewendet wird.

Repräsentative Ergebnisse:

Nachdem alle Bilder analysiert werden, können die Daten innerhalb Cellenger visualisiert oder exportiert Software von Drittanbietern (Excel, GraphPad Prism) zur weiteren Analyse und grafische Darstellung. Abbildung 2 zeigt archivierte Bilder scannen aus einem Fahrzeug behandelt und gut, mit und ohne CNT-Analyse angewendet BCI-behandelt. Abbildung 1 Dokumente eine dosisabhängige Wirkung von BCI auf GFP Expression des Reportergens in Tg (dusp6: d2EGFP) ^pt6 Embryonen. Die Konzentration erforderlich, um eine halbmaximale Reaktion (EC50) zu entlocken war etwa 12 um.


Abbildung 2
Automatisierte Bilderfassung und Analyse von transgenen Zebrafisch-Embryos. ^Pt6 Embryo 30hpf: (A) DMSO Fahrzeug Tg (d2EGFP dusp6) behandelt. (B) Transgene Embryonen mit 20 um BCI zeigen behandelt steigt in die GFP-Expression. (C) Bild von Embryos aus (A) nach dem Ausführen Definiens Regelsatz auf GFP-Expression in den Kopf zu finden. Orange Flecken bezeichnen, wo die Software GFP Intensität Maßnahmen. (D) Bild von Embryos aus (B) nach dem Ausführen Definiens Regelsatz auf GFP-Expression in den Kopf zu finden. Orange Flecken bezeichnen, wo die Software GFP Intensität Maßnahmen. Beachten Sie, dass der Regelsatz in der Lage, einen erweiterten Bereich der GFP-Expression in den behandelten Embryo zu finden war.

Ein wesentlicher Faktor, der den Durchsatz von Zebrafisch-chemischen Bildschirmen ist der Mangel an Methoden zur systematischen Prozess 96-Well-Platten für die Bildgebung und Analyse. Weil Bilder von vielzelligen Organismen komplexer, geringem Kontrast sind und heterogener Natur, nicht vorhandenes Bild-Analyse-Algorithmen zur Detektion und Quantifizierung spezifischer Strukturen innerhalb des Organismus. Die meisten veröffentlichten Zebrafisch chemische Bildschirme sind daher mit visuellen Prüfung der einzelnen Vertiefungen durch engagierte Mitarbeiter während des gesamten Verfahrens. Normalerweise verhindert die Erzeugung von numerischen Anzeigen und eine vollständige Archivierung der Bildschirm Bilder und Daten. Darüber hinaus entfällt die manuelle Auswertung einige wesentliche Vorteile von image-based Screening, das heißt die Fähigkeit, retrospektive Analysen von Screen-Performance durchzuführen, um phänotypische Veränderungen, die nicht der primäre Fokus des Screening-Kampagne (zB Toxizität oder Entwicklungsstörungen) zu untersuchen und Kreuz -Referenz-Screening-Daten mit Vergangenheit oder Zukunft Bildschirme mit der gleichen Verbindung Bibliothek.

In diesem Bericht haben wir Highlight Methodik zur automatisierten Abbildung und Analyse von Zebrafisch-Embryonen in Mikrotiterplatten ohne Eingreifen des Benutzers. Wir automatisierte Bildaufnahme auf einem ImageXpress Ultra-Laser-Scanning-konfokale (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), um Bild Tg (dusp6: d2EGFP) ^pt6 Embryonen in 96-Well-Platten und entwickelte eine Bildanalyse-Algorithmus auf Definiens Cognition Network Technology, die quantifiziert GFP basiert Ausdruck in den Köpfen der transgenen Embryos. Die Methode geliefert abgestuften Antworten und quantifiziert die in-vivo-Aktivität eines kleinen Moleküls Aktivator von FGF-Signalisierung. Ähnliche Ergebnisse wurden mit der Epifluoreszenz-basierte ArrayScan II (Cellomics Inc., Pittsburgh PA) erhalten zu dokumentieren, dass es möglich ist, automatisierte Bildaufnahme von Zebrafisch-Embryonen auf eine Vielzahl von kommerziell erhältlichen Platereader ^{2 getroffen haben.} Die Entwicklung von Methoden zur automatischen Analyse vielzelligen Organismus Bildern eliminiert die Notwendigkeit für die visuelle Scoring durch einen menschlichen Beobachter und aktiviert die Generierung und Archivierung von numerischen Daten und Bilder für retrospektive Analysen und Vergleiche mit Zukunft Bildschirme.

Diese Arbeit wird durch die NICHD / NIH (1R01HD053287) zu Hukriede, NCI / NIH (P01 CA78039), um Vogt und NHLBI / NIH (1R01HL088016) zu Tsang finanziert.