במעבדת מורהרדט, אנו משתמשים בדג הזברה כמודל של בעלי חיים כדי לחקור את התפתחות ותפקוד שלפוחית השתן. זיהינו שלפוחית שתן פונקציונלית שמתמלאת ומתרוקנת בדג הזברה. בעוד שדגי הזברה קטנים, ביקשנו לנצל את גודלם כדי לנצל כלכלית טכניקות טרנסקריפטומיות מרחביות והבנתנו את שלפוחית השתן של בעלי החוליות.
טכניקות תעתיק מרחביות עלולות להיות יקרות במהירות אם ריאגנטים וציוד אינם מותאמים. פרוטוקול זה מספק טכניקה מוכחת להשגת מטרה זו באמצעות דג הזברה ומספק את התובנות לגבי התוצאות הצפויות והפחתת הבעיות שעלולות להתעורר כתוצאה מהטכנולוגיה. מלבד הניצול הכלכלי של טכנולוגיות טרנסקריפטומיות מרחביות יקרות, עבודה זו אפשרה לנו לבצע ניתוחים טרנסקריפטומיים מרחביים בקנה מידה גדול של איברים שלמים בעצם על פני מספר עידנים תוך מזעור השפעות אצווה.
כדי להתחיל, יש לקרר את הקריוסטט ל-22 מעלות צלזיוס ולאסוף את כל הפריטים הנדרשים. הכן תבנית פלסטיק חד פעמית ליישור דגימה. הניחו פיסת סרט מעבדה בחלק הפנימי של תבנית הבסיס וציירו קו ישר לרוחבה עם טוש קבוע כנקודת ייחוס.
סמן את החלק הפנימי של תבנית הבסיס כדי להבטיח כיוון דגימה נכון במהלך ההקפאה. לאחר תחול הזרבובית של הבקבוק הבינוני המקפיא, הוציאו את הכמות הדרושה לפינה אחת של תבנית הבסיס. הטה לאט את תבנית הבסיס כדי לפזר את המדיום באופן שווה.
כעת, הניחו את תבנית הבסיס עם מדיום מקפיא באמבט קרח ודגרו אותה למשך 10 דקות לפחות כדי לקרר את המדיום. לאחר מכן, הוסף חלק אחד של 100% אתנול לחלק אחד של קרח יבש בדלי קרח מתחת למכסה האדים. הניחו את צלחת האלומיניום החד פעמית או הסירה באמבט הקרח וכסו את הדלי למשך חמש עד 10 דקות.
אוספים את הדגים המורדמים לאחר הטבילה במים של ארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. בעזרת מלקחיים עדינים יש לאחוז בסנפיר הזנב כדי להסיר את הדג וללחוץ אותו בעדינות על מגבון סופג נטול מוך כדי לייבש אותו. הנח את תבנית הבסיס המוכנה מתחת למיקרוסקופ סטריאו בהגדלה פי 10.
מקם את הדגימה בתבנית לאורך נקודת הייחוס בכיוון הנכון. מכסים בעדינות את הדגימה בשכבה דקה נוספת של מדיום מקפיא. השתמש בנקודת ייחוס אנטומית כדי ליישר את הדג במדויק לקווים המסומנים בתוך תבנית הבסיס ולהתאים את הכיוון באמצעות מלקחיים בעלי קצה עדין, הימנעות מבועות.
מרחו חתיכת קרח יבש על תחתית תבנית הבסיס מתחת לדגימה עד שהיא קפואה מקומית למקומה. שמור על מישור אופקי ישר כדי למנוע חוסר יישור של הדגימה לפני הקפאה מלאה. כעת הניחו את תבנית הבסיס עם הדגימה על סירת האלומיניום או צלחת האלומיניום באמבט הקרח היבש והאתנול.
ודא שהסירה נשארת צפה על פני השטח ותבנית הבסיס נשארת יבשה. מכסים את האמבטיה ומניחים לדגימות להקפיא למשך 10 דקות. לאחר מכן, עטפו את תבנית הבסיס הקפואה בנייר כסף ואחסנו אותה במקפיא בחום של 80 מעלות צלזיוס עד שהיא מוכנה לחיתוך.
הביאו תבנית בסיס קפואה לקריוסטט שהתקרר מראש לצורך הקפאה והניחו אותה בתא הקריוסטט. לאחר הוצאת שקופית ההדמיה המרחבית מהאחסון, הנח אותה במחזיק שקופיות מקורר מראש. אחסן את מחזיק השקופית עם שקופית ההדמיה המרחבית בתא הקריוסטט של 22 מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן לאיסוף חלקים.
כעת, הסר את הדגימה הקפואה מתבנית הבסיס והנח אותה בצ'אק עם מדיום הקפאה טרי, וודא שמשטח החיתוך פונה ללהב המיקרוטום. לאחר מכן הניחו להב מיקרוטום עדין טרי בקריוסטט. לאחר יישור התבנית ללהב, חתוך את אזור העניין בעובי מומלץ של 20 עד 50 מיקרומטר.
ודא שהסימונים בתוך התבנית מועברים לבלוק הקפוא לכיוון נכון של הדגימה. כוונן את התבנית במהלך החיתוך כך שמשטח החיתוך יישאר מקביל לסימוני הייחוס במדיום ההקפאה. פורסים חלקים מהגוש הקפוא ואוספים אותם על שקופית מיקרוסקופ רגילה טעונה חיובית.
בדוק את החלקים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר כדי לוודא שהחיתוך הושלם. לאחר מכן הסר את שקופית ההדמיה המרחבית מתא הקריוסטט והנח אותה באמבט קרח של ארבע מעלות צלזיוס, תוך שמירה על שקופית בתוך מחזיק השקופיות. התחל בהקפאה בעובי מומלץ של 10 עד 14 מיקרומטר.
אסוף קטעים על שקופיות טעונות חיובית עד שתגיע לאזור העניין. כעת אחזר את שקופית ההדמיה המרחבית החד-תאית מאמבט הקרח והסר את השקופית מהמחזיק. אסוף חלקים שורה אחר שורה באמצעות מברשת צבע עדינה כדי למנוע גלגול.
לאחר מכן לחץ פינה של מדיום ההקפאה הריק על שלב הסכין באמצעות הצד האחורי של מברשת. השתמש בחלק העליון של השקופית כנקודת ציר והורד לאט את השקופית על החלק כדי לאפשר לה להיצמד למשך שלוש שניות לפני ההרמה. קו מקטעים טוריים במקביל זה לזה כדי להגדיל את השטח בשקופית.
לאחר איסוף קטעים מאזור העניין, הנח את השקופית בחזרה למחזיק השקופיות. אם אין צורך בדגימות נוספות, אחסן את השקופית ב-80 מעלות צלזיוס עד שבועיים לפני הניתוח. אסוף קטעים לפני ואחרי אזור העניין על שקופית מיקרוסקופ טעונה חיובית סטנדרטית ובצע צביעת המטוקסילין ואאוזין כדי להעריך את יישור הדגימה ואיכות החתך לפני שתמשיך בניתוח.
יישור חלקים מרובים אומת על ידי השוואת מבנים בין קטעים באותו חתך. התאמות לשלבי ההטמעה והאיסוף אפשרו למספר גדול יותר של מקטעים להתאים לאזור ההדמיה של שקופית טרנסקריפטומית מרחבית. איכות האות הטרנסקריפטומי המרחבי הייתה גבוהה באזורי רקמה אך נמוכה יותר באזורי שקופיות ריקים עקב מורכבות אות נמוכה.
