Nel Morhardt Lab, utilizziamo il pesce zebra come modello animale per studiare lo sviluppo e la funzione della vescica. Abbiamo identificato una vescica urinaria funzionale che si riempie e si svuota nel pesce zebra. Sebbene i pesci zebra siano piccoli, abbiamo cercato di sfruttare le sue dimensioni per utilizzare economicamente le tecniche di trascrittomica spaziale e la nostra comprensione della vescica dei vertebrati.
Le tecniche di trascrittomica spaziale possono diventare rapidamente costose se i reagenti e le apparecchiature non vengono ottimizzati. Questo protocollo fornisce una tecnica collaudata per raggiungere questo obiettivo utilizzando zebrafish e fornisce le informazioni sui risultati attesi e sulla mitigazione dei problemi che possono sorgere a seguito della tecnologia. Oltre all'utilizzo economico di costose tecnologie di trascrittomica spaziale, questo lavoro ci ha permesso di eseguire analisi trascrittomiche spaziali su larga scala di organi essenzialmente interi in diverse età, riducendo al minimo gli effetti batch.
Per iniziare, raffredda il criostato a 22 gradi Celsius e raccogli tutti gli elementi necessari. Preparare uno stampo di plastica usa e getta per l'allineamento del campione. Posiziona un pezzo di nastro adesivo da laboratorio all'interno dello stampo di base e disegna una linea retta su di esso con un pennarello indelebile come punto di riferimento.
Contrassegnare l'interno dello stampo di base per garantire il corretto orientamento del campione durante la criosezione. Dopo aver adescato l'ugello della bottiglia del mezzo di congelamento, erogare la quantità necessaria in un angolo dello stampo di base. Inclinare lentamente lo stampo di base per distribuire uniformemente il terreno.
Ora, metti lo stampo di base con il mezzo di congelamento in un bagno di ghiaccio e incubalo per almeno 10 minuti per raffreddare il mezzo. Quindi, aggiungi una parte di etanolo al 100% a una parte di ghiaccio secco in un secchiello per il ghiaccio sotto la cappa aspirante. Metti il piatto di alluminio usa e getta o la barchetta nel bagno di ghiaccio e copri il secchio per cinque-10 minuti.
Raccogli i pesci soppressi dopo averli immersi in acqua a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Usando una pinza a punta fine, afferra la pinna caudale per rimuovere il pesce e premila delicatamente contro un panno assorbente privo di lanugine per asciugarlo. Posizionare lo stampo di base preparato sotto uno stereomicroscopio con ingrandimento 10x.
Posizionare il campione nello stampo lungo il punto di riferimento con l'orientamento corretto. Coprire delicatamente il campione con un altro strato sottile di mezzo di congelamento. Utilizzare un punto di riferimento anatomico per allineare il pesce con precisione alle linee segnate all'interno dello stampo di base e regolare l'orientamento utilizzando una pinza a punta fine, evitando bolle.
Applicare un pezzo di ghiaccio secco sul fondo dello stampo di base sotto il campione fino a quando non viene congelato localmente in posizione. Mantenere un piano orizzontale livellato per evitare il disallineamento del campione prima di congelarlo completamente. Ora posiziona lo stampo di base con il campione sulla barca di alluminio o sul piatto nel bagno di ghiaccio secco ed etanolo.
Assicurarsi che la barca rimanga galleggiante in superficie e che lo stampo di base rimanga asciutto. Coprire il bagno e lasciare congelare i campioni per 10 minuti. Quindi, avvolgere lo stampo di base congelato in un foglio e conservarlo in congelatore a 80 gradi Celsius fino al momento del sezionamento.
Portare lo stampo di base congelato al criostato pre-raffreddato per la criosezione e posizionarlo nella camera del criostato. Dopo aver rimosso il vetrino per immagini spaziali dal deposito, riporlo in un supporto per vetrini pre-raffreddato. Conservare il supporto del vetrino con il vetrino per immagini spaziali nella camera del criostato a 22 gradi Celsius fino al momento della raccolta della sezione.
Ora, rimuovi il campione congelato dallo stampo di base e mettilo in un mandrino con mezzo di congelamento fresco, assicurandoti che la superficie di taglio sia rivolta verso la lama del microtomo. Quindi posizionare una lama di microtomo fine fresca nel criostato. Dopo aver allineato lo stampo alla lama, rifilare la regione di interesse con uno spessore consigliato da 20 a 50 micrometri.
Assicurarsi che i segni all'interno dello stampo vengano trasferiti al blocco congelato per un corretto orientamento del campione. Regolare lo stampo durante la rifilatura in modo che la superficie di taglio rimanga parallela ai segni di riferimento nel mezzo di congelamento. Tagliare le sezioni dal blocco congelato e raccoglierle su un vetrino da microscopio standard caricato positivamente.
Controllare le sezioni al microscopio a campo chiaro per verificare che il taglio sia completo. Quindi rimuovere il vetrino per immagini spaziali dalla camera del criostato e posizionarlo in un bagno di ghiaccio a quattro gradi Celsius, mantenendolo all'interno del supporto del vetrino. Iniziare la criosezione a uno spessore consigliato da 10 a 14 micrometri.
Raccogli le sezioni su scivoli caricati positivamente fino a raggiungere la regione di interesse. A questo punto, recuperare il vetrino per l'imaging spaziale a cellula singola dal bagno di ghiaccio e rimuoverlo dal supporto. Raccogli le sezioni riga per fila usando un pennello a punta fine per evitare che rotoli.
Quindi premere un angolo del mezzo di congelamento vuoto sul tavolino del coltello utilizzando il retro di un pennello. Utilizzare la parte superiore del vetrino come punto di rotazione e abbassare lentamente il vetrino sulla sezione per lasciarlo aderire per tre secondi prima di sollevarlo. Allineare le sezioni seriali parallele tra loro per massimizzare lo spazio sulla guida.
Dopo aver raccolto le sezioni dalla regione di interesse, riposizionare la diapositiva nel supporto della diapositiva. Se non sono necessari altri campioni, conservare il vetrino a 80 gradi Celsius per un massimo di due settimane prima dell'analisi. Raccogliere le sezioni prima e dopo la regione di interesse su un vetrino da microscopio standard caricato positivamente ed eseguire la colorazione con ematossilina ed eosina per valutare l'allineamento del campione e la qualità della sezione prima di procedere con l'analisi.
L'allineamento di più sezioni è stato verificato confrontando le strutture tra le sezioni nello stesso taglio. Le regolazioni delle fasi di inclusione e raccolta hanno consentito di inserire un numero maggiore di sezioni nell'area di imaging di un vetrino trascrittomico spaziale. La qualità del segnale trascrittomico spaziale era elevata all'interno delle regioni tissutali, ma inferiore nelle aree vuote del vetrino a causa della bassa complessità del segnale.
