עבודה זו נתמכה על ידי מענק OD R24 של NIH OD031956 ומענק NICHD R01 HD073104. אנו מודים לדארסי קלי על דיונים מועילים וקלט ראשוני על פרוטוקול זה. ברצוננו גם להודות לסמנתה ג'לברט, ג'יל רלסטון וויל רצן על עזרתם ותמיכתם, כמו גם לשלושת הסוקרים העמיתים האנונימיים שלנו על המשוב שלהם.

כל הניסויים בוצעו בהתאם לכללים ולתקנות של בית הספר לרפואה של הרווארד IACUC (הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים) (IS 00001365_3).
הערה: למרות שהשיטה העיקרית של המתת חסד המתוארת נחשבת לטכניקה מקובלת להמתת חסד על ידי האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית12, היא לא נמצאה כמובילה להפסקת פעימות לב13. גם השיטה המשנית הנפוצה של פיטום כפול אינה מונעת זאת, וגם לא הוצאת הלב מהחיה. גירוש בעלי חיים מורדמים נחשב לשיטה הומנית ויעילה להמתת חסד מוצלחת12. מכיוון ששמירה על רקמות טריות באמצעות המתת חסד היא המטרה של פרוטוקול זה, מועיל שהלב ימשיך לפעום באמצעות המתת חסד ראשונית עם MS-222, וכי זילוח הוא עצמו שיטת המתת חסד משנית באמצעות המתת חסד.
1. הכנה
<ol><li>ודא שמוסד המחקר אישר את טכניקת המתת החסד והזילוח המתוארת בפרוטוקול זה.</li>
	<li>הכינו תמיסה של 5 גרם/ליטר MS-222 (טריקאין מתאן-סולפונט) ו-5 גרם/ליטר נתרן ביקרבונט. הנפח צריך להיות גדול יותר מהנפח הדרוש כדי לכסות לחלוטין את בעלי החיים המורדמים. בדוק את ה- pH כדי לוודא שהוא ≥7.</li>
	<li>הכינו 500 μL של 180 U/mL הפרין במי מלח חוצצי פוספט (PBS) לכל X. laevis, או 200 μL לכל X. tropicalis.</li>
	<li>לבצע המתת חסד ראשונית על ידי הצבת Xenopus בתמיסה זו (משלב 1.2); החיה תישאר שקועה במשך שעה אחת בסך הכל.</li>
	<li>אשר כי Xenopus איבד את תגובת הכאב שלו על ידי צביטת כף הרגל 15 דקות לתוך המתת חסד. אם בעל החיים מגיב, להחזיר אותו לפתרון המתת חסד עד תגובה זו אובדת.</li>
	<li>לשקול את Xenopus ולקחת את כל המדידות הנוספות הנדרשות לפני הדגימה.</li>
	<li>באמצעות מחט 31 G, להזריק X. laevis עם 250 μL ו X. tropicalis עם 100 μL של 180 U/mL הפרין ב PBS (משלב 1.3) לתוך השרירים של כל גפה קדמית.</li>
	<li>הכינו תמיסה של 1 מ"ל/גרם ממשקל בעלי החיים של 54 U/mL הפרין ב-PBS perfusate. אנשים מנוסים יותר עם פרוטוקול זה עשויים לגלות כי פחות מדיה נדרשת כדי להשלים זילוח.</li>
	<li>השתמש במחט היפודרמית 22 G כדי לחורר X. laevis, ומחט היפודרמית 25 G עבור X. tropicali s. הקהו את מחט הזילוח על-ידי חיתוך הקצה באמצעות חותכי חוטים (איור 1)14. הערה: פעולה זו מפחיתה את הסבירות שהמחט תנקב דרך החדר אם היא מוזזת. בנוסף לקהות, המחט עשויה להיות טחונה מעט עם אבן השחזה או קובץ, אך עדיין להישאר חדה מספיק כדי לחדור את החדר.</li>
	<li>הכינו את המשאבה על ידי חיבור המחט החתוכה ומחזור 54 U/mL פרפוזט PBS (משלב 1.8). הקפד לנקות את כל בועות האוויר מהצינור כדי למנוע את האפשרות של תסחיף אוויר, המוביל לירידה ביעילות הזילוח או לכשל (ראה טבלה 1). שמור את אמצעי הזלוף על קרח למשך ההליך.</li>
	<li>אם המשאבה אינה ניתנת לתכנות, כאשר המחט במקומה, מדוד את נפח המדיה השאובה תחת ההגדרות השונות כדי לקבוע אילו הגדרות קרובות ביותר ל- 5 מ"ל לדקה ול- 10 מ"ל לדקה. קצבי זרימה אלה ישמשו ללא קשר למין. אם משאבת הזילוח ניתנת לתכנות, כייל אותה עם המחט במקומה, בהתאם להוראות היצרן.</li>
	<li>הניחו את משטח הדיסקציה (מגש או יריעת קצף) בשיפוע בתוך מיכל משני, או סדרו אותו כדי להקל על ניקוז הדם.</li>
	<li>לאחר שהצפרדע הייתה בתמיסה במשך שעה אחת, המתת חסד ראשונית הושלמה. הסר את הצפרדע ובדוק מחדש את תגובת אובדן הכאב על ידי ביצוע צביטה ברגל.</li>
	<li>הניחו את הצפרדע על גבה ונעצו כל איבר (איור 2). אם נדרש שימור רקמת הגפיים, ניתן להניח סיכות דקות דרך הספרות או סיכות בצורת U סביב הגפיים.</li>
	<li>בעזרת מספריים דיסקציה, לחתוך דרך העור, במעלה קו האמצע, ולאחר מכן לרוחב, עושה שני דשים. (איור 2)</li>
	<li>השתמשו במלקחיים כדי לתפוס את הלינאה אלבה ולמשוך אותה הרחק מהחלל הקואלומי (איור 3). בזהירות להשתמש מספריים לחתוך דרך השרירים. עשו שני דשים מקיר החלל וחתכו או נעצו את כל הדשים מהדרך.</li>
	<li>השתמשו במספריים לדיסקציה כדי לחתוך דרך עצמות הקוראקואיד ולחתוך רקמה עודפת כדי לקבל גישה טובה יותר ללב (איור 3).</li>
	<li>הלב עדיין צריך לפעום. אם הלב הפסיק לפעום לפני הזילוח, שימו לב שטריות הדגימה נפגעה.</li>
</ol>2. זילוח
<ol><li>זהה את הבטן והזז אותה בעדינות כך שהיא נמצאת על גבי האונה השמאלית של הכבד (מימין לצופה), כאשר כלי הדם שלה גלויים למשך ההליך. זהה ריאה ואחז אותה בקצה שלה באמצעות מלקחיים רקמות. משכו את הריאה אל מחוץ לחלל הקואלומי ונעצו אותה דרך הקצה (איור 4). עשו זאת בעדינות, שכן כלי דם שבורים אינם מחוררים היטב. שים לב אם הדם גלוי בתוך האונה, שכן זה ישפיע על היכולת לקבוע את השלמת ההליך.</li>
	<li>צלם תמונה של החלל הקואלומי כדי להעריך טוב יותר את יעילות הזילוח ואולי לזהות רקמות חריגות במועד מאוחר יותר.</li>
	<li>זהו את קרום הלב הדק ומשכו אותו בעזרת מלקחיים רקמתיים (איור 5). בעדינות לנקב את קרום הלב באמצעות קצה מספריים iridectomy, נזהר לא לחתוך את הרקמות הבסיסיות. מקלפים את קרום הלב הרחק משלושת חדרי הלב.</li>
	<li>השתמש במלקחיים כדי לתפוס בעדינות את החדר על ידי קודקודו. הפעילו לחץ מוגבל כך שיהיה מספיק מקום בין משטחי המתיחה של המלקחיים כדי שמחט הזילוח תעבור (איור 6).</li>
	<li>הכניסו את המחט דרך סגירת המלקחיים לחדר החדר, תוך זהירות שלא לנקב דרך החדר (איור 7). מהדקים את מלקחיים הרקמה למקומם באמצעות מחזיק מחט באמצעות המוסטט. הערה: טכניקה זו מייצבת את מיקום המחט, שהוא עדיין חד. הצמדת המחט ישירות לחדר תגרום גם היא לנזק מיותר, מה שיקשה על הידוק במקרה הצורך (ראה טבלה 1).</li>
	<li>התחל את זרימת המשאבה במהירות של כ- 5 מ"ל/דקה. שלושת חדרי הלב ותא המטען העורקי יתחרתו (איור 8; ראו טבלה 1).</li>
	<li>עם מספריים, בזהירות lance את auricle ימין (בצד שמאל של הצופה); דם יישפך החוצה. הגדר את קצב הזרימה ל- 5 מ"ל לדקה או הגדל אותו ל- 10 מ"ל לדקה.</li>
	<li>המשיכו עד שכלי הדם של הקיבה מתכווצים (ראו טבלה 1), ואז השוו את הפיתול השמאלי של הלב (מימין לצופה). אם קצב הזרימה הוא עדיין 5 מ"ל/דקה, הגדל אותו לכ-10 מ"ל/דקה.</li>
	<li>השתמש פיפטה העברה כדי לשטוף את החלל coelomic במדיה זילוח, כדי לעזור לשמור על הראות כדי להעריך טוב יותר את הצבע של perfusate זורם מן auricles.</li>
	<li>שמור את המחט במקומה עד שהשקע הזורם מהאוריקלס ברור (ראה טבלה 1) והריאה איבדה את גוונה האדום (ראה טבלה 1; איור 9).</li>
</ol>

זילוח דם בצפרדעים אפריקאיות בעלות טפרים לתמלול ופרוטאומיקה

<ol>
	<li>Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiI+perfusion+as+a+method+for+vascular+visualization+in+Ambystoma+mexicanum.">DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55740 (2017).</li><li>Lametschwandtner, A., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+anatomy+of+the+brain+of+the+adult+pipid+frog,+Xenopus+laevis+(Daudin):+A+scanning+electron+microscopic+study+of+vascular+corrosion+casts.">Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts.</a> Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).</li><li>Lametschwandtner, A., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+anatomy+of+the+urinary+bladder+in+the+adult+African+clawed+toad,+Xenopus+laevis:+A+scanning+electron+microscope+study+of+vascular+casts.">Microvascular anatomy of the urinary bladder in the adult African clawed toad, Xenopus laevis: A scanning electron microscope study of vascular casts.</a> Journal of Morphology. 282 (3), 368-377 (2021).</li><li>Lametschwandtner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+anatomy+of+the+gallbladder+of+the+adult+South+African+clawed+toad,+Xenopus+laevis+Daudin:+A+scanning+electron+microscope+study+of+vascular+corrosion+casts.">Microvascular anatomy of the gallbladder of the adult South African clawed toad, Xenopus laevis Daudin: A scanning electron microscope study of vascular corrosion casts.</a> Microscopy and Microanalysis. 13, 492-493 (2007).</li><li>Lametschwandtner, A., Spornitz, U., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+anatomy+of+the+non-lobulated+liver+of+adult+Xenopus+laevis:+A+scanning+electron+microscopic+study+of+vascular+casts.">Microvascular anatomy of the non-lobulated liver of adult Xenopus laevis: A scanning electron microscopic study of vascular casts.</a> Anatomical Record. 305 (2), 243-253 (2022).</li><li>Miodo&#324;ski, A. J., B&#228;r, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+supply+of+the+choriocapillaris+of+anuran+amphibians+(Rana+temporaria,+Rana+esculenta).+Scanning+electron-microscopic+(SEM)+study+of+microcorrosion+casts.">Arterial supply of the choriocapillaris of anuran amphibians (Rana temporaria, Rana esculenta). Scanning electron-microscopic (SEM) study of microcorrosion casts.</a> Cell and Tissue Research. 249 (1), 101-109 (1987).</li><li>Nenni, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenbase:+Facilitating+the+use+of+Xenopus+to+model+human+disease.">Xenbase: Facilitating the use of Xenopus to model human disease.</a> Frontiers in Physiology. 10, 154 (2019).</li><li>Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+genetic+toolkit+in+Xenopus:+Approaches+and+opportunities+for+human+disease+modeling.">Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling.</a> Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).</li><li>Peshkin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+repertoire+in+early+vertebrate+embryogenesis.">The protein repertoire in early vertebrate embryogenesis.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Briggs, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+gene+expression+in+vertebrate+embryogenesis+at+single-cell+resolution.">The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution.</a> Science. 360 (6392), (2018).</li><li>Liao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+landscape+of+larval+and+adult+Xenopus+laevis+at+single-cell+resolution.">Cell landscape of larval and adult Xenopus laevis at single-cell resolution.</a> Nature Communications. 13 (1), 4306 (2022).</li><li>AVMA (American Veterinary Medical Association). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AVMA+guidelines+for+the+euthanasia+of+animals,+2020+edition.">AVMA guidelines for the euthanasia of animals, 2020 edition.</a> AVMA. , 37 (2020).</li><li>Navarro, K., Jampachaisri, K., Chu, D., Pacharinsak, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bupivacaine+as+a+euthanasia+agent+for+African+Clawed+Frogs+(Xenopus+laevis).">Bupivacaine as a euthanasia agent for African Clawed Frogs (Xenopus laevis).</a> PLoS One. 17 (12), e0279331 (2022).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation.">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).</li><li>Heinz-Taheny, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+physiology+and+diseases+of+amphibians.+Veterinary+clinics+of+North+America.">Cardiovascular physiology and diseases of amphibians. Veterinary clinics of North America.</a> The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 12 (1), 39-50 (2009).</li><li>Stephenson, A., Adams, J. W., Vaccarezza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vertebrate+heart:+an+evolutionary+perspective.">The vertebrate heart: an evolutionary perspective.</a> Journal of Anatomy. 231 (6), 787-797 (2017).</li><li>Hoops, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perfusion+protocol+for+lizards,+including+a+method+for+brain+removal.">A perfusion protocol for lizards, including a method for brain removal.</a> MethodsX. 2, 165-173 (2015).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

פרוטוקול זה מתאר טכניקות דיסקציה מסורתיות לגישה לחלל הקואלומי. טכניקות אחרות מקובלות גם כן, בתנאי שהן גורמות נזק מינימלי לרקמות, הלב נגיש, והריאה והקיבה גלויים. באופן דומה, ניתן להחליף בקלות את רוב כלי הדיסקציה המפורטים בפריטים דומים.
בעוד שנעשו ניסיונות לייעל את היעילות של...

זילוח הגוף כולו של דו-חיים מתבצע באופן שגרתי לצורך שימור וקיבוע 1,2,3,4,5,6. עם זאת, הליכים אלה מתרחשים בקצב המגביל את מספר הדגימות הטריות שניתן לקחת לכל חיה. מטרת עבודה זו היא לפתח פרוטוקול זילוח דם יעיל בקסנופוס, תוך מתן עדיפות למהירות הטכניקה. הפרוטוקול לוקח פחות מ-10 דקות לכל חיה עבור X. tropicalis ופחות מ-15 דקות לכל X. laevis חיה. סדרי העדיפויות המשניים הם קלות השכפול והשימוש בציוד שנרכש בקלות, כך שניתן יהיה לשתף דגימות באיכות גבוהה באופן נרחב בין מעבדות Xenopus.
צפרדעי קסנופוס נמצאות בשימוש נרחב במחקר ביו-רפואי כדי לחקור תהליכים ביולוגיים ופתולוגיים בסיסיים שנשמרו בין מינים. לטטרפוד זה יש קשר אבולוציוני קרוב יותר עם יונקים מאשר מודלים ימיים אחרים, ויש לו ריאות, לב בעל שלושה חדרים וגפיים עם ספרות. הקהילה הבינלאומית משתמשת ביעילות ב- Xenopus כדי להשיג הבנה עמוקה יותר של מחלות אנושיות באמצעות מודלים מעמיקים של מחלות וניתוח מולקולרי של תפקוד גנים הקשורים למחלות. היתרונות הרבים של קסנופוס כמודל של בעלי חיים הופכים אותם לכלים יקרי ערך לחקר הבסיס המולקולרי של התפתחות אנושית ומחלות; יתרונות אלה כוללים: גודל ביציות ועובר גדול, פריון גבוה, קלות דיור, התפתחות חיצונית מהירה וקלות מניפולציה גנומית. ההערכה היא כי Xenopus חולקים ~80% מהגנים המזוהים של המחלה האנושית7.
בהשוואה למודלים פופולריים של יונקים, Xenopus הוא מודל מהיר וחסכוני, עם קלות של הפלת מורפולינו וזמינות של טרנסגניות יעילות ומוטציות גנטיות ממוקדות באמצעות CRISPR8. ספקטרומטריית מסה כמותית ושעתוק חד-תאי יושמו בהצלחה על עוברי Xenopus9,10, אך אטלס תאים עדכני של Xenopus laevis מראה כי הרכב רוב הרקמות נשלט על ידי סוגי תאי דם 11. על ידי פיתוח טכניקה המשחררת רקמות בקצב מהיר ושימוש במדיה צוננת, טריות הדגימה מושפעת באופן מינימלי מזילוח. זה חשוב במיוחד עבור יישומים שבהם המטרה היא פרופיל mRNA או ביטוי חלבון שאינם מוטרדים פיזיולוגית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5x Magnifying glass with LED light and stand</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>B08QJ6J8P1</td>
			<td>light must not produce heat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting fine-pointed forceps</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>08-875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76457-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tray</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>14-370-284</td>
			<td>styrofoam sheets are an acceptable alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia container</td>
			<td>US Plastic</td>
			<td>Item&#160;2860</td>
			<td>alternative opaque containers acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia container lid</td>
			<td>US Plastic</td>
			<td>Item&#160;3047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissection pins</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>PIN-#3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General use hypodermic needles, 22 G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-5A</td>
			<td>for X. laevis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General use hypodermic needles, 25 G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826AA</td>
			<td>for X. tropicalis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin, porcine intestinal mucosa</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>37-505-410MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iridectomy scissors 6&#34;</td>
			<td>vwr</td>
			<td>470018-938</td>
			<td>iris scissors are an acceptable alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>B09PTX6M2Z</td>
			<td>size will be dependant on the hosing of the pump used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo-Hegar needle holder</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>08-966</td>
			<td>mosquito forceps are an acceptable alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222: Syncaine (formerly tricaine)</td>
			<td>Pentair AES</td>
			<td>TRS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic liquid pump dosing pump 5&#8211;100 mL/min</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>B07PWY4SM6</td>
			<td>any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharpening stone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470150-112</td>
			<td>optional; for dulling needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate, powder, USP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-606-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen forceps, serrated</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Pins for dissecting</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>S99385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-fine short insulin syringes, 31 G</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD328438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp &#38; powerful side cutter clippers</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>B087P191LP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effective rapid blood perfusion in xenopus

קסנופוס הם יצורי מודל רבי עוצמה להבנת התפתחות ומחלות של בעלי חוליות כבר למעלה מ-100 שנה. כאן מוגדר פרוטוקול זילוח דם מהיר בקסנופוס, שמטרתו הפחתה עקבית ודרסטית של הדם בכל הרקמות. הזלוף מתבצע על ידי החדרת מחט ישירות לחדר הלב ושאיבת מלח חוצץ פוספט (PBS) דרך מערכת כלי הדם. ניתן להשלים את ההליך תוך כ -10 דקות לכל חיה. הדם נשלט על ידי כמה חלבונים וסוגי תאים נפוצים מאוד, מה שיוצר בעיות רבות מכיוון שחלבונים אלה מסווים את רוב המולקולות וסוגי התאים האחרים המעניינים. האפיון הניתן לשחזור של רקמות קסנופוס בוגרות עם פרוטאומיקה כמותית ושעתוק חד-תאי יפיק תועלת מיישום פרוטוקול זה לפני דגימת האיברים. הפרוטוקולים לדגימת רקמות מוגדרים בניירות נלווים. נהלים אלה מכוונים לסטנדרטיזציה של פרקטיקות ברחבי Xenopus של מין, גיל ומצב בריאותי שונים, במיוחד X. laevis ו- X. tropicalis.

לאחר זילוח מוצלח, כל הרקמות (למעט הכבד בקסנופוס פיגמנטי) יהיו קלות יותר באופן מובהק ורוויות פחות בדם. כלי דם עיקריים יהיו פחות בולטים (איור 10), ורקמות (למעט הכבד) יישטפו בצורה נקייה במאגר לאחר הדגימה. בעוד שביצוע מוצלח של הפרוטוקול יכול בסופו של דבר להיות מאושר רק על ידי ?...

Watch this Scientific Journal Video about Effective Rapid Blood Perfusion in Xenopus at JoVE.com

מחבר זרקור: זילוח דם מהיר יעיל ב Xenopus  

מוצג כאן פרוטוקול יעיל של זילוח דם מהיר להכנת דגימות רקמה מצפרדעים אפריקאיות בעלות טפרים למחקרי שעתוק ופרוטאומיקה.

זילוח דם מהיר יעיל בקסנופוס

Xenopus have been powerful model organisms for understanding vertebrate development and disease for over 100 years. Here, a rapid blood perfusion protocol ...

הליך זה מתמקד בניצול הומני של מודלים של דו-חיים באופן שממקסם את היעילות. ניתן ליישם נוהלי תקינה על דגימות שנלקחו ונשמרו במושבה המקורית, ובכך להפחית את סיכוני האבטחה הביולוגית ולבטל את הלחץ על הובלת בעלי חיים. ניתן להשלים את השפע במהירות, ולמקסם את הזמן הזמין לדגום רקמות בעודן טריות.רעננות זו חשובה במיוחד לפרופיל פרוטאומי ושעתוק (proteomic and transcriptomic profiling). פרוטוקול זה מפורט ומפורש, מה שהופך אותו שמיש עבור אנשים עם מגוון רחב של רקעים. זה מאפשר שיתוף של דגימות באיכות גבוהה בין מעבדות Xenopus.יחד עם טכניקת שפע זו, פרוטוקול מקיף דומה עובד על דגימה סטנדרטית של כל האיברים העיקריים.

effective-rapid-blood-perfusion-in-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Effective Rapid Blood Perfusion in Xenopus

4.3K Views.  Harvard Medical School. הליך זה מתמקד בניצול הומני של מודלים של דו-חיים באופן שממקסם את היעילות. ניתן ליישם נוהלי תקינה על דגימות שנלקחו ונשמרו במושבה המקורית, ובכך להפחית את סיכוני האבטחה הביולוגית ולבטל את הלחץ על הובלת בעלי חיים. ניתן להשלים את השפע במהירות, ולמקסם את הזמן הזמין לדגום רקמות בעו?...

Video: מחבר זרקור: זילוח דם מהיר יעיל ב Xenopus  

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

בשנת העצרת חוץ גופית גרעיני מופרדים באמצעות תמציות Xenopus ביצה

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

הדמיה ב-RNA לוקליזציה Xenopus ביציות

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

איתור מהיר של מבחני אחידים ביולוגית באמצעות מערכת מגנטית biosensing אפנון

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

השתלת פנים ב<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; עוברים

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

<em&gt; Xenopus</em&gt; טכניקת ביצית Cut-פתוח וזלין גאפ מתח מהדק עם Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

הכינון מחדש של השפלה β-catenin ב<em&gt; Xenopus</em&gt; חלץ ביצה

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

זילוח דם מהיר יעיל בקסנופוס

Transcript

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video