תרכובות פוטו-מבוקרות, פעילות ביולוגית, מכילות מקטעים פוטואיזומריזיים הפיכים, פוטו-מתגים במולקולות שלהם. תרכובות הן פפטידים מחזוריים שהשתנו על ידי מקטע דיארילתן שעובר טרנספורמציות אלקטרוציקליות הפיכות המושרות על ידי אור. הם יכולים לבצע פוטו-סוויץ', כלומר, לעבור בין צורה הנוצרת על-ידי קרינת על-סגול, שאינה פעילה ביולוגית, לבין צורה פעילה ביולוגית הנוצרת על-ידי אור אדום.
הוא האמין כי תרופות photoswitchable בטוחים יותר מאשר תרופות non-photoswitchable. הסיבה לכך היא שאתה יכול לתת צורה לא רעילה, מנוטרלת לגוף האדם ולהפעיל אותו באופן מקומי עם אור רק היכן שאתה צריך את זה, שהוא, למשל, גידולים, augers, או פצעים. אין שיטות סטנדרטיות או פרוטוקולים לפיתוח פרה-קליני או קליני של תרופות פוטופרמקולוגיות כאלה, אז כאן, אנו רוצים להראות לכם ניסויים אשר יכולים לשמש למחקר פרה-קליני מוקדם זה.
קטרינה הורבאטוק וטטיאנה מח'ני ידגימו את הנהלים. הליכי הטיפול והניסוי בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לביואתיקה של חברת ביאנטה. התחל בהכנת המאגרים באמצעות הליכים סטנדרטיים.
לחלופין, השתמש בפתרונות זמינים מסחרית. הכינו פתרונות מלאי של תרכובות. עבור כל תרכובת, שקלו שתי קבוצות של 5.12 מיליגרם של התרכובת בפוטופורם סגור טבעת לשני צינורות אפנדורף 1.5 מיליליטר, אחד עם שקוף ואחד עם קירות שחורים ולא שקופים.
כבקרה חיובית, לשקול 2.28 מיליגרם של ההורה, לא photocontroled, פפטיד בצינור נוסף. הוסף 100 מיקרוליטר של DMSO טהור לכל דגימה, ומערבל במשך 30 שניות. פוטואיזומריזציה של תמיסת הסטוק בצינור השקוף על ידי הקרנת התמיסה בלייזר 650 ננומטר, צפיפות הספק אור 6 וואט לסנטימטר מרובע, עם מערבולות כדי להבטיח ערבוב.
ממשיכים עד שהצבע משתנה מסגול כהה לחום בהיר. יש להגן מפני אור עם רדיד אלומיניום. זרע 5, 000 עד 10, 000 תאים לכל באר.
השתמשנו בסביבות 8, 000 תאי קרצינומה ריאות לואיס ב 200 מיקרוליטר של DMEM במרכז 60 בארות של צלחת סטרילית 96 בארות עם תחתית שקופה וקירות שחורים ולא שקופים. מלא את 36 הבארות הנותרות עם DMEM טהור. לדגור על הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% CO2 למשך הלילה.
למחרת, להכין דילולים סדרתיים של תרכובות ואת הבקרה החיובית פוליפרופילן autoclaved צלחות ברורות. התחל עם המניות ב- DMSO, ודלל עם DMEM, אך אל תעלה על 1% נפח DMSO בריכוז הגבוה ביותר. כדי למנוע פוטואיזומריזציה בלתי מבוקרת של התרכובות הנחקרות, כבו את האורות בארון הסטרילי.
העבירו 100 מיקרוליטר מהדילולים ל-56 בארות עם 100 מיקרוליטר של DMEM שנוסף קודם לכן כדי להגיע לריכוז הסופי הנדרש של התרכובות בבארות, בדרך כלל בטווח של חמישה עד 150 מיקרומולרים. לאחר מכן, להוסיף 100 מיקרוליטר של DMEM לארבע בארות, אשר משמשים שליטה שלילית. כסו את הלוחות ברדיד אלומיניום או בכיסוי פלסטיק לא שקוף כדי למנוע פוטו-מיתוג בלתי מבוקר.
מניחים את הצלחות באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך זמן הדגירה שנבחר. לאחר הדגירה, מוסיפים 50 מיקרוליטר של תמיסת צביעה לכל באר לצלחות. השתמש ב- Hoechst 33342 בעל חמישה מיקרומולרים וביודיד פרופידיום מיקרומולרי אחד כפתרונות הצביעה הסופיים לניסוי זה.
דוגרים שוב בטמפרטורה של 37 מעלות למשך 20 דקות. בצע הדמיה פלואורסצנטית אוטומטית באמצעות עדשה אובייקטיבית בהגדלה של פי 20. פעולות המעבדה בחלק זה של השיטה זהות לאלה המתוארות בניסוי הדו-ממדי: הכנת תרבית התא, דגירה עם התרכובות הנבדקות והדמיה.
עם זאת, במקרה זה, התאים מוכנים כספרואידים קומפקטיים ובוגרים בלוח U-תחתון 384 בארות, הידבקות נמוכה במיוחד, עם קירות שחורים ולא שקופים. שימוש בצלחת בגודל כזה מאפשר להשוות בין שתי תרכובות בניסוי אחד. בניסוי זה השתמשנו בנוסף בקלצין AM כמרכיב שלישי בתמיסת הצביעה הרב-גונית.
תמונות המתקבלות הן מהניסויים הדו-ממדיים והן מהניסויים התלת-ממדיים מנותחות באמצעות תוכנת ניתוח התמונה האוטומטית של המכשירים. תאים עם צבעי Hoechst ו- propidium iodide נחשבים למתים נמקיים, והשבר שלהם כפונקציה של הריכוז משמש לחישוב ערך IC50. הרכיבו את הרכבת האופטית להקרנת הדגימה.
הוא מורכב מכבל אופטי ממקור אור הלייזר, עדשה עם אורך מוקד משתנה, מזרק עם כיסוי לא שקוף וקצה חיתוך שטוח. כל הפעולות הבאות חייבות להתבצע בחדר חשוך עם תאורה מינימלית במקום העבודה. הכינו דגימת רקמת מודל עמוסה בתרכובות פוטופורמיות לא פעילות.
בריצה טיפוסית, חמישה גרם של בשר חזיר טחון טרי מעורבב מכנית עם תמיסת PBS של התרכובת כדי להגיע לריכוז הסופי של 50 מיליגרם לקילוגרם. ממלאים את המזרק בדגימה הטעונה. להקרין את הדגימה ברכבת האופטית לחשיפה הנדרשת ולזמן מינון האור.
לאחר החשיפה, לעשות ארבע פרוסות בעובי מילימטר של הדגימה על ידי דחיפת המסה מן המזרק עם הבוכנה לחתוך אותו עם אזמל. שוקלים וממצים את התרכובת עם אצטוניטריל, מים, תערובת TFA, 70% אצטוניטריל וחומצה טריפלואורואצטית 01% בצינור אפנדורף של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה ב-20XG למשך 30 דקות פעמיים כדי להסיר את החומר הבלתי מסיס ולאסוף את הסופרנטנט.
הקלט כרומטוגרמות שזוהו על-ידי UV בזיהוי של 570 ננומטר של צורתן המצורפת וזיהוי של 270 ננומטר של הצורה הפתוחה הטבעתית. השתמש בדגימות הבקרה הלא מוקרנות והמוקרנות שהוכנו בדומה לתמיסות המלאי בניסויי התא כדי לקבוע את זמני השמירה הספציפיים ולכייל את השיטה. חזרו על הניסוי שלוש פעמים, ושרטטו את האחוז המנורמל של כל צורת צילום על המגרש, אחוז לעומת מרחק משטח הרקמה המוקרנת.
ביום האפס, יש לחסן את הנקבות הבוגרות של 6 עכברים שחורים C57 במשקל של כ-20 גרם כל אחת באופן תת-עורי עם תרחיף של כחצי מיליון תאי קרצינומה של ריאות לואיס בכ-100 מיקרוליטר של תערובת DMEM ומטריג'ל ברגל ימין האחורית. הליך זה נעשה תחת הרגעה 5% isoflurane. בעלי החיים מוכנים לטיפול בימים חמש עד שמונה, כאשר הגידולים מוחשיים.
כל הפעולות הכרוכות בבדיקה צריכות להתבצע בתנאים חשוכים למחצה. מצב זה תקף גם בעת טיפול בבעלי החיים לאחר קבלת מנת התרכובת לתקופה של יומיים. הרכיבו באופן אקראי ארבע קבוצות של שמונה בעלי חיים, והסירו את הפרווה מאזור הגידול.
שתי קבוצות הביקורת מקבלות הזרקה תוך ורידית של הרכב. 100 מיקרוליטר מלוחים לכל חיה במשקל 20 גרם, ובעלי החיים בשתי קבוצות הניסוי קיבלו את התרכובת הנבדקת בפוטופורם הלא פעיל בתמיסה של מיליגרם אחד למיליליטר מלוחים. לנהל את בולוס התרכובת לתוך וריד הזנב ב חמישה מיליליטר לקילו.
שעתיים, 45 דקות לאחר הזרקת התרכובת, מקרינים את אזור הגידול למשך 20 דקות תחת הרדמה איזופלורנית בלייזר 650 ננומטר, באמצעות צפיפות הספק אור של 100 מילי וואט לסמ"ר. שימו לב היטב לתנאי בעלי החיים במהלך 30 הדקות הבאות. התבוננו בבעלי החיים מדי יום, ומדדו את משקלם ואת ממדי הגידולים שלהם.
למדוד את נפחי הגידול, ולציין את התקדמות הנמק. קבע את שיעור ההישרדות באמצעות ההליך הסטנדרטי. את תוצאות הפרוטוקול שלנו לשלב הראשון במקרה של ניסויי תרבית תאים דו-ממדיים ניתן להציג כתמונות, כפי שמודגם כאן בתמונה מייצגת של תאי קרצינומה ריאתיים של לואיס המודגרים עם LMB002 בריכוזים שונים ולתקופות שונות של הדגירה.
קישוט עם Hoechst ו-propidium iodide מאפשר הדמיה של גרעיני התא בתעלה הכחולה, ובכך נותן ספירת תאים כוללת. תאים עם שלמות נפגעת של קרום הפלזמה נצפו בתעלה האדומה. בהנחה שהאחרון מת באופן נמק, ניתן לכמת את ציטוטוקסיות לכאורה של תרכובת הנחקרת כאחוז מהתאים החיוביים ליודיד פרופידיום.
תוצאות כימות הנתונים המתקבלות באמצעות ניתוח תמונה אוטומטי מוצגות כאן. עבור LMB002, תלות סיגמואידית של אחוז התאים החיוביים יודיד פרופידיום בריכוז התרכובת ניתן לראות. מנתונים אלה ניתן לקבוע את ערכי IC50.
הניסוי שלנו גילה כי הצורה הפתוחה של LMB002 היא בערך שלב דילול אחד פחות רעיל מאשר אב הטיפוס, פפטיד Gramicidin S, בעוד שהצורה הסגורה מדגימה שלושה עד ארבעה שלבי דילול רעילות נמוכה יותר, אשר עולה עם זמן הדגירה. ניסויי התאים התלת-ממדיים הפיקו את אותו סוג של נתונים גולמיים, התא הבודד פתר תמונות ספרואיד אחד לכל קיר. הכללת הקלצין כצבע צביעה שלישי מאפשרת לכמת את שבר התאים הפעילים מטבולית שנצפה בתעלה הירוקה.
עקומות אפקט המינון, כמו אלה בניסוי הדו-ממדי, התקבלו מערימות התמונות של ערימת Z. לוח A מדגים עקומות כאלה, ומאשש את התוצאות הדו-ממדיות. כפי שמוצג בלוח B, קוטר הספרואיד הכולל משתנה בהתאם לריכוז התרכובת.
הניסוי בשלב השני מאפשר לקבוע ריכוזי LMB002 בשתי הצורות הפוטוגרפיות באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים המזוהה UV. שתי צורות הצילום היו שונות מספיק בזמני השמירה והספיגה, והוצגו משולבות בלוחות A ו-B של האיור. הנתונים המתקבלים מסוכמים באיור, ומאשרים כי מקור האור האדום שלנו גורם לפוטו-המרה של LMB002 סגור טבעת בעומק של עד סנטימטר אחד בפונדקאית הרקמה, בשר טחון בכ -103 מילי וואט לסמ"ר.
תוצאות ניסוי in vivo, שלב שלישי במתודולוגיה שלנו, יוצגו על ידי גרפים המראים את צמיחת הגידול כפונקציה של זמן בעקומות הישרדות קפלן-מאייר. האסטרטגיה המיוצגת כאן להערכת מועמדים לתרופות פוטו-סוויץ' היא מעשית ומתאימה לתרכובות עם פוטו-סוויץ' מסוג diarylethene. שלב ראשון, ניתן להשתמש בכימות ציטוטוקסיות לסינון ראשוני של ספריות התרכובות המבוקרות פוטו.
שלב שני, הערכת יעילות פוטו-מיתוג היא גם קלה להגדרה וגם אתית. זה לא דורש בעלי חיים חיים. שלב שלישי, מודלים פוטופרמקולוגיה in vivo, הטיפול יכול להיות מיושם על בעלי חיים קטנים.
