Les composés photocontrôlés biologiquement actifs contiennent des fragments photoisomérisables réversibles, des photocommutateurs dans leurs molécules. Les composés sont des peptides cycliques modifiés par un fragment de diaryléthène qui subit des transformations électrocycliques réversibles induites par la lumière. Ils peuvent photoswitcher, c’est-à-dire basculer entre une forme biologiquement inactive générée par UV et une forme biologiquement active générée par la lumière rouge.
On croit que les médicaments photocommutables sont plus sûrs que les médicaments non photocommutables. En effet, vous pouvez administrer une forme non toxique et désactivée au corps humain et l’activer localement avec de la lumière uniquement là où vous en avez besoin, c’est-à-dire, par exemple, des tumeurs, des vis sans fin ou des plaies. Il n’existe pas de méthodes ou de protocoles standard pour le développement préclinique ou clinique de tels médicaments photopharmacologiques, nous voulons donc vous montrer ici des expériences qui peuvent être utilisées pour cette recherche préclinique précoce.
Kateryna Horbatok et Tetiana Makhnii présenteront les procédures. Les soins aux animaux et les procédures expérimentales ont été approuvés par la Commission de bioéthique de la société Bienta. Commencez par préparer les tampons à l’aide des procédures standard.
Vous pouvez également utiliser des solutions disponibles dans le commerce. Préparer des solutions mères de composés. Pour chaque composé, peser deux lots de 5,12 milligrammes du composé dans la photoforme fermée à anneau dans deux tubes d’Eppendorf de 1,5 millilitre, l’un avec des parois transparentes et l’autre avec des parois noires non transparentes.
En tant que témoin positif, pesez 2,28 milligrammes du peptide parent, non photocontrôlé, dans un tube supplémentaire. Ajoutez 100 microlitres de DMSO pur à chaque échantillon et vortex pendant 30 secondes. Photoisomériser la solution mère dans le tube à paroi transparente en irradiant la solution avec un laser de 650 nanomètres, densité de puissance lumineuse de 6 watts par centimètre carré, avec vortex pour assurer le mélange.
Continuez jusqu’à ce que la couleur passe du violet foncé au brun clair. Protéger de la lumière avec du papier d’aluminium. Ensemencer 5 000 à 10 000 cellules par puits.
Nous avons utilisé environ 8 000 cellules de carcinome pulmonaire de Lewis dans 200 microlitres de DMEM dans les 60 puits centraux d’une plaque stérile de 96 puits avec un fond transparent et des parois noires non transparentes. Remplissez les 36 puits restants avec du DMEM pur. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius dans une atmosphère à 5% de CO2 pendant la nuit.
Le lendemain, préparer les dilutions en série des composés et le contrôle positif dans des plaques transparentes autoclavées en polypropylène. Commencez par les stocks de DMSO et diluez avec du DMEM, mais ne dépassez pas 1 % de DMSO en volume à la concentration finale la plus élevée. Pour éviter une photoisomérisation incontrôlée des composés étudiés, éteignez les lumières de l’armoire stérile.
Transférer 100 microlitres des dilutions dans 56 puits avec 100 microlitres de DMEM précédemment ajouté pour atteindre la concentration finale requise des composés dans les puits, généralement dans la plage de cinq à 150 micromolaires. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de DMEM à quatre puits, qui servent de contrôle négatif. Couvrez les plaques avec du papier d’aluminium ou un couvercle en plastique non transparent pour éviter toute commutation non contrôlée.
Placez les plaques dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius pour le temps d’incubation choisi. Après les incubations, ajoutez 50 microlitres de solution de coloration par puits aux plaques. Utilisez l’iodure de propidium à cinq micromolaires Hoechst 33342 et l’iodure de propidium à une micromolaire comme solutions de coloration finales pour cette expérience.
Incuber à nouveau à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Effectuez une imagerie de fluorescence automatisée à l’aide d’un objectif de grossissement 20X. Les opérations de laboratoire pour cette partie de la méthode sont identiques à celles décrites pour l’expérience 2D : préparation de la culture cellulaire, incubation avec les composés testés et imagerie.
Cependant, dans ce cas, les cellules sont préparées sous forme de sphéroïdes compacts et matures dans une plaque à 384 puits, à ultra-faible adhérence, à fond en U avec des parois noires non transparentes. L’utilisation d’une plaque de cette taille permet de comparer deux composés en une seule expérience. Dans cette expérience, nous avons utilisé en plus la calcéine AM comme troisième composant de la solution de coloration multicolore.
Les images obtenues à partir des expériences 2D et 3D sont analysées à l’aide du logiciel d’analyse d’images automatisé des instruments. Les cellules costainedées avec des colorants Hoechst et iodure de propidium sont considérées comme necrotiquement mortes, et leur fraction en fonction de la concentration est utilisée pour calculer la valeur de CI50. Assembler le train optique pour l’irradiation de l’échantillon.
Il se compose d’un câble optique provenant de la source lumineuse laser, d’une lentille à focale variable, d’une seringue avec un couvercle non transparent et d’une extrémité à coupe plate. Toutes les opérations ultérieures doivent être effectuées dans une pièce sombre avec un éclairage minimal du lieu de travail. Préparer un échantillon de tissu modèle chargé avec les composés photoformels inactifs.
Dans une course typique, cinq grammes de viande de porc hachée fraîche sont mélangés mécaniquement avec la solution PBS du composé pour atteindre la concentration finale de 50 milligrammes par kilogramme. Remplissez la seringue avec l’échantillon chargé. Irradier l’échantillon dans le train optique pour l’exposition requise et le temps de dosage de la lumière.
Après l’exposition, faites des tranches de l’échantillon de quatre millimètres d’épaisseur en poussant la masse de la seringue avec le piston et en la coupant avec un scalpel. Peser et extraire le composé avec un mélange d’acétonitrile, d’eau, de TFA, 70% d’acétonitrile et 01% d’acide trifluoroacétique dans un tube d’Eppendorf de 1,5 millilitre. Centrifuger à 20XG pendant 30 minutes deux fois pour éliminer le matériau insoluble et recueillir le surnageant.
Enregistrer les chromatogrammes détectés par UV à une détection de 570 nanomètres de leur forme fermée et à une détection de 270 nanomètres de la forme ouverte par anneau. Utiliser les échantillons témoins non irradiés et irradiés préparés de la même manière que les solutions mères dans les expériences sur cellules pour déterminer les temps de rétention spécifiques et calibrer la méthode. Répétez l’expérience trois fois et tracez le pourcentage normalisé de chaque photoforme sur le tracé, pourcentage par rapport à la distance de la surface du tissu irradié.
Au jour zéro, inoculer les femelles adultes C57 black 6 souris pesant environ 20 grammes chacune par voie sous-cutanée avec une suspension d’environ un demi-million de cellules de carcinome pulmonaire de Lewis dans environ 100 microlitres de DMEM et de mélange Matrigel dans la patte arrière droite. Cette procédure est effectuée sous sédation à 5% d’isoflurane. Les animaux sont prêts pour le traitement du cinquième au huitième jour, lorsque les tumeurs sont palpables.
Toutes les opérations impliquant des essais doivent être effectuées dans des conditions semi-obscures. Cette condition est également valable lors du traitement des animaux après avoir reçu la dose composée pendant une période de deux jours. Rassemblez au hasard quatre groupes de huit animaux et retirez la fourrure de la zone tumorale.
Les deux groupes témoins reçoivent une injection intraveineuse du véhicule. 100 microlitres de solution saline par animal de 20 grammes, et les animaux des deux groupes expérimentaux ont reçu le composé testé sous la photoforme inactive dans une solution d’un milligramme par millilitre de solution saline. Administrer le bolus composé dans la veine de la queue à cinq millilitres par kilo.
Deux heures, 45 minutes après l’injection du composé, irradier la zone tumorale pendant 20 minutes sous anesthésie à l’isoflurane avec un laser de 650 nanomètres, en utilisant une densité de puissance lumineuse de 100 milliwatts par centimètre carré. Observez attentivement les conditions des animaux au cours des 30 prochaines minutes. Observez les animaux quotidiennement et mesurez leur poids et les dimensions de leurs tumeurs.
Mesurez les volumes tumoraux et notez la progression de la nécrose. Déterminez le taux de survie à l’aide de la procédure standard. Les résultats de notre protocole pour la première étape dans le cas d’expériences de culture cellulaire 2D peuvent être présentés sous forme d’images, comme illustré ici sur une image représentative pour les cellules de carcinome pulmonaire de Lewis incubées avec LMB002 à différentes concentrations et pour différentes périodes d’incubation.
La cocoloration avec Hoechst et l’iodure de propidium permet de visualiser les noyaux cellulaires dans le canal bleu, donnant ainsi un nombre total de cellules. Des cellules dont l’intégrité de la membrane plasmique était compromise ont été observées dans le canal rouge. En supposant que ce dernier soit mort nécrotiquement, la cytotoxicité apparente d’un composé à l’étude peut être quantifiée en pourcentage des cellules à iodure de propidium positif.
Les résultats de la quantification des données obtenus par analyse automatisée des images sont présentés ici. Pour LMB002, on peut observer des dépendances sigmoïdales du pourcentage de cellules à iodure de propidium positif dans la concentration du composé. À partir de ces données, les valeurs de la CI50 peuvent être déterminées.
Notre expérience a révélé que la forme ouverte de LMB002 est environ une étape de dilution moins toxique que le peptide prototype, la gramicidine S, tandis que la forme fermée présente une toxicité inférieure de trois à quatre étapes de dilution, qui augmente avec le temps d’incubation. Les expériences de cellules 3D ont produit le même type de données brutes, les images sphéroïdes résolues par cellule unique. L’inclusion de la calcéine comme troisième colorant permet de quantifier la fraction de cellules métaboliquement actives observée dans le canal vert.
Les courbes dose-effet, comme celles de l’expérience 2D, ont été obtenues à partir des piles d’images Z-stack. Le panneau A illustre ces courbes, corroborant les résultats 2D. Comme le montre le panneau B, le diamètre total du sphéroïde varie avec la concentration du composé.
L’expérience de la deuxième étape permet de déterminer les concentrations de LMB002 dans les deux photoformes en utilisant une chromatographie liquide haute performance détectée par UV. Les deux photoformes étaient suffisamment différentes en termes de temps de rétention et d’absorbance, montrées intégrées sur les panneaux A et B de la figure. Les données obtenues sont résumées dans la figure, confirmant que notre source de lumière rouge induit la photoconversion LMB002 fermée à une profondeur allant jusqu’à un centimètre dans la viande hachée de substitution tissulaire à environ 103 milliwatts par centimètre carré.
Les résultats de l’expérience in vivo, troisième étape de notre méthodologie, ont été représentés par des graphiques montrant la croissance tumorale en fonction du temps dans les courbes de survie de Kaplan-Meier. La stratégie représentée ici pour évaluer les candidats médicaments photocommutables est pratique et adaptée aux composés avec des photocommutateurs de type diaryléthène. Première étape, la quantification de la cytotoxicité peut être utilisée pour le criblage initial des banques de composés photocontrôlés.
Deuxième étape, l’évaluation de l’efficacité de la photocommutation est à la fois facile à mettre en place et éthique. Il ne nécessite pas d’animaux vivants. Troisième étape, les modèles de photopharmacologie in vivo, la thérapie peut être appliquée à de petits animaux.
