הפרוטוקול שלנו מאפשר למשתמשים למדוד את פעילות ALDH1A1, סמן ביולוגי של תאי גזע באמצעות שיטות מגוונות, החל מציטומטריית זרימה ועד הדמיה מולקולרית של תאים חיים. היתרונות העיקריים של גישה זו הם שהפעלת הגשושית כוללת את תגובת התפנית המאופיינת ביחס אות לרקע גבוה, כמו גם זיהוי איזופורם סלקטיבי ALDH1A1. מי שידגימו את ההליך הזה יהיו מייקל לי, שרה גרדנר ורודריגו טאפיה הרננדז סטודנטים לתואר שני מהמעבדה שלי.
כדי להתחיל, לשאוף את מצע הצמיחה מן התאים התרבית של עניין שמונה באר שקופית. הוסף 500 מיקרוליטר לכל באר של מדיה ללא סרום בתוספת בדיקה פלואורוגנית סלקטיבית איזופורמרית של שני מיקרומולרים או בדיקה בקרה לא תגובתית. דוגרים על המגלשה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
לאחר הדגירה, המשך מיד להדמיית מיקרוסקופ קונפוקלי. אתר את התאים בהגדלה של 10x. ערוץ FITC וערוצי האור המשודרים נדרשים לניסוי זה.
אתר ומקד את התאים באמצעות ערוץ האור המשודר כדי להתמקד באותו מישור Z במשך כל הניסוי כדי להסיר הטיה. כוונן את עוצמת הלייזר ואת רווח FITC להגדרה המתאימה שבה האות מדגימות AlDeSense AM של הבקרה ניתן לזיהוי מינימלי, תוך כדי ראיית אות בדגימות AlDeSense AM. התאם כל פרמטר על-ידי הזזה של הסרגל המתאים.
ייתכן שיהיה צורך להתאים את ההגדרות כמה פעמים כדי לזהות את הפרמטרים הנכונים. לאחר האופטימיזציה, השלימו את שאר הניסוי בתוך קו התא באמצעות פרמטרים זהים. צלם שלוש תמונות לכל באר עבור סך של שלוש בארות לכל תנאי טיפול ושמור את התמונות.
הקפד להתמקד באמצעות ערוץ האור המשודר רק בעת מעבר בין מישורים ובארות כדי למנוע הטיה. לאחר מכן, באמצעות תוכנת עיבוד התמונה לפצל את קובץ CZI לערוצים שונים ולספור את המספר הכולל של תאים ותאים פלואורסצנטיים. כדי לקבוע את אחוז התאים החיוביים אלדהיד דהידרוגנאז 1A1, חלק את מספר התאים הפלואורסצנטיים במספר התאים הכולל בכל תמונה.
ספרו באותו אופן עבור כל תמונה כדי למנוע בלבול בין משתנים. הוציאו בקבוק תרבית תאי T25 המכיל את התאים המוחזקים באינקובטור. הוסף טריפסין לניתוק תאים, וספור את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי.
לאחר מכן מכניסים את התאים לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר באמצעות צנטריפוגה במשקל 180 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. להשהות מחדש את התאים במיליליטר אחד של בדיקה שני מיקרומולרים או תמיסת בדיקה בקרה ב- PBS. רוקנו את התאים בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות כדי להבטיח חשיפה אחידה לצבע.
לאחר תקופת הדגירה, משחררים את התאים בצנטריפוגה ב -180 גרם למשך חמש דקות ב -25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן להשעות מחדש את התאים ב 0.5 מיליליטר של PBS. העבירו את התאים דרך מסננת תאי רשת ניילון בגודל 35 מיקרומטר על צינור המונח על קרח כדי להסיר גושי תאים שעלולים לסתום את ציטומטר הזרימה.
הפעל את מכשיר ציטומטר הזרימה והפעל את פרוטוקול ההפעלה. בדוק אם יש נוזל נדן ומותניים ריקות. הפעילו את הקווים עם 10% אקונומיקה ומים במשך חמש דקות כל אחד.
לאחר מכן הפעל חרוזי בקרת איכות כדי להבטיח תפקוד תקין. בכרטיסייה הגדרות, בחר פיזור צדדי קדימה ו- FITC עבור מסנן הפלואורסצנציה. ציירו שטח פיזור קדימה לעומת התוויית שטח פיזור צדדי לאוכלוסיית התאים הראשית הקרובה למרכז התרשים.
לאחר מכן, ציירו אזור פיזור קדימה, לעומת תרשים רוחב פיזור קדימה עבור הפסים האופקיים הצרים המציינים סינגלים. לאחר מכן ציירו שטח FITC לעומת תרשים שטח פיזור קדמי כדי לבחון את התפלגות התאים הממוינים על ידי בדיקת ההפעלה הפלואורוגנית הסלקטיבית של איזופורם. לאחר מכן, ציירו היסטוגרמה של אזור FITC כדי לצפות בשינוי האוכלוסייה בהתבסס על FITC ולקבוע את אחוז התאים החיוביים אלדהיד דהידרוגנאז 1A1.
כדי למטב את עוצמת הלייזר של FITC, הפעל דגימה עם הבדיקה כך שהזנב הימני של עקומת ההיסטוגרמה יהיה קרוב לאות השטח המרבי של FITC. ייתכן שיהיה צורך לחזור על שלב מיטוב עוצמת הלייזר מספר פעמים, אך אין לשנות את עוצמת הלייזר בין הדגימות, לאחר שהוגדרה הגדרה לניסוי. לאחר מכן, הוסף מדגם לניפוי, והפעל אותו עם בדיקת הבקרה.
יש לצפות בשינוי אוכלוסייה כדי לחשוף את הטווח הדינמי המרבי. הפעל כל מדגם עבור 10, 000 ספירות שנעשו במשולש. לאחר השלמת איסוף הדגימות, הפעל את הקווים עם 10% אקונומיקה ומים במשך חמש דקות כל אחד, ולאחר מכן כבה את המכשיר.
לעבד את הנתונים באמצעות תוכנת ציטומטריית זרימה וללכת באוכלוסיית התאים הרצויה. באמצעות בחירת שער המלבן, הגדר את ההליכה השלילית אלדהיד דהידרוגנאז 1A1, כך שיותר מ -99.5% מהאירועים בדגימות בדיקת הבקרה מתרחשים בתוך שער זה. שאר התאים ייחשבו אלדהיד דהידרוגנאז 1A1 חיובי.
החל את אותם שערים על דגימת הבדיקה. לכמת את מספר האירועים הנחשבים אלדהיד דהידרוגנאז 1A1 שלילי ו 1A1 חיובי. סיבובי הקיפול הממוצעים עבור כל קו תאים נקבעו כדי לכמת את הפעילות הכוללת של אלדהיד דהידרוגנאז 1A1.
אחוז התאים החיוביים אלדהיד דהידרוגנאז 1A1 נקבע בכל קו תא על ידי כוונון עוצמת הלייזר והרווח. כדי למזער את האות בדגימת הבקרה שטופלה ב-AlDeSense AM, האות הפלואורסצנטי עבר אופטימיזציה בתאים שטופלו ב-AlDeSense AM. על ידי ספירת מספר התאים החיוביים אלדהיד דהידרוגנאז A1A, נקבע אחוז התאים החיוביים אלדהיד דהידרוגנאז A1A.
עם היישום של הבדיקה הפלואורוגנית האיזופורמית הסלקטיבית, אוכלוסיית התאים החיוביים אלדהיד דהידרוגנאז 1A1 כומתה בתוך כל קו תא על ידי gating עבור 0.5% העליונים של התאים הבהירים ביותר בתוך אוכלוסיית הביקורת AlDeSense AM שטופלה. ניתוח פאנל תאי סרטן השחלות גילה את אחוז התאים החיוביים אלדהיד דהידרוגנאז 1A1. מהתוצאות המתקבלות של שורות התאים הסרטניים שנבדקו, ניתן להסיק כי BG-1 הוא בעל הפעילות הנמוכה ביותר של אלדהיד דהידרוגנאז 1A1 והאוכלוסייה החיובית הנמוכה ביותר של אלדהיד דהידרוגנאז 1A1.
בנוסף, הדמיה קונפוקלית וציטומטריית זרימה חשפו את האחוז הגדול ביותר של תאים חיוביים אלדהיד דהידרוגנאז 1A1 בתאי Caov-3. אבל הפעילות הכוללת של קו התאים הייתה רק השלישית בגובהה. לחלופין, תאי OVCAR-3 הכילו את האוכלוסייה החיובית השלישית בגודלה לאלדהיד דהידרוגנאז 1A1, אך הציגו את הפעילות הכוללת הגבוהה ביותר.
AlDeSense היא בדיקה רב-תכליתית וניתנת להכללה לזיהוי CSCs בקווי תאים אימורטליים ובדגימות חולים. אנו מקווים לראות בו כלי פרוגנוסטי במסגרת הקלינית.
