אנו מציגים שיטה ליצירת תאי T חד-חיים המושרים על ידי תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, שמקורם באנטיג'ן, באמצעות תאי T חד-חיוביים מסוג CD8 אלפא,באמצעות מערכת תרבות-תכולה שותף OP9-Delta-1. שיטה זו היא כלי רב עוצמה עבור ייצור תאי T במבחנה ותקל על הפיתוח של תאי T מופקים במבחנה לשימוש ברפואה רגנרטיבית וטיפולים מבוססי תאים. זה יכול גם להיות מותאם לדור של לימפוציטים אחרים, כמו תאי NK.
בעת ביצוע טכניקה זו, חשוב להעריך מראש את הרבה FBS ומעבר OP9-Delta-1 תאים באופן עקבי כאשר מגע ציטופלסמי תא לתא מתחילים למנוע התממיה וחננות התא. הפגנת ההליך תהיה ד"ר מייגן גוד, עמיתה אונקולוגית כירורגית מהצוות שלי. התחל על ידי בדיקת מושבות iPSC אנושיות במיקרוסקופ סטריאו, ולהסיר את כל אזורי ההתבראות מהתרבות עם קצה הפלסטיק של קצה פיפטי 200 מיקרוליטר.
כאשר המושבות מגיעות לקוטר של 0.8 עד 1.2 מילימטרים, מעבר ל-IPSCs האנושיים. שאפו את המדיה המושקעת, והוסיפו 10 מיליליטר של מדיה אנושית של iPSC בתוספת מעכבי רוק 10 מיקרומולרים. מגלגלים כלי מעבר חד פעמי על פני המנה כולה בכיוון אחד, ומוודאים לשמור על לחץ אחיד ושלהב הגלילה כולו נוגע בצלחת התרבות.
מסובבים את צלחת התרבות ב-90 מעלות וחוזרים על הגלגול. חזותית לאשר את החיתוך הנכון של המושבות עם מיקרוסקופ. הם אמורים להיראות בדוקים.
לאחר מכן, לנתק את המושבות לחתוך על ידי שטיפה מכנית עדינה עם פיפטה 200 מיקרוליטר. ויזואלית להעריך את מספר גושים המושבה, ולהעביר בין 350 ו 600 גושים לצלחת חדשה 10 ס"מ של פיברובלסטים עובריים עכבר עם 10 מיליליטר של מדיה iPSC אנושי טרי בתוספת מעכבי רוק. דגירה המנה לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
למחרת, שאפו את התקשורת המושקעת, והוסיפו 10 מיליליטר של תקשורת iPSC אנושית טרייה. שנה את המדיה כל יום או יומיים, בהתאם לקצב גידול התאים. תרבו את תאי OP9-Delta-1 במדיה OP9 ב-37 מעלות צלזיוס.
כאשר הם מגיעים לקונפלינציה, שאפו את התקשורת, ושטפו את התאים פעם אחת עם חמישה מיליליטר של מגנזיום 1x, סידן ו- PBS נטול פניול אדום. שאפו את ה-PBS, הוסיפו שני מיליליטר של 05% טריפסין-EDTA, והדקרו את התאים במשך חמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להוסיף ארבעה מיליליטר של מדיה OP9, מכנית לנתק את שכבת התא על ידי צינורות.
מעבירים את ההשעיה התא לצינור חרוט 50 מיליליטר דרך מסננת תא 100 מיקרומטר, וצנטריפוגה ב 300 פעמים g בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. שאף את העל-טבעי, ולחץ מחדש על התאים ב-12 מיליליטר של מדיה OP9. הוסף שמונה מיליליטר של מדיה OP9 לכל אחד משש מנות תרבות תאים חדשות, וצלחת שני מיליליטר של המתלים OP9-דלתא-1 תא על כל מנה.
רוק את המנה מצד לצד וחזית לאחור כדי להבטיח חלוקה שווה של התאים. הדגירה את התאים ב 37 מעלות צלזיוס, ולחזור על המעבר כאשר התאים להגיע קונפלינציה. הכינו מנות OP9-Delta-1 ג'לטין שבוע לפני שיתוף פעולה עם iPSCs אנושיים.
מוסיפים 4 מיליליטר של 0.1% ג'לטין לשלוש מנות חדשות לתרבות התאים, ומדרגים אותן במשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, שאפו את הג'לטין, והוסיפו לכל מנה שמונה מיליליטר של מדיה OP9. מעבר מנה אחת נוחה של תאי OP9-Delta-1 לשלוש מנות מצופות ג'לטין.
לאחר ארבעה ימים, להוסיף 10 מיליליטר של OP9 מדיה לכל צלחת של תאים, עבור סך של 20 מיליליטר של מדיה לכל מנה. התחילו את תרבות ה-iPSC האנושית במנות קונפלנטיות OP9-Delta-1 שבעה עד שמונה ימים לאחר שעברו את התאים. שאפו את התקשורת מצלחת של iPSCs אנושיים, והוסיפו 10 מיליליטר של מדיה OP9.
חותכים ומתנתקים מושבות תאים באמצעות כלי מעבר חד פעמי לתאים, ומעבירים 350 עד 600 גושים של מושבות חתוכים לצלחת OP9-Delta-1 טרום-ג'לטין עם 10 מיליליטר של מדיה חדשה OP9. רוק צלחת התרבות מצד לצד וחזית לאחור כדי להבטיח חלוקה שווה של מושבות. למחרת, שאף את המדיה שהוצאה, והחלף אותה ב-20 מיליליטר של מדיה חדשה של OP9.
גושי iPSC האנושיים המתרבים במשותף ב- OP9-Delta-1 ליום אחד צריכים להופיע כמושבות קטנות, עגולות ומונוליות. ביום החמישי, שאפו 10 מיליליטר של מדיה מבוזבזת, והוסיפו 10 מיליליטר של מדיה חדשה של OP9. המושבות יתחילו להתבדל למוסודרם פרימיטיבי, המאופיין במרכז אפל רב שכבתי.
חזור על תהליך זה ביום התשיעי, ובנקודה זו המבנים המרכזיים הרב שכבתיים יתפתחו לצורות דמויי כיפה. לקצור את התאים ההמוטופיאטיים ביום 13, ובנקודה זו המבנים מורכבים אורגנואיד מרכזי כהה מוקף ברשת של אזורים דמויי כיפה. שאפו את התקשורת, ושטפו את התאים פעם אחת עם חמישה מיליליטר של תווי מלח 1x phenol נטולי אדום של הנקס עם סידן ומגנזיום, או HBSS.
לאחר הכביסה, להוסיף 250 microliters של 5, 000 יחידות למיליליטר קולגן IV ל 10 מיליליטר של HBSS. מוסיפים את התערובת לתאים, ו דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות. שאפו את תערובת הקולגנס HBSS, ושטפו את התאים פעם אחת עם חמישה מיליליטר של PBS.
לאחר שטיפה עם PBS, מוסיפים חמישה מיליליטר של 0.25% טריפסין-EDTA, ו דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאחר מכן, הוסף ארבעה מיליליטר של מדיה OP9, ולנתק את שכבת התא על ידי pipetting כדי להפוך את ההשעיה תא יחיד. מעבירים את מתלי התא לצינור חרוט 50 מיליליטר דרך מסננת 100 מיקרומטר, וצנטריפוגה הצינור ב 300 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
שאף את העל-טבעי, והתן מחדש את התאים ב-10 מיליליטר של מדיה OP9. צלחת ההשעיה התא על צלחת חדשה ג'לטין 10 ס"מ תרבות התא, ו דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות. לאחר מכן, לאסוף את כל התאים שאינם חסידים על ידי צינורות עדינים.
העבר את ההשעיה התא צינור חרוט 50 מיליליטר דרך מסננת, צנטריפוגה כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, שאף את העל-טבעי, והתן מחדש את התאים ב-10 מיליליטר של מדיית ההבידול. צלחת ההשעיה התא על צלחת חדשה OP9-דלתא-1 confluent.
מעבירים את התאים ביום ה-16 לפי הוראות כתב היד, וממשיכים להעביר את התאים שאינם חסידים כל חמישה עד שבעה ימים לאחר מכן. לאחר 35 ימים של התבדלות, העשירו את אוכלוסיית התאים החיוביים CD4 בבידוד חרוזים מגנטיים CD4 בהתאם לפרוטוקול היצרן. לאחר מכן, בצע שימוש חוזר בתאים במדיה OP9, וצלחת מיליליטר אחד של השעיית תא לתוך כל באר של רקמות-תרבות, שטוח למטה, 24 גם צלחת של OP9-דלתא-1 confluent.
לעורר תאים על ידי הוספת 100 יחידות בינלאומיות של IL-2 אנושי, חמישה ננוגרם של IL-7 אנושי, 500 ננוגרם של נוגדן CD3 אנטי אנושי, ושני מיקרוגרם של נוגדן CD28 אנטי אנושי לכל באר. לאחר ארבעה עד שבעה ימים, ניתן לאסוף תאים לניתוח נוסף. לאחר תרבות על OP9-Delta-1 ללא ג'לטין בנוכחות גורם תאי גזע אנושיים, FLT3-ligand אנושי, ו interleukin-7 אנושי, הפטיטורים hematopoietic הבדיל לתוך CD3, CD7, CD4, ו CD8 כפול חיובי T תאי שושלת, שרובם ביטא קולטני תא T ספציפיים EPITOPE MART1.
כאשר CD4, CD8 כפול חיובי תאי T היו מגורה עם נוגדנים אנטי אנושיים CD3 ו CD28 בנוכחות interleukin אנושי-7 ו 2, מספר CD3 חיובי CD8 אלפא בטא תאים חיוביים יחיד גדל ונשאר ספציפי עבור EPITOPE MART1, המאשר את שימור ספציפיות האנטיגן בירושה שלהם. מבחן ELISpot גילה כי כאשר מתורבת בנוכחות MART1 פפטיד, אנושי iPSC נגזר CD8 אלפא בטא יחיד חיובי T תאים מפרישים כמויות גבוהות יותר של גמא אינטרפרון בהשוואה הן בתפזורת ו CD8 אלפא אלפא יחיד חיובי T תאים. לא זוהה ביטוי גמא אינטרפרון עבור תאי T ותאים מציגי אנטיגן בלבד, המוכיחים כי תאי T אנושיים שמקורם ב- T-iPSC הם ספציפיים לאנטיגן ופונקציונליים.
צעד חשוב בשיטה זו הוא העשרת חרוזים מגנטיים CD4 כדי לחסל CD4 שלילי, CD8 שלילי כפול שלילי תאים שליליים, אשר יכול לגרום להרג ישיר של תאים חיוביים כפולים על גירוי. טכניקה זו ישימה לשימוש עם מספר מקורות של תאים אנושיים, כולל תאי גזע hematopoietic ותאי גזע עובריים. תאי T לא בוגרים שמקורם ב- iPSC הנוצרים בשיטה זו יכולים להשתפר עוד יותר עבור הדור של תאי T דמויי אנטיגן אנושיים בוגרים לשימוש טיפולי עתידי.
לאחר צפייה בסרטון זה, הצופה צריך להבין כיצד ליצור תאי T אלפא אלפא נגזר IPSC אנושי באמצעות מערכת OP9-Delta-1 שיתוף תרבות.
