אנו מודים לכל חברי מעבדת AI על הערותיהם והצעותיהם המועילות. ברצוננו להודות פרופ &#39;מארק היפ (מקס פלנק המכון לביוכימיה) עבור מתן לנו את המעבורת- GFP וקטור. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הישראלית למדע (ISF # 124/14), הקרן הדו-לאומית למדע (BSF # 2013325), FP7 מארי קורי (קרייג # 333794) והמכון הלאומי לפסיכוביולוגיה בישראל NIPI # b133-14 / 15).

1. הכנת קו סלולרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי כ -1,000,000 תאי עצב בעמוד השדרה של תאי עצב נוירובלסטומה (NSC-34 תאים) שאוחסנו במיכל חנקן נוזלי. השתמש 37 ° C אינקובטור מים עד התאים מופשר לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני טרי, חם (בינוני DMEM המכיל 10% בסרום שור עוברית (FBS), 1% L- גלוטמין, 1% אנטיביוטיקה עט עט). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים מופשר (SL16R) ב XG 500 במשך 5 דקות, ויצרו תא גלולה. מחק את המדיום ולהוסיף 1 מ&quot;ל של המדיום החדש עבור resuspension התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התאים resuspended בבקבוק 15 מ&quot;ל ולהוסיף תוספת 5 מ&quot;ל של המדיום. דגירה התאים לילה חממה סטרילית עם 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל, במקום coverslips 8 uncoated (כיסוי זכוכית: 12 מ&quot;מ, 0.13-0.17 מ&quot;מ עובי) בתוך 60 מ&quot;מ צלחת תרבות לעקר באמצעות אתנול 70% וחשיפה 30 דקות של אור UV עד יבש. מוסיפים את המדיום לכל צלחת ומפזרים כדי לשטוף את אתנול שיורית.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חיץ טריפסין (2.5 גרם של טריפסין ו 0.2 גרם של EDTA ב 1 L של תמיסת מלח מאוזן של הנקס) לתאים לאחר שהם מגיעים כ -90% מפגש (בערך 6 מיליון תאים לכל בקבוק) כדי לאפשר תאים חסיד לנתק. הערה: NSC-34 תאים רגישים רק דורשים 15 ים של הדגירה חיץ טריפסין 1 דקות נוספות של הדגירה ללא טריפסין לפני דיסוציאציה באמצעות המדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט התאים על 60 מנות תרבות מ&quot;מ כבר המכיל את coverslips עם 3 מ&quot;ל של מדיום, כ 350,000 לכל מנה. להשאיר אותם בחממה במשך 24 שעות כדי לאפשר מצורף התא על coverslips. </li></ol> 2. Transfection Cell הערה: לאחר כ 24 שעות, תאים NSC-34 יגיעו המפגש 40% (כ 800,000 תאים) ויהיה מוכן transfection. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני DMEM טהור (300 μL של מדיום DMEM עבור כל צלחת 60 מ&quot;מ תרבות) באמבט microcentrifuge סטריליEs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיקרוגרם של כל פלסמיד נדרש transfection לכל צינור microcentrifuge המכיל DMEM. הערה: המעבורת- GFP פלסמיד היא חובה בכל transfections התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף transfection מגיב לכל צינורות microcentrifuge המכילים פלסמידים הנדרשים שלהם. הנה, להוסיף 4 μL של מגיב transfection מסחרי עבור כל 2 מיקרוגרם של ה- DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס צינורות microcentrifuge המכיל DMEM, פלסמידים, ואת מגיב transfection ו דגירה אותם בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים כל צינור microcentrifuge לצלחת תרבות ומערבבים את המנה בעדינות כדי ליצור פתרון הומוגני. מניחים את צלחת בחזרה בחממה במשך 48 שעות. הערה: מאז המעבורת- GFP צריך לבוא לידי ביטוי בכל התאים, המעבורת- GFP יעילות transfection ניתן בחינה חלקית נבדק מראש באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאחר transfection לילה. בדיקה מלאה של חלבונים שאינם פלואורסצנטי לידי ביטוי יכול להתבצע באמצעות analys immunoblotJ </li></ol> 3. מיקרוסקופיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את coverslips המכילים transfected NSC-34 תאים לבעלים coverslip ולשטוף בעדינות עם מלוחים שנאגרו מלוחים (PBS) כדי להסיר את התאים המתים מנותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי תיקון התא מתאים באמצעות מסנן פלואורסצנטי ירוק עם מיקרוסקופ הפוך. הערה: תיקון תא מתאים מוגדר שדה מיקרוסקופ של נוף מראה מספר גדול של תאים (20-30 תאים בשדה) שבו גרעינים מוגדרים בבירור בתאים. גרעיני תאים בתוך תיקון התא מזוהים לראשונה על ידי העין מסומנים ידנית על ידי תוכנת הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μL של מעכב exportin 1 Leptomycin B (LMB) המכיל 10 ng / mL LMB ב PBS כדי coverslips ידי טפטוף המאגר על coverslips תחת המיקרוסקופ. הערה: נקודת זמן זו נקבעת כאפס מרווח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את עוצמת הניאון של גרעינים מסומנים במרווחים של 3 במשך כ 400-500 s. </li><li&gt; בדוק בין 3 ל 5 כיסוי לכסות עבור כל קבוצת transfection בכל ניסוי בודדים. </li></ol> 4. ניתוח הערה: מאז תאים שונים להביע רמות שונות של מעבורת ניאון- GFP, חשוב לנרמל את עוצמת הניאון הגרעיני של כל תא כדי עוצמת ניאון הראשונית שלה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את עוצמת הניאון של הגרעינים המסומנים על ידי חלוקת מרווח פלורסנט 3-s של כל גרעין עם הממוצע של שישה אינטרוולים הראשונים של גרעין זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הנורמליזציה של כל גרעין, לייצר עקומת עוצמת ניאון המייצג את השינוי גרעיני הקרינה כפונקציה של זמן עבור כל תיקון התא. כדי לעשות זאת, לחשב את הממוצע של כל התאים בכל תיקון תאים (בהיקף של כ 20-30 תאים בכל תיקון). הערה: עקומת עוצמת ניאון גרעיני דומה עקומת הרוויה Michaelis-Menten, אשר נצפה טוב יותר בתוך ti מוגברתלי תקופות. זאת בשל ירידה בכמויות cytosolic של המעבורת- GFP עם הזמן עקב התחבורה הגרעינית. ירידה זו סטטיסטית מורידה את ההסתברות של המעבורת- GFP להובלה לגרעין, ובכך להגיע הרוויה הקרינה הגרעינית. המדרון נגזר מן השיעור ההתחלתי ליניארי של עקומת התשואות קצב הכניסה V מקסימום לתוך הגרעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את המדרונות V מקסימום של כל תיקון התא, נגזר שלושה עד חמישה ניסויים עצמאיים, באמצעות תוכנת גרפים לייצר מדרון אחד המייצג כל קבוצה ניסיונית. בצע כימות באמצעות ניתוח סטטיסטי חד כיווני ANOVA. </li></ol> 5. אימות חלבון ואלידציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 60 מנות תרבות מ&quot;מ המכילים תאים שיורית (לא נעשה שימוש בניסוי לעיל) מכל קבוצה ניסיונית על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשליך את המדיום לשטוף את התאים פעמיים עם PBS לדלל ולשטוף את המדיום שנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפל בתאים עם 200-400ΜL של חיץ תמוגה המכיל PBS, 0.5% Triton, ו פרוטאז מעכב קוקטייל Tablet (PI). לגרד באמצעות מגרד תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התאים במאגר תמוגה בצינור microcentrifuge ו homogenize עם homogenizer בסל&quot;ד 4,000 דקות 1 מתחת לקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים homogenized ב 2,500 xg במשך 10 דקות. איסוף supernatant, לכמת את ריכוז החלבון באמצעות assay Bradford, ולאחסן עד לשימוש ב -20 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף בין 30 ו - 70 מיקרוגרם של חלבון הכולל (תלוי בחלבון) לטעון אותו לתוך ג&#39;ל SDS-PAGE לבדיקת ביטוי חלבון באמצעות assay immunoblot. </li></ol>

<ol>
	<li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular biology of the cell. , (2002).</li><li>Freitas, N., Cunha, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+signals+for+the+nuclear+import+of+proteins.">Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins.</a> Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).</li><li>Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+short+amino+acid+sequence+able+to+specify+nuclear+location.">A short amino acid sequence able to specify nuclear location.</a> Cell. 39, 499-509 (1984).</li><li>la Cour, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+prediction+of+leucine-rich+nuclear+export+signals.">Analysis and prediction of leucine-rich nuclear export signals.</a> Protein Eng Des Sel. 17, 527-536 (2004).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+screen+connects+nuclear+transport+genes+to+DPR+pathology+in+c9ALS/FTD.">Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD.</a> Sci Rep. 6, 20877 (2016).</li><li>Freibaum, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GGGGCC+repeat+expansion+in+C9orf72+compromises+nucleocytoplasmic+transport.">GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 525, 129-133 (2015).</li><li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD/ALS.">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nat Neurosci. 18, 1226-1229 (2015).</li><li>Kwon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly-dipeptides+encoded+by+the+C9orf72+repeats+bind+nucleoli,+impede+RNA+biogenesis,+and+kill+cells.">Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells.</a> Science. 345, 1139-1145 (2014).</li><li>Rossi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+accumulation+of+mRNAs+underlies+G4C2-repeat-induced+translational+repression+in+a+cellular+model+of+C9orf72+ALS.">Nuclear accumulation of mRNAs underlies G4C2-repeat-induced translational repression in a cellular model of C9orf72 ALS.</a> J Cell Sci. 128, 1787-1799 (2015).</li><li>Shi, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+PRn+poly-dipeptides+encoded+by+the+C9orf72+repeat+expansion+block+nuclear+import+and+export.">Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C9orf72+repeat+expansion+disrupts+nucleocytoplasmic+transport.">The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 525, 56-61 (2015).</li><li>Zhang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9ORF72+poly(GA)+aggregates+sequester+and+impair+HR23+and+nucleocytoplasmic+transport+proteins.">C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins.</a> Nat Neurosci. 19, 668-677 (2016).</li><li>Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Charcot+to+Lou+Gehrig:+deciphering+selective+motor+neuron+death+in+ALS.">From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 806-819 (2001).</li><li>DeJesus-Hernandez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+GGGGCC+hexanucleotide+repeat+in+noncoding+region+of+C9ORF72+causes+chromosome+9p-linked+FTD+and+ALS.">Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS.</a> Neuron. 72, 245-256 (2011).</li><li>Renton, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hexanucleotide+repeat+expansion+in+C9ORF72+is+the+cause+of+chromosome+9p21-linked+ALS-FTD.">A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD.</a> Neuron. 72, 257-268 (2011).</li><li>Boeve, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+frontotemporal+dementia+and/or+amyotrophic+lateral+sclerosis+associated+with+the+GGGGCC+repeat+expansion+in+C9ORF72.">Characterization of frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis associated with the GGGGCC repeat expansion in C9ORF72.</a> Brain. 135, 765-783 (2012).</li><li>Haeusler, A. R., Donnelly, C. J., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+biology+of+the+C9orf72+nucleotide+repeat+expansion+in+neurodegenerative+disease.">The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease.</a> Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).</li><li>Woerner, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+aggregates+interfere+with+nucleocytoplasmic+transport+of+protein+and+RNA.">Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA.</a> Science. 351, 173-176 (2016).</li><li>Tao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+stress+and+impaired+stress+granule+formation+contribute+to+C9orf72+RAN+translation-induced+cytotoxicity.">Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity.</a> Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).</li><li>Wen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+proline-arginine+RAN+dipeptides+linked+to+C9ORF72-ALS/FTD+form+toxic+nuclear+aggregates+that+initiate+in+vitro+and+in+vivo+neuronal+death.">Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death.</a> Neuron. 84, 1213-1225 (2014).</li></ol>

למחברים אין מה לגלות.

פרוטוקול זה מדגים assay חדש רגיש וכמותי חדש להעריך שינויים דקה התחבורה nucleocytoplasmic. באמצעות מערכת זו, ניתן לבחון ולמדוד התחבורה nucleocytoplasmic ואת תפקוד לקוי שלה בזמן אמת, לא רק פגמים גדולים המביאים לשינויים דרמטיים בחלוקה חלבון. Assay זה לא רק יש יתרון רגישות, אבל זה גם דורש הכנה קטנה, הוא זול, והוא מבחין קל מאוד מעורבות נמוכה. כדי לבחון את היעילות של מערכת זו, C9orf72 חלבונים, פולי (GR) ו פולי (PR) DPRs, מודלים של ALS ו FTD שהיו בעבר הוכיחו לגרום מחסור nucleocytoplasmic התחבורה, שימשו 5 , 7 , 8 , 10 , 12 . באמצעות assay זה, ניתן היה להוכיח, בזמן אמת, ירידה של כ 50% בקצב ייבוא ​​גרעיני בתאים המבטאים את DPRs לעומת תאים transfected עם וקטור שליטה. לכן, מערכת זו פותחת את האפשרות בקלות למדוד שינויים קטנים בתחבורה nucleocytoplasmic, אשר יכול להיגרם על ידי אלה או אחרים ALS או FTD מוטציות או מחלות אחרות שבהן פגמים פוטנציאליים בתחבורה nucleocytoplasmic עשויים להתקיים. למרות פרוטוקול המתואר כאן עוסק בתאי נוירון דמויי המנוע, זה יכול להיות מותאם בקלות סוגים אחרים של תאים. חשוב יותר, באמצעות מערכת זו, ניתן כעת לקבוע כיצד גורמים מולקולריים שונים או תרופות עשוי לסייע במניעת או לחילופין (אפילו חלקית) ליקויים בתחבורה nucleocytoplasmic ALS, FTD, או הפרעות אחרות. מגבלה אפשרית אחת באמצעות assay זה הוא היכולת מוגבלת לצפות ולסמן את גרעיני התא בתאים שאינם בעלי גרעין ברור או שיש אחד קטן מאוד. כדי להתגבר על זה, פתרון אפשרי עשוי להיות פשוט להשתמש magnific גדול<html> Ation. עם זאת, זה יהיה בסופו של דבר להפחית את כמות התאים כל תיקון התא, ובכך להגדיל את כמות הניסויים הדרושים כדי להגיע לערך משמעותי. שיקול נוסף מתייחס היחס בין ה- GFP-GFP ל- cytoplasm לפני הוספת LMB. יחס זה עשוי להיות שונה מאוד בסוגי תאים שונים וכתוצאה מכך עשוי להיות קטן מדי (קרוב ל 1: 1 יחס) כדי להראות גרעין גלוי. פתרון אפשרי אחד הוא להשתמש בסמן גרעיני מראש. זה לא ישפיע על הניתוח הסופי, שכן כל תא הוא מנורמל המקורי הקרינה הגרעינית שלה. בנוסף, מומלץ לכייל את ריכוז LMB המשמש לעיכוב exportin לפני assay זה מבוצע ביעילות לבחון את הגידול האופטימלי הקרינה הגרעינית. מחסור nucleocytoplasmic התחבורה הוא הציע לשחק תפקיד מרכזי ניוון של נוירונים המנוע ALS 5 ,= &quot;Xref&quot;&gt; 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . אם זה המקרה, פגמים דומים nucleocytoplasmic תחבורה כמו אלה שנצפו במודל C9orf72 היה צפוי לשחק תפקיד מודלים אחרים ALS. עם זאת, בשל השונות הגדולה בין המודלים השונים, התוצאות הסופיות והביטויים המולקולריים הנובעים מהפרעה נוקלאוקסיטופלאסמית בכל מקרה עשויים להיות שונים מעיניהם. למרות מחקר מקיף על מודלים שונים FALS, קישור אותם עם מנגנונים משותפים נשאר אתגר. Assay זה עשוי כעת לספק את ההזדמנות כדי להתגבר, לפחות באופן חלקי, אתגר זה.

קומפלקס הגרעין הגרעיני (NPC) שולט ביבוא וביצוא של מולקולות גדולות אל תוך גרעין התא וממנו. בניגוד מולקולות קטנות, אשר יכול להיכנס לגרעין ללא תקנה 1 , הובלה של מולקולות גדולות נשלטת מאוד על ידי NPC. מולקולות גדולות אלה, כגון חלבונים ורנ&quot;א, מקושרות לגורמי תובלה, כולל יבואנים ויצואנים, לייבוא ​​ולייצוא מהגרעין 2 . כדי לייבא, חלבונים חייבים להכיל מוטיב פפטיד קטן, הנקרא בדרך כלל אות לוקליזציה גרעינית (NLS), אשר מחויב על ידי importins 2 . רצפים אלה של חומצות אמינו לשמש תג והם מגוונים בהרכב 3 , 4 . חלבונים ניתן לייצא מן הגרעין כדי הציטופלסמה בשל הקשר שלהם עם exportinS, אשר נקשרים רצף האות, נקרא בדרך כלל אות הייצוא הגרעיני (NES) 2 . הן importins ו exportins מסוגלים להעביר את המטען שלהם עקב הרגולציה של קטן ראס הקשורים חלבון גרעיני GTPase (רן) 2 . רן הוכח להתקיים במצבים קונפורמטיביים שונים, תלוי אם הוא קשור ל- GTP או לתוצר. כאשר מחויב ל- GTP, רן יכול להיקשר לייבוא ​​או לייצוא. עם החובה ל- RanGTP, היבואנים משחררים את מטענם, ואילו היצואנים חייבים לחייב את רנג-טאפ כדי ליצור קומפלקס עם מטען היצוא שלהם. מצב נוקליאוטיד הדומיננטי מחייב של רן תלוי במיקום שלה בגרעין (RanGTP) או הציטופלסמה (RanGDP). לאחרונה, מספר מחקרים הראו קשר בין ליקויים בנתיב nucleocytoplasmic לבין טרשת לרוחב amyotrophic (ALS) ו דמנציה frontotemporal (FTD) 5 , 6 </sup&gt; , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . ALS היא מחלה נוירודגנרטיבית פרוגרסיבית וקטלנית המשפיעה על שני נוירונים מוטוריים עליונים ותחתונים (MNs) 13 וכתוצאה מכך שיתוק ובסופו של דבר למוות, בתוך 2-5 שנים בממוצע. רוב המקרים של ALS מסווגים כ- SPS, ללא כל קשר גנטי לכאורה, אך 10% הם בירושה באופן דומיננטי (ALS משפחתי, FALS). לאחרונה, hexanucleotide הרחבות חוזרות (HREs) של כרומוזום 9 פתוח מסגרת הקריאה 72 (C9orf72) הגן זוהו 14 , 15 כגורם גנטי של ALS ו FTD. מוטציות אלה מהווים 30-40% מהמקרים של FALS 16 , ומחקרים שונים טענוכי הם גורמים לרעילות על ידי המשפיעים על התחבורה nucleocytoplasmic 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . מחקרים אלה הראו בעיקר את התוצאות הסופיות ואת הביטויים של HRS על התחבורה nucleocytoplasmic, אבל הם לא מראים הפרעה nucleocytoplasmic בזמן אמת. כתוצאה מכך, רק מחסור חמור nucleocytoplasmic התחבורה הוערך 11 , 17 , 18 . פרוטוקול זה מתאר חדש וישAssay רגיש להעריך להעריך לכמת nucleocytoplasmic תפקוד לקוי בזמן אמת. שיעור היבוא של NLS-NES-GFP חלבון (מעבורת-GFP) ניתן לכמת בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. זה נעשה באמצעות מעכב exportin, כפי שתואר קודם לכן 18 , ובכך מאפשר המעבורת- GFP רק כדי להזין את הגרעין. באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט תוכנה לכימות שינויי פלורסנט בזמן אמת, ניתן לכמת שינויים הדרגתיים בעוצמת הקרינה של המעבורת- GFP, הממוקם בגרעין. כתוצאה מכך, עקומת הרוויה Michaelis-Menten כמו של ציר הקרינה אל הזמן, המייצג את כמות המעבורת הגרעינית- GFP בכל זמן נתון, ניתן לבצע. באמצעות שיעור ליניארי הראשוני של הקימורים, ניתן ליצור מדרון, אשר מייצג את שיעור הכניסה לגרעין לפני הרוויה הקרינה. כדי לאמת את assay, לתרגםD C9orf72 dipeptide חוזר, פולי (GR) ו פולי (יחסי ציבור), אשר דווחו בעבר כדי לשבש את התחבורה nucleocytoplasmic, שימשו 5 , 7 , 8 , 10 , 12 . באמצעות assay זה, ירידה של 50% בשיעור היבוא הגרעיני נצפתה בהשוואה לשליטה. באמצעות מערכת זו, שינויים דקה התחבורה nucleocytoplasmic ניתן לבדוק. יתר על כן, היכולת של גורמים שונים כדי להציל פגם תחבורה nucleocytoplasmic ניתן לקבוע.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34)</td>
			<td>tebu-bio</td>
			<td>CLU140-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 4.5g/L L-glucose</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-055-1A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS European Grade</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-007-1A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SL 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3111</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass 12mm dia. thick 0.13-0.17mm</td>
			<td>Bar Naor LTD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R0531">TurboFect Transfection Reagent</a></td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R0531">R0531</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 100 inverted microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAGING WORKBENCH 2&#160;</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptomycin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2913</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>02-023-1A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer motor/control/chuck/90-degree clamp</td>
			<td>Glas-Col</td>
			<td>099C K5424CE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002455</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assay to measure nucleocytoplasmic transport in real time within motor neuron-like nsc-34 cells

התחבורה Nucleocytoplasmic מתייחס יבוא ויצוא של מולקולות גדולות מן הגרעין התא. לאחרונה, מספר מחקרים הראו קשר בין טרשת לרוחב האמיטרופית (ALS) לבין ליקויים במסלול nucleocytoplasmic. ALS היא מחלה נוירודגנרטיבית המשפיעה על נוירונים מוטוריים וכתוצאה מכך שיתוק ובסופו של דבר למוות, בתוך 2-5 שנים בממוצע. רוב המקרים של ALS הם ספורדיים, ללא כל קישור גנטי לכאורה, אבל 10% יורשים באופן דומיננטי. לאחרונה, hexanucleotide הרחבות חוזרות (HREs) ב chromosome 9 פתוח מסגרת הקריאה 72 (C9orf72) הגן זוהו כגורם גנטי של ALS ו דמנציה פרונטוטמפוראל (FTD). חשוב לציין, קבוצות שונות הציעו לאחרונה כי מוטציות אלה משפיעות על התחבורה nucleocytoplasmic. מחקרים אלה הראו בעיקר את התוצאה הסופית ואת הביטויים שנגרמו על ידי HRS על התחבורה nucleocytoplasmic, אבל הם לא מראים תפקוד התחבורה הגרעינית בזמן אמת. כתוצאה מכך, רק מחסור חמור nucleocytoplasmic התחבורה ניתן לקבוע, בעיקר בשל overexpression גבוה או הכנסת חלבון אקסוגני. פרוטוקול זה מתאר assay חדש ורגיש מאוד להעריך לכמת תפקוד לקוי nucleocytoplasmic בזמן אמת. שיעור היבוא של NLS-NES-GFP חלבון (מעבורת-GFP) ניתן לכמת בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. זה מבוצע באמצעות מעכב exportin, ובכך מאפשר המעבורת GFP רק כדי להזין את הגרעין. כדי לאמת את assay, C9orf72 HRE מתורגם חוזר dipeptide, פולי (GR) ו פולי (PR), אשר הוכחו בעבר לשבש את התחבורה nucleocytoplasmic, שימשו. באמצעות assay המתואר, ירידה של 50% בשיעור היבוא הגרעיני נצפתה בהשוואה לשליטה. באמצעות מערכת זו, שינויים זעירים בתחבורה nucleocytoplasmic ניתן לבחון את היכולת של גורמים שונים כדי להציל (אפילו באופן חלקי) nucleocytoplasmic trפגם ansport ניתן לקבוע.

באמצעות הנוהל המוצג כאן, נוירון כמו מנוע NSC-34 תאים היו transfected עם NLS-NES-GFP (מעבורת- GFP) חלבון. חלבון זה, אשר NLS ו- NES רצפים האות ( איור 1 ), יכול מעבורת בין הגרעין לבין הציטופלזמה. Generic GFP יכול להיכנס או לצאת הגרעין בהעדר כל תג לוקליזציה רק ​​על ידי דיפוזיה ולכן מופץ באופן שווה בין הגרעין לבין הציטופלזמה ( איור 2 א ). לעומת זאת, המעבורת- GFP חלבון נמצא בעיקר בציטופלסמה בשל האות NES ו- NLS המשפיעים על הפיזור שלה ( איור 2 ב ). לכן, רק את תוספת של מעכב exportin leptomycin B (LMB), אשר מעכב את הייצוא חלבון, מאפשר הצטברות של המעבורת- GFP לגרעין ובסופו של דבר למדידת המעבורת- GFP היבוא שיעור ( איור 2 ג ). באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט וכך<html> Ftware לכמת שינויים ניאון בזמן אמת, שינויים הדרגתיים בעוצמת הקרינה הגרעינית של המעבורת- GFP ניתן לכמת. כתוצאה מכך, עקומת הרוויה Michaelis-Menten כמו של ציר הקרינה אל הזמן ( איור 3 ), המייצג את כמות המעבורת הגרעינית- GFP בכל זמן נתון, ניתן לייצר. באמצעות שיעור ליניארי הראשוני של הקימורים (כפי שצוין על ידי המעגל באיור 3 ), מדרון, אשר מייצג את שיעור הכניסה לגרעין לפני הרוויה הקרינה, ניתן ליצור. מספר מחקרים מראים כי חלבונים שונים C9orf72 הם רעילים מודלים תסיסנית melanogaster ו / או תאים בתרבית 6 , 11 . דיפפטיד חוזר (DPRs), פולי (PR) ו poly (GR), המיוצר מ HRs בגן C9orf72 מוטציה, נמצאו לגרום מתח גרעיני 8 ,<html> Lass = &quot;xref&quot;&gt; 19 , 20 ו היו מעורבים פגום nucleocytoplasmic התחבורה, מה שהופך אותם מופיעים מזיקים במיוחד. כדי לאמת את התועלת של assay המתואר, מנוע נוירון כמו NSC-34 תאים היו transfected עם אלה שני פלסמידים DPR, פולי (PR) ו poly (GR). מאז פולי (PR) ו פולי (GR) DPRs הם מצומדות כדי GFP גם כן, חשוב היה לאמת כי DPRs לא הושפעו על ידי leptomycin-B, כמו גם, אשר יביא תוצאה חיובית שקר. הביטוי הפוליטי (PR) נצפה בגרעין לחלוטין כתכלילים; ולכן, זה לא יכול לתת איתות חיובי חיובי לייבא גרעיני ( איור 4 א ). פולי (GR) ביטוי, לעומת זאת, נצפתה הומוגנית cytosol וגם תכלילים בגרעין ( איור 4 ב ). כאשר transfecting NSC-34 תאים עם פולי (GR) בלבד והוסיף leptomycin-B, לא תנועה מעבורת של פולי לידי ביטוי (GR) נצפתה ( איור 5 ). &quot;Jove_content&quot; עבור: לשמור יחד.בעוד דף = &quot;1&quot;&gt; על ידי ניתוח שיעור התחבורה nucleocytoplasmic של המעבורת- GFP, NSC-34 תאים נמצאו שיתוף להביע או פולי (PR) או פולי (GR) DPRs , מראה ירידה בשיעור היבוא הגרעיני של כ 50% לעומת transfected תאים עם פלסמיד ריק כמו שליטה ( איור 5 ). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55676/55676fig1.jpg" /> איור 1: סכמטי של NLS-NES-GFP (מעבורת-GFP) לבנות. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55676/55676fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55676/55676fig2.jpg" /> איור 2: Leptomycin B מעכב את הייצוא של המעבורת- GFP מן הגרעינים של NSC-34 תאים. תמונות נציג של NSC-34 תאים expRessing גנרי כללי ( A ) או מעבורת-GFP חלבון לפני ( ב ) ו 20 דקות לאחר תוספת של 10 ng / מ&quot;ל ​​Leptomycin B (LMB) ( C ). בעקבות LMB בנוסף, המעבורת- GFP יבוא לתוך הגרעין, אבל הייצוא בחזרה הציטופלסמה נחסם. לפיכך, המעבורת- GFP מצטבר הגרעינים. סולם בר = 15 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55676/55676fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55676/55676fig3.jpg" /> איור 3: מייקל, מנטן כמו העלילה מראה עלייה הקרינה הגרעינית. נציג מייקל, מנטן, כמו עקומות המתארים עלייה הקרינה הגרעינית של שתי קבוצות, מושפע ולא מושפע תאים תעבורה nucleocytoplasmic, בתוך 25 דקות. 5 דקות הראשונית להראות הבדל גבוה בשיעור הגידול, שהוא דהמקומט לאורך זמן. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55676/55676fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55676/55676fig4.jpg" /> איור 4: C9orf72 DPRs פולי (PR) ו poly (GR) ביטוי ב NSC-34 תאים. תמונות נציג של NSC-34 תאים transfected עם D9s C9orf72, פולי (GR) ( A ) ו poly (PR) ( B ). פולי (GR) באה לידי ביטוי גרעיני של התאים, אבל הוא מופץ גם הומוגנית cytosol. פולי (PR) מתבטאת בעיקר בגרעינים. סולם בר = 30 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55676/55676fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/55676/55676fig5.jpg" /><br/&gt; איור 5: D9s C9orf72, פולי (PR) ו poly (GR), לעכב את שיעור היבוא הגרעיני בתאי NSC-34. מנוע נוירון כמו NSC-34 תאים היו שיתוף transfected עם המעבורת- GFP, יחד עם פלסמיד ריק, פולי (PR) או פולי (GR). שיעור היבוא הגרעיני הוגדר כשיפוע של השיעור הליניארי הראשוני של העקום ב- V max . שיעור ההובלה המתקבל עם הפלסמיד הריק הוגדר כ- 100%. Co-transfection עם פולי (PR) ו poly (GR) מעכב את שיעור ההובלה של כ 50% לעומת שליטה. ניתוח כמותי בוצע על שלושה עד חמישה ניסויים עצמאיים באמצעות ANOVA דרך אחת. **** p &lt;0.0001; *** p &lt;0.001. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55676/55676fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells at JoVE.com

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

פרוטוקול זה מתאר שיטה רגיש למדוד את קצב ההעברה nucleocytoplasmic בתוך נוירון כמו NSC-34 תאים תאים על ידי כימות השינוי בזמן אמת ביבוא גרעיני של חלבון NLS-NES-GFP.

Assay למדוד Nucleocytoplasmic התחבורה בזמן אמת בתוך מוטורי נוירון כמו NSC-34 תאים

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

assay-to-measure-nucleocytoplasmic-transport-real-time-within-motor

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.6K Views.  Ben-Gurion University of the Negev.  פרוטוקול זה מתאר שיטה רגיש למדוד את קצב ההעברה nucleocytoplasmic בתוך נוירון כמו NSC-34 תאים תאים על ידי כימות השינוי בזמן אמת ביבוא גרעיני של חלבון NLS-NES-GFP. 

Video: Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

זמן לשגות הדמיה חיה של Related Clonally ובתאים עצבית של פיתוח דג הזברה forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

חיתוך רוחב עצב מוטורי וזמן לשגות הדמיה של התנהגויות תא גלייה בדג הזברה לחיות

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Using Informational Connectivity to Measure the Synchronous Emergence of fMRI Multi-voxel Information Across Time

It is now appreciated that condition-relevant information can be present within distributed patterns of functional magnetic resonance imaging (fMRI) brain activity, even for conditions with similar levels of univariate activation. Multi-voxel pattern (MVP) analysis has been used to decode this information with great success. FMRI investigators also often seek to understand how brain regions interact in interconnected networks, and use functional connectivity (FC) to identify regions that have correlated responses over time. Just as univariate analyses can be insensitive to information in MVPs, FC may not fully characterize the brain networks that process conditions with characteristic MVP signatures. The method described here, informational connectivity (IC), can identify regions with correlated changes in MVP-discriminability across time, revealing connectivity that is not accessible to FC. The method can be exploratory, using searchlights to identify seed-connected areas, or planned, between pre-selected regions-of-interest. The results can elucidate networks of regions that process MVP-related conditions, can breakdown MVPA searchlight maps into separate networks, or can be compared across tasks and patient groups.

Informational connectivity measures the correspondence between time courses of multi-voxel information across different brain regions. Multi-voxel pattern discriminability time series are extracted from regions and compared, revealing networks that are not identified in a typical functional connectivity approach.

באמצעות הסברה קישוריות למדוד את צמיחת סינכרוני של מידע Multi-voxel fMRI לאורך זמן

It is now appreciated that condition-relevant information can be present within distributed patterns of functional magnetic resonance imaging (fMRI) brain ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are increasingly viewed as an early feature of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD) and Huntington&#8217;s disease (HD). As yet unclear is the mechanism(s) by which axonal injury is induced. We reported the development of a novel technique to produce biologically active, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) that can be used to trace axonal transport of BDNF. Quantum dot-labeled BDNF (QD-BDNF) was produced by conjugating quantum dot 655 to mBtBDNF. A microfluidic device was used to isolate axons from neuron cell bodies. Addition of QD-BDNF to the axonal compartment allowed live imaging of BDNF transport in axons. We demonstrated that QD-BDNF moved essentially exclusively retrogradely, with very few pauses, at a moving velocity of around 1.06 &#956;m/sec. This system can be used to investigate mechanisms of disrupted axonal function in AD or HD, as well as other degenerative disorders.

Axonal transport of BDNF, a neurotrophic factor, is critical for the survival and function of several neuronal populations. Some degenerative disorders are marked by disruption of axonal structure and function. We demonstrated the techniques used to examine live trafficking of QD-BDNF in microfluidic chambers using primary neurons.

הדמיה של axonal תחבורה של Quantum בזמן אמת Dot-כותרת BDNF בנוירונים העיקרי

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where the stimulus applied depends in real-time on the response of the system. Recent applications range from the implementation of virtual reality systems for studying motor responses both in mice1 and in zebrafish2, to control of seizures following cortical stroke using optogenetics3. A key advantage of closed-loop techniques resides in the capability of probing higher dimensional properties that are not directly accessible or that depend on multiple variables, such as neuronal excitability4 and reliability, while at the same time maximizing the experimental throughput. In this contribution and in the context of cellular electrophysiology, we describe how to apply a variety of closed-loop protocols to the study of the response properties of pyramidal cortical neurons, recorded intracellularly with the patch clamp technique in acute brain slices from the somatosensory cortex of juvenile rats. As no commercially available or open source software provides all the features required for efficiently performing the experiments described here, a new software toolbox called LCG5 was developed, whose modular structure maximizes reuse of computer code and facilitates the implementation of novel experimental paradigms. Stimulation waveforms are specified using a compact meta-description and full experimental protocols are described in text-based configuration files. Additionally, LCG has a command-line interface that is suited for repetition of trials and automation of experimental protocols.

Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board.

אלקטרופיזיולוגיה בזמן אמת: שימוש בפרוטוקולי לולאה סגורה לDynamics עצבי בדיקה ומעבר

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where ...

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the extracellular space (ECS) of the living brain. The ECS surrounds all brain cells and contains both interstitial fluid and extracellular matrix. The transport of many substances required for brain activity, including neurotransmitters, hormones, and nutrients, occurs by diffusion through the ECS. Changes in the volume and geometry of this space occur during normal brain processes, like sleep, and pathological conditions, like ischemia. However, the structure and regulation of brain ECS, particularly in diseased states, remains largely unexplored. The RTI method measures two physical parameters of living brain: volume fraction and tortuosity. Volume fraction is the proportion of tissue volume occupied by ECS. Tortuosity is a measure of the relative hindrance a substance encounters when diffusing through a brain region as compared to a medium with no obstructions. In RTI, an inert molecule is pulsed from a source microelectrode into the brain ECS. As molecules diffuse away from this source, the changing concentration of the ion is measured over time using an ion-selective microelectrode positioned roughly 100 &#181;m away. From the resulting diffusion curve, both volume fraction and tortuosity can be calculated. This technique has been used in brain slices from multiple species (including humans) and in vivo to study acute and chronic changes to ECS. Unlike other methods, RTI can be used to examine both reversible and irreversible changes to the brain ECS in real time.

This protocol describes real-time iontophoresis, a method that measures physical parameters of the extracellular space (ECS) of living brains. The diffusion of an inert molecule released into the ECS is used to calculate the ECS volume fraction and tortuosity. It is ideal for studying acute reversible changes to brain ECS.

בזמן אמת Iontophoresis עם Tetramethylammonium כדי לכמת את נפח השבר ואת הצרות של המוח תאיים שטח

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. To efficiently and accurately deorphanize ORs, we combine the use of a heterologous cell line to express mammalian ORs and a genetically modified biosensor plasmid to measure cAMP production downstream of OR activation in real time. This assay can be used to screen odorants against ORs and vice versa. Positive odorant-receptor interactions from the screens can be subsequently confirmed by testing against various odor concentrations, generating concentration-response curves. Here we used this method to perform a high-throughput screening of an odorous compound against a human OR library expressed in Hana3A cells and confirmed that the positively-responding receptor is the cognate receptor for the compound of interest. We found this high-throughput detection method to be efficient and reliable in assessing OR activation and our data provide an example of its potential use in OR functional studies.

Characterizing the function of odorant receptors serves an indispensable part in the deorphanization process. We describe a method to measure the activation of odorant receptors in real time using a cAMP assay.

לחיות תאים מדידה של Odorant קולטן הפעלה באמצעות Assay המחנה בזמן אמת

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc superoxide dismutase 1 (SOD1). The structural instability of SOD1 and the detection of SOD1-positive inclusions in familial-ALS patients supports a potential causal role for misfolded and/or aggregated SOD1 in ALS pathology. In this study, we describe the development of a cell-based assay designed to quantify the dynamics of SOD1 aggregation in living cells by high content screening approaches. Using lentiviral vectors, we generated stable cell lines expressing wild-type and mutant A4V SOD1 tagged with yellow fluorescent protein and found that both proteins were expressed in the cytosol without any sign of aggregation. Interestingly, only SOD1 A4V stably expressed in HEK-293, but not in U2OS or SH-SY5Y cell lines, formed aggregates upon proteasome inhibitor treatment. We show that it is possible to quantify aggregation based on dose-response analysis of various proteasome inhibitors, and to track aggregate-formation kinetics by time-lapse microscopy. Our approach introduces the possibility of quantifying the effect of ALS mutations on the role of SOD1 in aggregate formation as well as screening for small molecules that prevent SOD1 A4V aggregation.

We describe a method to quantify the aggregation of misfolded proteins. Our protocol details lentiviral induced stable cell line generation, automated confocal imaging, and image analysis of protein aggregates. As an illustrative application, we studied the effect of small molecules in promoting SOD1 aggregation in a time- and dose-dependent manner.

פיתוח assay על כימות תוכן גבוהה של היווצרות צבירה של מוטציה בחלבון Sod1 בתאים חיים

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal growth, development, and survival. We describe a detailed method for the use of microfluidic chambers (MFCs) for tracking axonal transport of fluorescently labeled organelles in MN axons. This method is rapid, relatively inexpensive, and allows for the monitoring of intracellular cues in space and time. We describe a step by step protocol for: 1) Fabrication of polydimethylsiloxane (PDMS) MFCs; 2) Plating of ventral spinal cord explants and MN dissociated culture in MFCs; 3) Labeling of mitochondria and acidic compartments followed by live confocal imagining; 4) Manual and semiautomated axonal transport analysis. Lastly, we demonstrate a difference in the transport of mitochondria and acidic compartments of HB9::GFP ventral spinal cord explant axons as a proof of the system validity. Altogether, this protocol provides an efficient tool for studying the axonal transport of various axonal components, as well as a simplified manual for MFC usage to help discover spatial experimental possibilities.

Axonal transport is a crucial mechanism for motor neuron health. In this protocol we provide a detailed method for tracking the axonal transport of acidic compartments and mitochondria in motor neuron axons using microfluidic chambers.

הובלה אקונלית של אורגלות בתרביות תאי עצב מוטוריים באמצעות מערכת צ'יימברס מיקרופלואידיג

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Real-Time fMRI Brain Mapping in Animals

Dynamic fMRI responses vary largely according to the physiological conditions of animals either under anesthesia or in awake states. We developed a real-time fMRI platform to guide experimenters to monitor fMRI responses instantaneously during acquisition, which can be used to modify the physiology of animals to achieve desired hemodynamic responses in animal brains. The real-time fMRI set-up is based on a 14.1T preclinical MRI system, enabling the real-time mapping of dynamic fMRI responses in the primary forepaw somatosensory cortex (FP-S1) of anesthetized rats. Instead of a retrospective analysis to investigate confounding sources leading to the variability of fMRI signals, the real-time fMRI platform provides a more effective scheme to identify dynamic fMRI responses using customized macro-functions and a common neuroimage analysis software in the MRI system. Also, it provides immediate troubleshooting feasibility and a real-time biofeedback stimulation paradigm for brain functional studies in animals.

Animal brain functional mapping can benefit from the real-time functional magnetic resonance imaging (fMRI) experimental set-up. Using the latest software implemented in the animal MRI system, we established a real-time monitoring platform for small animal fMRI.

מיפוי מוח fMRI בזמן אמת בבעלי חיים

Dynamic fMRI responses vary largely according to the physiological conditions of animals either under anesthesia or in awake states. We developed a ...