הפרוטוקול מציע שיטה פשוטה לטיהור מנועים מולקולריים פעילים באמצעות מערכת Sf9 baculovirus. הוא גם מפרט תנועתיות של מולקולה בודדת ומבחני גלישה רב-מנועיים כדי לחקור את מנגנון הוויסות של חלבונים מוטוריים. כל הביטוי הווקטורי המסורתי Sf9 baculovirus ביטוי וטיהור זיקה חד-שלבי, יובילו חלבון מוטורי טהור ופעיל לחקור את הפרטים המכניסטיים של קינסינים סופר-מעבדים במולקולה בודדת ובמערכות רב-מוטוריות.
בנוסף למנועי קינסין, ניתן ליישם את הפרוטוקול כדי לחקור תכונות ביוכימיות וביופיזיות של חלבונים אחרים מבוססי ציטוסקטליים כגון דיונין ומיוזין. הפרוטוקול מפורט וקל למעקב. חלק מההצעות הן לטפל בתאי Sf9 בזהירות מכיוון שהם מועדים לזיהום, ולעקוב אחר הערות המופיעות בפרוטוקול.
הדגמה חזותית היא יעילה ביותר, קלה לביצוע ולהבנת השלבים הקריטיים, במיוחד עבור אלה שמעולם לא ביצעו מבחנים אלה. מי שידגימו את הנוהל יהיו פושפנג'אלי סופינה ודיפשווארי שוואלה, דוקטורנטים שעובדים איתי ועם פראדיפ נאיק. כדי להתחיל, זרעו את התאים בצלחת של 35 מיליליטר, בצפיפות של 4.5 כפול 10 עד לתאים החמישים למיליליטר.
לאחר 24 שעות, ערבבו מיקרוגרם אחד של דנ"א בקמיד ו-100 מיקרוליטרים של מדיה של גרייס שלא הוכנסה לשפופרת. ערבבו שישה מיקרוליטרים של ריאגנט טרנספקציה בצינור אחר עם 100 מיקרוליטרים של מדיה של גרייס שלא הוכרעה. בזהירות להעביר את התוכן של הצינור הראשון לתוך הצינור השני.
מערבבים אותם ודוגרים על התערובת במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. הוסיפו לתערובת 0.8 מיליליטר של מדיה של גרייס שלא הוכנסה לתערובת. ערבב ושאף את מדיית Sf900 SFM מהתאים.
מוסיפים את מדיית ההעברה המוכנה מבחינת טיפה על החלק העליון של התאים ודוגרים את הצלחת במשך שש שעות. לאחר מכן להסיר בזהירות את תערובת transfection. מוסיפים שני מיליליטר של מדיית SF900 SFM ומדגרים עוד יותר ב-28 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
לאחר מכן, בדוק את ביטוי החלבון המוטורי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. קוצרים את המדיה עם תאים נגועים, ומסתובבים במשך חמש דקות, ב 500 G.לאסוף את supernatant ולהקפיא את aliquots. הוסף 10 מיליליטר של מדיה SF900 SFM עם תאים ומיליליטר אחד של מלאי וירוס P-zero, בבקבוק סטרילי, 100 מיליליטר, חרוטי.
דגירה ב-28 מעלות צלזיוס עם רעידות קבועות ב-90 סל"ד. לאחר 72 שעות, לסובב את התאים בצינור חרוטי סטרילי של 15 מיליליטר ב 500 גרם במשך חמש דקות ולאסוף את supernatant. לביטוי חלבונים בקנה מידה גדול, הדביקו 30 מיליליטר של תרבית התרחיף במיליליטר אחד של נגיף מלאי P1.
72 שעות לאחר ההדבקה, בדקו את התאים לביטוי חלבונים ואספו את התאים בצינורות חרוטיים סטריליים, 50 מיליליטר. לאחר הסיבוב, להשליך את supernatant, ולאסוף את כדור התא. כדי ללכלך את התאים, הוסף שלושה מיליליטר של חיץ ליזיס קר כקרח לכדור התא.
סובב את התא lysate ב 150, 000 גרם במשך 30 דקות, בארבע מעלות צלזיוס. אספו את הסופר-נטנט וערבבו אותו עם 40 מיקרוליטרים של שרף זיקה 50% אנטי-דגל M2. דוגרים את התערובת בארבע מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות עם רעידות מקצה לקצה.
עכשיו גלולה את שרף הדגל על ידי סיבוב ב 500 G במשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס. שטפו את כדור השרף FLAG שלוש פעמים עם חיץ שטיפה קר כקרח. ואחרי הכביסה השלישית, מסננים בזהירות את חיץ הכביסה.
לאחר מכן, הוסיפו 70 מיקרוליטרים של מאגר שטיפה המכיל 100 מיקרוגרם לפפטיד FLAG מיליליטר, לכדור שרף, ודגרו למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס, כפי שהוכח קודם לכן. לאחר הסיבוב, אספו את הסופרנטנט המכיל חלבון מטוהר לתוך צינור טרי. הכינו תערובת פילמור כמתואר בכתב היד, והוסיפו 10 מיקרוליטרים של טובולין לתערובת הפילמור.
מעבירים את הצינור לגוש חום, מחומם מראש ב 37 מעלות צלזיוס, ודוגרים במשך 30 דקות. לאחר הכנת חיץ ייצוב המיקרוטובול, חממו אותו והוסיפו אותו למיקרוטובולים הפולימריים. לאחר הכנת תא זרימת התנועתיות, מזרימים 30 מיקרוליטרים של תמיסת מיקרוטובול מדולל דרך התא.
לאחר 30 דקות, לזרום 40 עד 50 microliters של חוצץ חוסם לדגור אותו. הכינו תערובת תנועתיות והוסיפו לה מיקרוליטר אחד של המנוע המטוהר. מערבבים היטב ומזרימים את התמיסה לתוך תא התנועתיות.
אוטם את שני הקצוות של תא התנועתיות ואת התמונה תחת תאורת TIRF. התמקדו במנועים המתויגים של mCitirine הבודדים, הנעים באופן תהליכי. מערבבים רודמין עם טובולין ללא תווית ביחס של 1 עד 10.
לאחר 30 דקות של פילמור, הוסיפו בעדינות 30 מיקרוליטרים של חיץ ייצוב מיקרוטובול שחומם מראש ודגרו עוד, במשך חמש דקות, בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הגזימו את המיקרוטובולים על ידי פיפטינג עם קצה ההעמסה הנימי. לאחר הכנת תא זרימת התנועתיות, יש להזרים 50 מיקרוליטרים של ננו-גופי GFP מטוהרים מדגם Sf9 ולדגור במשך 30 דקות.
חסום את משטח ההחלקה של הכיסוי על ידי הזרמת 50 מיקרוליטרים של מאגר בלוקים. הכינו 50 מיקרוליטרים של תערובת המנוע. הזרימו אותו לתוך החדר לאחר ערבוב עדין של התמיסה ודגירה במשך 30 דקות.
לשטוף את החדר, פעמיים, עם 50 microliters של P12-קזאין. מכינים את תערובת בדיקת ההחלקה ומערבבים אותה בעדינות, לפני שמזרימים אותה לתא התנועתיות. אטמו את קצות תא התנועתיות, ותמונת מיקרוטובול גולשת תחת תאורת TIRF.
לאחר 48 שעות של טרנספקציה, התאים הלא ממומשים נראים קטנים, עגולים ומחוברים היטב. עם זאת, התאים שעברו טרנספקציה המבטאים חלבון, היו מחוברים באופן רופף לפני השטח והראו קוטר תא מוגדל. לאחר 72 שעות, יותר מ-90% מתאי Sf9 ביטאו תיוגה פלואורסצנטית, מנוע קינזין-3 KIF1A, והתאים היו קשורים באופן רופף לפני השטח.
החלבון המוטורי Kinesin-3 טוהר מתאי Sf9 שעברו טרנספקציה. הקימוגרף מתאר הליכה מוטורית של קינסין-3 באופן תהליכי, לאורך פני השטח של המיקרוטובול. אירועי תנועתיות הראו מהירות ואורך ריצה ממוצעים של כ-2.44 מיקרומטר לשנייה ו-10.79 מיקרומטר בהתאמה.
הקימוגרף מציין גלישה חלקה של מיקרוטובול על ידי מנועי קינזין-3, עם מהירות ממוצעת של כ-1.37 מיקרומטר לשנייה. הדבר החשוב ביותר הוא להוסיף את חיץ הייצוב מבלי להפריע לתערובת המיקרוטובול ולא לגזוז את המיקרוטובול. הפרוטוקול יהיה שימושי עבור יישומים אחרים, כגון מדידות ATPase, ניתוח ביופיזיקלי, מנגנונים, מבחני שחזור במבחנה וכו '.
באמצעות מנועי טיהור sf9, הוכחנו לאחרונה שמנועי קינזין-3 הם מהירים וסופר-מעבדים. באופן מעניין, מנועים אלה מציגים שיעורי תחלופה גבוהים של ATP בהשוואה למנוע המאופיין היטב, Kinesin-1.
