פרוטוקול זה הוא מיזוג של טכניקות שונות שיאפשרו לחוקרים לשרטט את תפקיד הגן המועמד בביולוגיה של המלנוציטים. זוהי גישה הוליסטית להשגת היסק לוגי. על ידי שילוב שיטות שונות, ניתן להימנע מגורמים מבלבלים וזה יכול לעזור לחוקרים להשיג תוצאה משמעותית.
כדי להתחיל את הניתוח, לשתק את 48 עוברי HPF עם 0.016% tricaine. הרכיבו את העוברים באמצעות כמה מיליליטרים של 1.5% עד 2% מתיל צלולוז בצלחת פטרי. בחר את העוברים עם פיפטה פסטר ומניחים אותם במתיל צלולוז כדי להגביל את התנועה במהלך ההדמיה.
להדמיה רוחבית או גבית אופטימלית, התאימו את מיקומם בהגדלה של יותר מפי 5. מניחים את צלחת הפטרי מתחת למיקרוסקופ. באמצעות מניפולטור, להתאים את הדג כך שכל חמשת הפסים העובריים מלנוציטים נראים בו זמנית.
באמצעות תוכנת הרכישה, ללכוד את התמונות. אם הדג מתעורר, הכניסו אותו למי טריקאין עד שהוא מתייצב. באמצעות הכלי הפתוח בתוכנת ImageJ, פתח את התמונה לכמת.
בחרו בכלי צורה חופשית כדי לשרטט את האזור לניתוח. בחר באפשרות הגדר מידות, לחץ על הערך האפור הממוצע ולאחר מכן על האזור. כדי לחשב את הערך האפור הממוצע עבור האזור שנבחר, לחץ על M או עבור לנתח ולבחור מדידה.
בהתבסס על שלב העניין, להעביר את העוברים לצלחת פטרי המכילה 0.6 מיליגרם למיליליטר Pronase. בעזרת פיפטה של פסטר, מעבירים את העוברים המפורקים לצלחת פטרי המכילה מי עובר רגילים לאחר חמש עד 10 דקות. בעזרת פיפטת פסטר מזכוכית, אוספים ומעבירים כ-100 עוברים לצינור מיקרוצנטריפוגה של שני מיליליטר.
השליכו את המדיום והוסיפו 200 מיקרוליטר של תמיסת רינגרס חלמון קרה כקרח. מניחים את הצינור על קרח ומערבבים את התוכן בערך 20 פעמים עם פיפטה כדי להמיס את העול. צנטריפוגו את הצינורות ב-100 גרם למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס פעמיים, והשליכו את הסופרנטנט.
מעבירים את העוברים החלמונים באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד בצלוחית פטרי המכילה 10 מיליליטר של תמיסת טריפסין. מערבבים את התמיסה פעם או פעמיים באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד כדי להקטין את הצבירה. מעבירים את התרחיף הטריפסיני דרך מסננת של 70 מיקרומטר המונחת על צינור חרוטי של 50 מיליליטר כדי לאסוף תרחיף תא בודד.
שטפו את צלחות הפטרי עם ההשעיה הטריפסינית כדי להסיר את התאים המודבקים מפני השטח. לספירת התאים המסומנים באופן פלואורסצנטי באמצעות ציטומטר זרימה, לאחר יצירת תיקיית ניסוי חדשה, ציירו תרשים פיזור קדימה לעומת צד. לעשות היסטוגרמה עבור עוצמת isothiocyanate fluorescein.
טען תחילה את תאי הסוג הפראי כדי להגדיר את שערי הפיזור קדימה וצדדית ואת סף FITC. לאחר מכן, טען את התאים שבודדו מעוברי קו FTYRP GFP טרנסגניים כדי לספור את המלנוציטים. הרכיבו את העוברים ב-1.5% עד 2% מתיל צלולוז בצלחת פטרי.
מניחים אותו מתחת למיקרוסקופ ומתאימים אותו בכיוון הרצוי באמצעות קצה פיפטה. באמצעות תוכנת הרכישה, לרכוש את התמונות. עבור עוברים פחות מ 24 HPF, באמצעות הגדלה פי 10, ללכוד את התמונה כולה, ואילו עבור עוברים מעל 24 HPF, לרכוש שדות סריקה מרובים ולאחר מכן להרכיב אותם.
לאחר ביצוע הבדיקה, ההדמיה של ברייטפילד לאחר 48 שעות חשפה את נוכחותם של כל חמשת פסי המלנופור הפיגמנטיים. בשלב 48 HPF חושב מספר המלנופורים הצדיים ונמצא כי וריאנט ההיסטון h2afv morphants הדגים מספר מופחת של מלנופורים בהשוואה לקבוצת הביקורת. הערך האפור הממוצע נמדד עבור מורפנטים CA14 ו-h2afv, מה שגילה כי הערכים היו גבוהים יותר עבור הווריאנטים מאשר מורפנטים של קבוצת הביקורת.
על ידי שימוש בשיטת ספיגה ספקטרופוטומטרית מבוססת נתרן הידרוקסידי, כומתה תכולת המלנין כאשר מורפנטים CA14 הראו פחות תוכן מאשר מורפנטים בקרה. הדמיה פלואורסצנטית בוצעה כדי להעריך שינוי מבוסס מורפולינו עבור שלבים שונים של התפתחות מלנופור דגי זברה. מספר המלנופורים במורפנטים CA14 ו-h2afv נותח באמצעות FACS.
נצפה כי מספר המלנופורים ב- CA14 נותר ללא שינוי, בעוד שהם הופחתו באופן משמעותי ב- h2afv בהשוואה למורפנט הביקורת. כמו כן חושבה עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת לאזור, מה שמראה כי מורפנטים h2afv מראים ירידה ניכרת בערך ביחס למורפנטי ביקורת. בעת התאמת הדג לפני ההדמיה, ודא שאתה יכול לדמיין את כל חמשת הפסים המלנופוריים.
אתה צריך להטות את הדג קצת כדי להבחין בין שני פסים לרוחב. לאחר ביסוס תפקידו של גן מועמד בהתפתחות מלנוציטים, אנו יכולים לחסל את הגן באופן ספציפי לרקמה באמצעות טכנולוגיית CRISPR. זו תהיה גישה ממוקדת יותר.
