מתודולוגיה זו משלבת שיפור של פרוטוקול הניקוי עם יכולת העין של חתך אופטי של טכנולוגיית Mesos PIM המאפשרת לנו לבצע שחזורים מזו סקופיים ברזולוציה מיקרומטרית. הוא מספק את האפשרות לצלם רקמות לב מסיביות או לבבות עכברים שלמים פתרון שלם בסריקה אחת מבלי לאבד את ארגון הרקמה התלת-ממדית המקורית. לאחר שהלב כבר משומר על ידי אבי העורקים הפרוקסימלי שנשטף בתמיסת טירו וקבוע ב 4% Paraform aldehyde ב 0.01 טוחנת PBS הוא מוכן להתחיל את פרוטוקול הסליקה.
לשטוף את הלב שלוש פעמים ב 0.01 PBS טוחנת בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחר שלב זה, הלב יכול להיות מאוחסן PBS ו 0.01% נתרן אזיד בארבע מעלות צלזיוס במשך מספר חודשים. לדגום את הלב ב 20 מיליליטר של תמיסת הידרוג'ל במצב רעידות ב 15 סל"ד במשך שלושה ימים בארבע מעלות צלזיוס.
ניתן להוריד את הגז בטמפרטורת החדר באמצעות מייבש משאבת ואקום, ומערכת צינורות המחברת את המייבש הן לרצועת המשאבה והן לצינור החנקן. הניחו את הדגימה במייבש ופתחו את הבקבוקון תוך שמירה על המכסה. סגרו את המייבש והוציאו את החמצן מהצינור על ידי פתיחת צינור החנקן.
הפעילו את משאבת הוואקום כדי להוציא את החמצן מהמייבש למשך 10 דקות. כבו את המשאבה ופתחו את ידית המייבש לצינור החנקן. לאחר מכן פתחו את ברז החנקן.
ברגע שהלחץ שווה ללחץ האטמוספרי פתחו בזהירות את המייבש וסגרו במהירות את הבקבוקון. שמור את הלב בתמיסת הידרוג'ל ללא גזים ב 37 מעלות צלזיוס במשך כשלוש שעות במנוחה. כאשר ההידרוג'ל הוא פולימרי כראוי ונראה ג'לטיני לחלוטין, בזהירות להסיר את הלב ממנו ומניחים אותו בתמיסת ניקוי בבקבוקון עם תמיסת ניקוי.
שנה את פתרון הסליקה בבקבוקון אחת לשלושה ימים כדי לזרז את הליך ההבהרה. ברגע שהלב נראה ברור לחלוטין להסיר אותו מן הבקבוקון ולשטוף אותו 50 מיליליטר של PBS מחומם במשך 24 שעות במצב רועד. יש לשטוף שוב ב-50 מיליליטר של PBS T אחד למשך 24 שעות במצב ניעור.
דגירה של הדגימה ב-0.01 מיליגרם למיליליטר נבט חיטה אגלוטינין אלקסה רצפה 633 בשלושה מיליליטר של X PBS T אחד במצב רעידות ב-50 סל"ד בטמפרטורת החדר במשך שבעה ימים. לאחר הדגירה בת שבעת הימים, יש לשטוף את הדגימה ב-50 מיליליטר של X PBS T אחד בטמפרטורת החדר בטלטול במשך 24 שעות. יש לדגום את הדגימה ב-4% PFA למשך 15 דקות ולאחר מכן לשטוף אותה שלוש פעמים ב-PBS טוחן 0.01 במשך חמש דקות כל אחת.
לדגום את הלב ברצף ב-20 וב-47% TDE ב-0.01 PBS טוחנת במשך שמונה שעות כל אחד. ולבסוף ב 68% TDE ב 0.01 PBS טוחנות כדי לספק את מקדם השבירה הנדרש של 1.46. ממלאים בעדינות כ-80% מקובט הקוורץ החיצוני במדיום מקדם השבירה.
ממלאים את קיובט הקוורץ הפנימי באותו מדיום מקדם שבירה. לטבול את הדגימה בתוך הקיווט הפנימי. הזיזו בעדינות את הדגימה לתחתית הקיובט באמצעות פינצטה דקה וסדרו את הלב עם ציר האורך שלו במקביל לציר הראשי של הקיובט כדי למזער את נתיב אור העירור על פני הרקמה במהלך הסריקה.
תקן בזהירות את התקע המותאם מעל הקיובט הפנימי באמצעות שני ברגים. הרכב את הדגימה לשלב המיקרוסקופ באמצעות מגנטים. תרגם את שלב הדגימה האנכי באופן ידני כדי לטבול את הקיובט הפנימי לתוך החיצוני.
הפעל את מקור האור העירור באורך גל של 638 ננומטר והגדר אותו בהספק נמוך בסדר גודל של שלושה מילי-וואט. הזז את הדגימה באמצעות המתרגם הממונע כדי להאיר צלחת פנימית של הרקמה. הפעל את תוכנת המצלמה החיה של HC image והגדר את הדק המצלמה למצב יריעת הדק בקצה החיצוני כדי להניע את הדק הרכישה של המצלמה על-ידי התוכנה המותאמת אישית השולטת בהגדרה כולה.
הפעל שמירה אוטומטית בתוכנת המצלמה והגדר את תיקיית הפלט שבה יש לשמור את התמונות. כוונן ידנית את מיקום הדגימה במישור X Y עם המתרגמים הליניאריים כדי להזיז את הדגימה למרכז שדה הראייה של חיישן המצלמה. הזז את הדגימה לאורך ציר Z באמצעות המתרגם הממונע הליניארי כדי לזהות גבולות לב לצורך שחזור טומוגרפי.
הגדל את עוצמת הלייזר לכ-20 מילי-וואט לפני תחילת ההדמיה. התחל את הרכישה הטומוגרפית על ידי לחיצה על כפתור התחל בלוח הלכידה של תוכנת ההדמיה, ובמקביל התחל להזיז את הדגימה לאורך ציר Z במהירות קבועה של שישה מיקרומטר לשנייה באמצעות המתרגם הממונע. השילוב של מתודולוגיית הבהירות עם TDE כמדיום מקדם שבירה אינו משנה באופן משמעותי את הנפח הסופי של המדגם ואינו מוביל לעיוות איזוטרופי של הדגימה.
אופטיקת העירור ייצרה יריעת אור עם מינימום פסולת של כשישה מיקרומטרים שהתפצלה עד 175 מיקרומטר בקצה שדה הראייה. הסנכרון של תריס הגלגול של המצלמה עם הסריקה הצירית של פסולת יריעת האור הבטיח לאסוף את אות הפליטה רק בחלק הדגימה הנרגש עם הפסולת של יריעת האור וכתוצאה מכך F W H M ממוצע של כ-6.7 מיקרומטר לאורך כל שדה הראייה. פונקציית התפשטות נקודת Z של המיקרוסקופ הוערכה גם על ידי שחזור טומוגרפי של הננוספרה הפלואורסצנטית ו-F W H M של 6.4 מיקרומטר הוערך על ידי ההתאמה.
הפוטנציאל של המערכת לפתור ממברנות תאיות בודדות בשלושה ממדים עם יחס אות לרעש מספיק באיבר כולו אושר גם הוא. הליך הפחתת הגזים הוא השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול. אם זה לא מבוצע כראוי הרקמה עלולה להיתקל בנזקים המציינים במהלך הדגירה בתמיסת ניקוי.
ניתן לשלב את הפרוטוקול המוצג עם פרוטוקול מרובה כתמים כדי להשיג שחזור איברים שלם המשלב מבנים ביולוגיים שונים וניתן ליישם אותו לחקר מודלים פתולוגיים.
