Diese Methodik kombiniert die Verbesserung des Clearing-Protokolls mit der Augenfähigkeit des optischen Schnitts der Mesos PIM-Technologie, so dass wir mesoskopische Rekonstruktionen mit mikrometrischer Auflösung durchführen können. Es bietet die Möglichkeit, massives Herzgewebe oder ganze Mausherzen in einem einzigen Scan abzubilden, ohne die ursprüngliche dreidimensionale Gewebeorganisation zu verlieren. Nachdem das Herz durch proximale Aorta in Tyrolösung gewaschen und in 4% Paraformaldehyd in 0,01 molar PBS fixiert wurde, ist es bereit, das Clearing-Protokoll zu starten.
Waschen Sie das Herz dreimal in 0,01 molaren PBS bei vier Grad Celsius für 15 Minuten. Nach diesem Schritt kann das Herz in PBS und 0,01% Natriumazid bei vier Grad Celsius für mehrere Monate gelagert werden. Inkubieren Sie das Herz in 20 Milliliter Hydrogellösung in Schüttelzustand bei 15 U/min für drei Tage bei vier Grad Celsius.
Entgasen Sie die Probe bei Raumtemperatur mit einem Trockner, einer Vakuumpumpe und einem Schlauchsystem, das den Trockner sowohl mit dem Pumpband als auch mit der Stickstoffleitung verbindet. Legen Sie die Probe in den Trockner und öffnen Sie die Durchstechflasche, wobei Sie die Kappe darauf halten. Schließen Sie den Trockner und entfernen Sie den Sauerstoff aus dem Rohr, indem Sie die Stickstoffleitung öffnen.
Schalten Sie die Vakuumpumpe ein, um den Sauerstoff für 10 Minuten aus dem Trockner zu entfernen. Schalten Sie die Pumpe aus und öffnen Sie den Knopf des Trockners zur Stickstoffleitung. Öffnen Sie dann den Stickstoffhahn.
Sobald der Druck dem atmosphärischen Druck entspricht, öffnen Sie den Trockner vorsichtig und schließen Sie die Durchstechflasche schnell. Halten Sie das Herz in der entgasten Hydrogellösung bei 37 Grad Celsius für etwa drei Stunden in Ruhe. Wenn das Hydrogel richtig polymerisiert ist und vollständig gallertartig erscheint, entfernen Sie vorsichtig das Herz davon und legen Sie es in eine klärende Lösung in die Durchstechflasche mit Reinigungslösung.
Wechseln Sie die Clearing-Lösung in der Durchstechflasche alle drei Tage, um den Klärungsprozess zu beschleunigen. Sobald das Herz vollständig geklärt erscheint, nehmen Sie es aus der Durchstechflasche und waschen Sie es in 50 Milliliter aufgewärmtem PBS für 24 Stunden im Schüttelzustand. Erneut in 50 Milliliter eines X PBS T für 24 Stunden im Schüttelzustand waschen.
Inkubieren Sie die Probe in 0,01 Milligramm pro Milliliter Weizenkeim-Aglutinin Alexa Boden 633 in drei Milliliter eines X PBS T in schüttelndem Zustand bei 50 U/min bei Raumtemperatur für sieben Tage. Nach der siebentägigen Inkubation waschen Sie die Probe in 50 Milliliter eines X PBS T bei Raumtemperatur unter Schütteln für 24 Stunden. Inkubieren Sie die Probe in 4% PFA für 15 Minuten und waschen Sie sie dann dreimal in 0,01 molaren PBS für jeweils fünf Minuten.
Inkubieren Sie das Herz nacheinander in 20 und 47% TDE in 0,01 molaren PBS für jeweils acht Stunden. Und schließlich bei 68% TDE in 0,01 molaren PBS, um den erforderlichen Brechungsindex von 1,46 zu liefern. Füllen Sie vorsichtig etwa 80% des äußeren Quarzquvets mit dem Brechungsindexmedium.
Füllen Sie den inneren Quarzquavet mit dem gleichen Brechungsindexmedium. Tauchen Sie die Probe in den inneren Quvet. Bewegen Sie die Probe vorsichtig mit einer dünnen Pinzette auf den Boden des Quvets und ordnen Sie das Herz mit seiner Längsachse parallel zur Hauptachse des Quvets an, um den Anregungslichtweg über das Gewebe während des Scannens zu minimieren.
Befestigen Sie den maßgeschneiderten Stecker vorsichtig mit zwei Schrauben über dem internen Quvet. Montieren Sie die Probe mit Magneten auf dem Mikroskoptisch. Übersetzen Sie den vertikalen Probentisch manuell, um den internen Quvet in den externen einzutauchen.
Schalten Sie die Anregungslichtquelle mit einer Wellenlänge von 638 Nanometern ein und stellen Sie sie auf niedrige Leistung in der Größenordnung von drei Milliwatt ein. Bewegen Sie die Probe mit dem motorisierten Übersetzer, um eine innere Platte des Gewebes zu beleuchten. Schalten Sie die HC Image Live-Kamerasoftware ein und stellen Sie den Kameraauslöser auf den externen Randauslöser-Lichtblattmodus ein, um den Erfassungsauslöser der Kamera durch die benutzerdefinierte Software zu steuern, die das gesamte Setup steuert.
Aktivieren Sie die automatische Speicherung in der Kamerasoftware und legen Sie den Ausgabeordner fest, in dem die Bilder gespeichert werden sollen. Passen Sie die Probenposition in der X-Y-Ebene manuell mit den linearen Übersetzern an, um die Probe in die Mitte des Sichtfelds des Kamerasensors zu bewegen. Bewegen Sie die Probe mit dem linearen motorisierten Übersetzer entlang der Z-Achse, um Herzgrenzen für die tomographische Rekonstruktion zu identifizieren.
Erhöhen Sie die Laserleistung auf ca. 20 Milliwatt, bevor Sie mit der Bildgebungssitzung beginnen. Starten Sie die tomographische Erfassung, indem Sie auf die Schaltfläche Start im Erfassungsbereich der Bildgebungssoftware klicken, und beginnen Sie gleichzeitig, die Probe mit der konstanten Geschwindigkeit von sechs Mikrometern pro Sekunde mit dem motorisierten Übersetzer entlang der Z-Achse zu bewegen. Die Kombination der Klarheitsmethodik mit TDE als Brechungsindexmedium verändert weder signifikant das Endvolumen der Probe noch führt sie zu einer isotropen Verformung der Probe.
Die Anregungsoptik erzeugte eine Lichtschicht mit einem minimalen Abfall von etwa sechs Mikrometern, die am Rand des Sichtfeldes bis zu 175 Mikrometer divergierte. Die Synchronisation des Kamera-Rolling-Shutters mit dem axialen Scan des Lichtblattabfalls stellte sicher, dass das Emissionssignal nur in dem Probenteil erfasst wurde, der mit dem Abfall des Lichtblattes angeregt wurde, was zu einem durchschnittlichen F W H M von etwa 6,7 Mikrometern über das gesamte Sichtfeld führte. Die Z-Punkt-Spreizungsfunktion des Mikroskops wurde ebenfalls durch eine tomographische Rekonstruktion der fluoreszierenden Nanokugel geschätzt und ein F W H M von 6,4 Mikrometern durch die Anpassung geschätzt.
Die Möglichkeit des Systems, einzellige Membranen dreidimensional mit einem ausreichenden Signal-Rausch-Verhältnis im gesamten Organ aufzulösen, wurde ebenfalls bestätigt. Das Entgasungsverfahren ist der kritischste Schritt des Protokolls. Wenn es nicht richtig durchgeführt wird, kann das Gewebe während der Inkubation in einer Reinigungslösung auf Schäden hinweisen.
Das vorgestellte Protokoll kann mit einem Multi-Färbeprotokoll kombiniert werden, um eine vollständige Organrekonstruktion zu erreichen, die verschiedene biologische Strukturen integriert, und kann zur Untersuchung pathologischer Modelle angewendet werden.
