מערכת GAL4-UAS הדו-צדדית היא כלי רב-תכליתי לניתוח גנטי תפקודי באנופלס גמביה באמצעות שינוי גנטי של ביטוי גנים באופן מבוקר spatiotemporal. המערכת הבינארית מאפשרת גמישות בגישות ניסיוניות לאפיון פנוטיפי של ביטוי טרנסג'ן גם אם נגרמות עלויות כושר חמורות. מערכת זו יכולה לשמש לאפיון פנוטיפי של גנים המעורבים בהתנגדות לחומרי הדברה, העברת פתוגן, או אלה שיש להם שימושים בשיטות בקרה גנטית.
פרייזר קולמן, טכנאי מחקר, יעזור להדגים הליך זה התחל על ידי איסוף גלמים באמצעות צינור פסטר פלסטיק שלושה מיליליטר עם הקצה חתוך על צלחת שטוחה ברורה המתאימה לשימוש עם מיקרוסקופ סטריאו. בזהירות להסיר את רוב המים סביב הגולם. הפעל את הנורה הפלואורסצנטית ואפשר לה להתחמם.
שקול את דפוסי spatiotemporal צבע של ביטוי ויחס של פנוטיפים שונים הצפויים בעת הקרנה עבור סמן פלואורסצנטי. בחר את המסנן הנדרש על סטריאוסקופ פלואורסצנטי ובדוק כי יש קרן צבעונית של אור גלוי כי הוא מכוון במרכז צלחת הבמה. תחת אור לבן, מרכז את הגולם בשדה הראייה ומביא אותם לפוקוס.
כבה את האור הלבן והשתמש במיקוד העדין כדי להביא את אזור הגולם הנושא את הפנוטיפ של עניין עם דפוס פלואורסצנטי גלוי לפוקוס. השתמש מברשת צבע מפורטת עדינה כדי להפוך בעדינות את הגולם ולהזיז את משוטים anal, כך איברי המין החיצוניים ניתן לזהות. גלמים נפרדים המבוססים על איברי מין חיצוניים ייחודיים.
לזכרים יש צינור ארוך הבולט מקטע האחורי הסופי כמחצית מאורכם של המשוטים האנאליים. איברי המין החיצוניים של הגולם הנשי קצרים בהרבה ובאופן דו-צדדי. להפריד את הגולם המיני לקבוצות של 10 או פחות צינורות ברורים 20 מיליליטר עם מים, ולאטום את הצינורות עם כדור של צמר גפן.
שאפו את המספר הרצוי של זכר ונקבה מבוגרים מהצינורות לכלוב או לדלי קטן, תוך כדי קפדנות שלא לפגוע במבוגרים במהלך העברה זו. שמור על הצלב במשך חמישה עד שבעה ימים לפני האכלת הדם. ביום שלמחרת, ביצים ניתן לאסוף כדי ללמוד התפתחות העובר.
להרכיב את תא oviposition ולהכניס בזהירות 10 עד 15 נקבות האכילו בדם לתוכו. מכסים את תא ההטיה ומשאירים למשך 20 דקות. בזהירות לנתק את צינור פוליפרופילן 50 מיליליטר מסיר oviposition, הקפדה לא לשחרר את היתושים.
מכסים את הסיר ומאפשרים לביצים להבשיל לשלב ההתפתחותי של העניין. אוספים ביצים מהסיר באמצעות מברשת צבע מפורטת ומניחים אותן על מים בבלוק זכוכית שנחפר בגודל 40 מ"ר. הסר בזהירות את המים מבלוק הזכוכית עם מיקרופיפט וכסה ביצים ב -500 מיקרוליטרים של FAA.
מתנדנדים בעדינות על שייקר מסלולי בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. יש לשטוף היטב את הביצים 15 פעמים במים מזוקקים כדי להסיר את כל העקבות של פתרון FAA. באמצעות מיקרופיפט 1000 מיקרוליטר להוסיף ולאחר מכן להסיר מיליליטר אחד של מים מזוקקים בכל פעם דואג לא לפגוע בביצים תוך כדי כך.
מכסים את הביצים הקבועות במיליליטר אחד של תמיסת טרפיס ודגר בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. ביצים יתחילו לפתח כתמים חיוורים לאחר חמש דקות של דגירה בסופו של דבר להגיע צבע לבן חלבי פעם פינה. לשטוף את הביצים ביסודיות 15 פעמים עם מים מזוקקים כדי להסיר את כל העקבות של פתרון Trpis.
הביטוי של סמנים פלואורסצנטיים מונע על ידי מקדם 3xP3 נצפה בעיניים וגרעינים גחון של אנופלס גמביה גומה. שימוש בסמני פלורסנט צבעוניים שונים מאפשר בחירה וסינון של אנשים שהשתנו הנושאים רכיבי GAL4 ו- UAS שונים. בעת עבודה עם מערכת GAL4-UAS דו-מפלגתית, יש צורך לחצות זכרים ונקבות מזנים שונים כדי לרכוש צאצאים הנושאים הן את רכיבי GAL4 והן את רכיבי UAS.
המורפולוגיה הדיפרנציאלית שנצפית באיברי המין החיצוניים של הגולם משמשת למין. דוגמה של גולם בלתי מזוהה מודגש כאן. הסרת כל המים מן הגולם, כפי שמוצג בצד ימין, מגביר את הקושי המיני כמו משוטים anal לטשטש הדמיה של איברי המין.
מערכת GAL4-UAS הדו-צדדית מאפשרת שינוי ביטוי גנים באופן מרחבי מפוסל מבוקר. ניתן לדמיין זאת על-ידי חציית האונוציט ו- GAL4 בכל מקום ארבעה קווי נהג המביעים עם קו המגיב UAS-mCherry. יתרון מרכזי בשימוש במערכת GAL4-UAS דו-מפלגתית הוא הקלות של לימוד פנוטיפים קטלניים אפילו בשלב העוברי.
כדי לעשות זאת, יש צורך לדמיין את המורפולוגיה הפנימית של העוברים. המאפיינים המורפולוגיים הרגילים שנצפו בשלבים שונים של התפתחות עוברית ב 12, 24, ו 36 שעות לאחר הנחת ניתן לראות לאחר השלמת פרוטוקול ניקוי העובר. זה חיוני לאורך כל ההליך הזה כי גלמים וביצים אינם מורשים להתרוקן.
לכן, חשוב לעבוד במהירות בעת הסרת נוזלים. שיטת GAL4-UAS אפשרה לנו לאפיין באופן פונקציונלי גנים המעורבים בעמידות לחומרי הדברה ואלה עם שימושים פוטנציאליים בשיטות בקרת כונן גנים.
