זוהי הדגמה של שיטה פשוטה לביטוי, מיצוי וטיהור של IgG אנושי רקומביננטי התמזגו GFP בצמחים הקשורים טבק Nicotiana benthamiana. פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל לטיהור והדמיה של נוגדנים המיוצרים על ידי צמחים, היתוך נוגדנים, ורוב החלבונים שניתן לטהר באמצעות כרומטוגרפיה של עמודה. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים ולסטודנטים במעבדות עבודה באוניברסיטה לדמיין חלבונים מתויגים GFP ברוב השלבים של תהליך ייצור החלבון.
מניחים כדורי כבול אדמה על מגש ויוצקים בעבר מבושל, עדיין מים חמים על כדורי כבול להרחבה מלאה. כדורים ייקח כמה דקות כדי להרחיב באופן מלא. לאחר משטחים מורחבים לחלוטין, מקום שניים עד שלושה זרעי Nicotiana benthamiana על כל גלולת כבול באמצעות פינצטה.
לאחר שזה נעשה, תצטרך לשפוך על 0.5 סנטימטרים של מים כדי לכסות את החלק התחתון של המגש. אל תשכח לתייג את המגש עם תאריך הזריעה. ממשיכים להשקות את השתילים מדי יום עם כמויות מתאימות של דשן.
המגש צריך להיות מכוסה בחלק עליון לח ומקום בתא צמיחה. גלולת כבול זרע צריך להישמר בתא הצמיחה ב 23 עד 25 מעלות צלזיוס עם תקופת צילום של 16 שעות ו 60% לחות יחסית. לאחר שבוע, להסיר צמח נוסף מן גלולה עוזב כל משטח כבול עם שתיל אחד בלבד.
כאשר הצמחים בני שבועיים עד שלושה שבועות, מעבירים כל גלולת כבול לסיר בודד המכיל אדמה מבוקרת לחות. ממשיכים להשקות שתילים מדי יום עם גרם אחד לדשן ליטר, אף פעם לא משאירים את האדמה יבשה לחלוטין. צמחים מוכנים להסתננות כשהם בני חמישה עד שישה שבועות.
השלבים הבאים חייבים להיעשות ליד מבער Bunsen וטכניקות aseptic בסיסיות צריך להיות מיושם כדי למנוע זיהום. תצטרך צלחת קנאמיצין Lb. מיקרוגרם אחד לריכוז קנאמיצין מיליליטר.
הקפד עם שתי מוטציות EHA105 מחסה המבנה הרצוי שלך kanamycin עמיד וגדל בן לילה. EHA105 הוא אחד הזנים הנפוצים ביותר של אגרובקטריום שתי מוטציות. כדי להתחיל את התרבות, למלא צינור חרוט עם 10 מיליליטר של מדיה ליברות, הבא, ב 10 microliters של 100 מיקרוגרם למיליליטר kanamycin, אתה יכול גם להוסיף 10 microliters של 2.5 מיקרוגרם למיליליטר של ריפאמפיצין כדי למנוע זיהום e-coli.
מהצלחת, תשתמש במושבה מבודדת אחת שאומתה על ידי PCR כדי להגדיל את התרבות החדשה שלך. בחר את המושבה המבודדת שלך וחסן אותה לתוך ה-lb. שים את החיסון על השייקר.
דגירה ב 30 מעלות צלזיוס ו 120 עד 150 סל"ד לילה. למחרת, אם תרבות האגרובקטריום נמשכת OD600 שווה 0.6 כדי 0.9 זה יכול לשמש להסתננות. אם הוא מגודל OD600 מעל אחד עד שני מיליליטר צריך להיות מועבר ק"ג טרי עם אנטיביוטיקה וגדל OD600 הנדרש.
פעם אחת ב OD600 המתאים למקם את התרבויות בצנטריפוגה, לוודא כי הצנטריפוגה מאוזנת. פלט את החיידקים על ידי צנטריפוגה ב 4, 500G במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. הם לא יכולים להתגונן משתי הדגימות.
לאחר מכן בצע שימוש חוזר בכל גלולה ומאגר חדירת X אחד כדי להביא את ה- OD הסופי ל- 0.4. שלב כמויות שוות של כל מבנה היתוך IgG עם מבנה שרשרת האור, כדי לקבל את OD הסופי של 0.2 לכל מבנה בכל צינור. קח מהדק וצמח בן חמישה עד שישה שבועות ובנת'אניאנה מהשיל הראשון.
באמצעות הקצה החד של מהדק נפרש לעשות לנקב קטן בשכבה האפידרמיס הראשונה של העלה. הימנע מנקב את העלה לאורך כל הדרך. מלא מזרק מיליליטר אחד ללא מחט המחוברת עם פתרון האגרובקטריום המוכן מהשנה השניה.
מכסים את החור שנעשה בשלב הקודם עם סוף המזרק. ולאט לאט לדחוף להזריק את החיידקים לתוך העלה תוך הפעלת לחץ נגדי עדין מאחורי העלה. נסו לחדור את רוב העלה ולתקוע את העלה עד שלוש עד ארבע פעמים, נזק עודף עלים עלול לעכב את תפוקת החלבון.
צפה עלה להכהות כמו הפתרון מוזרק מבלי להפעיל יותר מדי לחץ על המזרק. עלה הצמח הסתנן יופיע כהה בעיקר מהנוף התחתון. שים לב כי פתרון חיידקי זה צריך להיות מספיק לפחות שלושה עד ארבעה צמחים לכל מבנה.
יש לבודד באופן אוטומטי כל פתרון חיידקי שנותר לפני ההשלכה. לאחר סיום חדירה ללא מחט, למקם צמחים בחזרה בתא הצמיחה ולהמשיך להשקות מדי יום. נצפה העלים עבור כלורוזיס, נמק, כמו גם עבור פלואורסצנטיות GFP, מנורת UV גל ארוך וקצר בחורף.
בדרך כלל עוזב בימים 4 ו -5 להראות את הפלואורסצנטיות GFP הגבוהה ביותר. לקצור את כל העלים בארבעה עד חמישה ימים לאחר הסתננות ולשקול את הכמות הכוללת של חומר עלה. אתה יכול להשתמש בחומר עלה מיד לעיבוד במורד הזרם, או שאתה יכול להקפיא אותו שלילי 80 מעלות צלזיוס עד שהוא מוכן להשתמש במקום הצמחים הסתננו בחזרה בתא הצמיחה ולהמשיך להשקות מדי יום.
הבחין בעלים עבור כלורוזיס, נמק, שינויים בצבע ומוות רקמת עלה באזורים הסתננו. צמחים שנצפו עבור פלואורסצנטיות GFP. אם GFP קיים תחת מנורת UV גל ארוך וקצר.
ביטוי החלבון עולה עם הזמן, עם הפלואורסצנטיות הגבוהה ביותר של שני מבני GFP המתרחשים בדרך כלל בין ימים 4 ו -5. לקצור את כל העלים בארבעה עד חמישה ימים לאחר הסתננות ולשקול את החומר עלה הכולל. השתמש בו מיד לתהליכים במורד הזרם או להקפיא ב 80 מעלות צלזיוס שלילי עד מוכן לשימוש.
במהלך תהליך המיזוג, הקפד לשמור חוצצים ו כוסות בלנדר על קרח או בארבע מעלות צלזיוס לפני השימוש. מניחים רקמת צמח משלב 4 לתוך בלנדר לפני המשפט. במאגר מיצוי מצונן המכיל ריכוזי PMSF ונתרן אסקורבאט בהתאמה לגביע הבלנדר.
מניחים את הבלנדר על הבלנדר, לוקחים גיליון חתוך מראש של סרט פרה ומותחים אותו על החלק העליון של הבלנדר. ערבבו את רקמת העלה עם חיץ מיצוי כדי לדמיין 80 עם מרווחים 22. יהיה עליך לערבב היטב בין מחזורי תערובת לפי הצורך.
התערובת צריכה להיראות הומוגנית ללא גושים של חומר עלה. מעבירים חומר מעורבב לסק. בבר מערבבים ומערבבים אותו במשך ארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי לשפר את מובילות החלבון ולאפשר משקעים של מוצקים.
מניחים שתי שכבות של בד חשוף על מקור נקי על קרח ויוצקים את התמצית דרכו כדי להסיר פסולת עלים גדולה. אחרי הכל התמצית נשפכת דרך בד המראה לקפל את בד המראה כדי לסחוט את תמצית עלה שיורית. התמצית אמורה להופיע ירוק כהה ללא חלקיקים גלויים.
מעבירים את התמצית לצינורות צנטריפוגה. צנטריפוגה התמצית ב 16, 000Gs במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. זה יהיה גלולה כל חומר מסיס שנותר.
ודא כי שני הצינורות מאוזנים כי מכסה הרוטור הוא הידק היטב. לאחר צנטריפוגה, גלולה צריך להיות גלוי, אומר על טבעי להשליך את גלולה. סנן את העל-טבעי באמצעות מזרק 50 מיליליטר ומסנן סיבי זכוכית.
לאסוף 50 microliters של מדגם ולתייג תמצית גולמית לניתוח מאוחר יותר. הגדר עמוד פוליפרופילן המכיל 20 מיליליטר של דגימה. להעריך את כמות תרחיף הדרושים בהתאם לסוג האימונוגלובולין היעד ואת הזיקה שלה שרף.
בהדגמה זו, אנו משתמשים בשלושה מיליליטר של תרחיף. בדרך כלל שלושה מיליליטר של תרחיף הכולל עם 1.5 מיליליטר נפח המיטה יעיל לטיהור של כמה מיליגרם של נוגדנים. בזהירות pipette את הכמות הנדרשת של תרחיף resuspended לתוך העמודה כתרים.
פתח את שקע העמודה מתחתית העמודה ואפשר לו להתנקז עד שרוב המאגר יתרוקן. מיד לשפוך 10 מיליליטר של חיץ לשטוף פעם אחת PBS על גבי. תן לו לנקז ולחזור על שלב שטיפה זה פעמיים.
החל את הדוגמה המסוננת מהשנה החמישית על העמודה ואסוף את הזרימה. Aliquot 50 מיקרוליטרים של זרימה דרך לניתוח מאוחר יותר. שמור את שאר הזרימה דרך במקרה הנוגדן לא להיקשר לתוךשרף.
לשטוף את שהף פעמיים עם 10 מיליליטר של PBS פעם אחת כדי להפחית כריכה לא ספציפית. אם תרצה, aliquot 50 microliters של לשטוף כמו המאגר מתנקז דרך העמודה כדי לוודא כי נוגדן היעד אינו רמז עם חיץ לשטוף. בעוד חיץ לשטוף פועל דרך שרף, התקנה תווית חמישה צינורות מיקרו צנטריפוגה עם 125 microliters של סטרילי, אחד טוחנת טוחנת tris-HCL ב pH שמונה לנטרול מאגר אלוטיון.
לחלופין, להוסיף 30 microliters של שני בסיס טריס טוחן כדי לקבל יותר מרוכז eluate. במהלך האלוטיון, אור UV עשוי לשמש להדמיה. זה לא צריך להיעשות למשך תקופת האלוטיון.
אם אתה UV נמצא בשימוש, הקפד ללבוש ציוד מגן אישי המתאים, כדי למנוע נזק לעיניים ולעור. אין צורך להשתמש באור UV במהלך שלב האלוטיון. להניף את הנוגדנים על ידי החלת חמישה מיליליטר של חיץ אלוט על העמוד ולאסוף שבר אחד מיליליטר, על כל צינור המיועד מהשל הקודם.
מיד ליצור מחדש את העמודה על ידי החלת 20 מיליליטר ואחריו 10 מיליליטר של חיץ לשטוף. ודא השרף לא נשאר בסביבה חומצית לתקופה ממושכת של זמן. אלוטיון אמור להופיע פלואורסצנטי.
לעתים קרובות הפלואורסצנטיות הגבוהה ביותר נראית באלוטיון השני, אך יכולה להשתנות מחילוץ לחילוץ. לאחסון, לשטוף את הגוף עם 10 מיליליטר של 20%אתנול ו PBS ולתת ניקוז באמצע הדרך. סכם את החלק העליון, ואז את החלק התחתון של העמוד ולשמור זקוף בארבע מעלות C. לקבוע את ריכוז הנוגדנים באמצעות ספקטרומטר צילום על ידי מדידת ספיגה ב 280 ננומטר.
לאחסן את eluates שלילי 80 מעלות צלזיוס ו aliquot 50 microliters של כל שבר לצינור נפרד לניתוח נוסף. בדרך כלל ניתן לעשות שימוש חוזר בחלבון עד פי 10 ללא אובדן משמעותי של יעילות. עיין בהנחיות היצרן לפרטים ספציפיים לקבוע ריכוז נוגדנים, באמצעות ספקטרופוטומטר על ידי מדידת ספיגה ב 280 ננומטר.
לאחסן את eluates במינוס 80 מעלות צלזיוס ו aliquot 50 microliters של כל שבר לתוך צינור נפרד לניתוח נוסף. ניתוח של חלבון מטוהר על ידי דף Zs יכול להיעשות על ידי ביצוע פרוטוקולים סטנדרטיים. נצפתה פלואורסצנטיות כתוצאה מכך מצביעה על הצלחה של שיבוט, חדירה וביטוי של מבנה המכיל GFP.
במהלך כמה ימים, פלואורסצנטים צריכים להגדיל בהדרגה עם פלואורסצנטיות גבוהה בימים 4 ו -5. כאשר חלבון G משמש חלבון פלואורסצנטי מחייב ואלוטיון הבאים מהטור מציין טיהור של היתוך IgG המכיל GFP יציב. ואת הג'ל UV חשוף, אתה יכול לראות רק את 25KDa ו 75KDa להקות של הסולם.
אתה יכול גם לראות, את הדוגמה אלוטיון מופחת 2. האלוטציה הלא מופחתת שומרת על הפלואורסצנטיות שלה כגודל היחסי אפשר היה לצפות מ- IgG שלם כהיתוך GFP היציב שלו. בג'ל הכתמים קומאסי הן דגימות מופחתות ולא מופחתות הם דמיינו.
כל רכיבי הסולם גלויים, חלבונים מקומיים והיתוך IgG ניתן לראות תמצית הכוללת על טבעי לזרום דרך דגימות. הכביסה מכילה כמות קטנה של היתוך IgG. Elution 1 ו-4 הכילו חלבון פחות מרוכז כצפוי, מכיוון שרוב החלבון חמק בדרך כלל מהצעד השני והשלישי.
אלוטיון 2 ללא צמצום ניתן לראות גם להקות מרובות קיימות בכל דגימות אלוטיון הפחתת. 75KDa מציין פתיל שרשרת כבד לGFP. 50KDa מציין שרשרת כבדה בלבד, 25KDa מציין שרשרת אור לבד, ו 10 KDA סביר מצביע על השפלה אשר ניתן למנוע על ידי תוספת של מעכבי פרוטאז.
פרוטוקול זה יכול לשמש לטיהור של כל נוגדן מותך לכל חלבון היעד הרצוי. ניתן לערוך את התהליך כך שיכיל כמויות שונות של חומר עלים, ומאפשר גם קביעה ויזואלית של נוכחות חלבונים לפני, במהלך ואחרי סיום תהליכי מיצוי וטיהור החלבון. שיטות אלה יכולות להיות שימושיות כפקדים יכולות להיות מטרה לטכניקות הוראה.
