עבודה זו נתמכה על ידי Fraunhofer מרכז ארה&quot;ב למולקולרית וביוטכנולוגיה, iBio, Inc וביטחון מחקר מתקדם פרויקטים סוכנות (# מענק HDTRA1-07-C-0054). המחברים מודים מתנות הנדיבות על ידי בני הזוג. סטנטון Gelvin של מדע ביולוגי חוג, אוניברסיטת פרדו (Agrobacterium tumefaciens זנים) וויין פיצמוריס לביולוגיה קורפ בקנה מידה גדולה (זרעי excelsiana נ &#39;), כמו גם ג&#39;ניפר ניקולסון של ארה&quot;ב Nicotiana אוסף, צפון קרוליינה סטייט (זרעי נסורת נ ). המחברים מודים מרגרט Shillingford וכריסטופר האל על מתן צמחים וסיוע טכני מעולה. המחברים מודים גם בני הזוג. סטיבן Streatfield ונטשה קושניר למערכת סיוע.

1. צמח גידול לagroinfiltration לאחר מכן הערכנו שני מיני Nicotiana wild-type (נ benthamiana ונ &#39;אקסלסיור) והיברידי (excelsiana נ) גדל hydroponically על צמר סלעים במתקנים מקורה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים לוחות צמר סלעים בתמיסת דשן צמח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזרוע זרעים של נ &#39;wild-type benthamiana, נ &#39; נסורת ונ &#39; excelsiana (היברידי של נ benthamiana × נ הנסורת) על החומרים המזינים ספוג משטח צמר סלעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל צמחים מהזרעים בתנאים מבוקרים (24 מעלות צלזיוס ו40-65% לחות יחסית) וphotoperiod ארוכות היום (14 אור משאבי האנוש ו10 חשוכות שעות, עם תאורה של 130-150 מ &#39;μE -2 שניות -1) עבור 4-5 שבועות לנ benthamiana ונ &#39; excelsiana, ו5-6 שבועות לנ נסורת. </li></ol> 2. בנייה של וקטורים עבור Agroinfiltratיון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס גן כתב סינטטי (חלבון פלואורסצנטי ירוק [GFP]), hemagglutinin באורך מלא (HA) מזן A/California/04/2009 של נגיף שפעת (HAC1), ואנזים lichenase מחדש מהונדס (LicKM) 18 בנפרד לתוך וקטור השקת pBID4 18 (וקטור מבוסס TMV) כדי להשיג pBID4-GFP, pBID4-HAC1 וpBID4-LicKM, בהתאמה 18,32,41,47. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג 10-50 ng של pBID4 ביצוע GFP או HAC1 לתוך תאי electrocompetent של א &#39; tumefaciens GV3101 המתח וLicKM לתוך תאי electrocompetent של א &#39; tumefaciens זני GV3101, C58C1, GLA4404, At06, at10, At77 וA4 עם electroporator MicroPulser הגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש Agrobacteria הפך לניסויי הסתננות אלא אם צוין אחרת. </li></ol> 3. אבק ההסתננות של Agrobacterium לצמחי Nicotiana <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול א tumefaciens זני לילה (O / N) במדיום LB, הרפואה ייבium או בינוני AB בתוספת 50 מ&quot;ג / ליטר של Kanamycin ב28 ° C עם הרועד בסל&quot;ד 200-250. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל Agrobacteria במים מילי-Q לצפיפות אופטית ב 600 ננומטר (600) של 0.5 או Agrobacterium צנטריפוגה תאים שגודלה בLB או ייב או AB ב4,000 × גרם ל10 דקות ב 4 ° C, מחדש להשעות במדיום אינדוקציה (מלח 1x MS, MES 10 מ&quot;מ, 200 acetosyringone מיקרומטר, סוכרוז 2% [MMA]) ל600 של 0.5, ומערבבים בטמפרטורת חדר למשך 1-3 שעות, אלא אם צוין אחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחדור צמחים בתא ואקום על ידי השריית רקמות אוויריות צמח Nicotiana בהשעית Agrobacterium והחלת ואקום 50-400 mbar ל30 או 60 שניות. החדירה האופטימלית מיושמת באופן שיגרתי ב50-100 mbar ל60 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהוואקום שבור, להסיר צמחים מתא הוואקום, לשטוף במים, ולגדול במשך 5-7 ימים באותם תנאי גידול המשמשים לגידול טרום הסתננות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדוק את היעילותשל כימיקלים גרימת גן vir Agrobacterium, ריכוזים שונים של acetosyringone (0, 100, 200 או 400 מיקרומטר) נוספו לAgrobacteria המושעה במאגר הסתננות (1x MS, MES 10 מ&quot;מ, גלוקוז 2%). להשפעת monosaccharide באינדוקציה של גני vir, באחוזים השונים של גלוקוז (0, 1, 2 או 4%) נוספו לAgrobacteria מושעה במאגר ההסתננות (1x MS, MES 10 מ&quot;מ, 200 acetosyringone מיקרומטר). נ צמחי benthamiana הסתננו כאמור לעיל בצעדים 3.3 ו3.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המעבדה Agrobacterium זני GV3101, C58C1 וLBA4404 וזנים פראי מסוג A4, At06, at10, וAt77 מחסה וקטור pBID4-LicKM היו מדוללת במים מילי-Q ל600 של 0.5. נ צמחי benthamiana הסתננו עם כל זן מסוים כאמור לעיל בצעדים 3.3 ו3.4. </li></ol> 4. נוהל שיתוף agroinfiltration למדכאי השתקת ויראלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Mix התרבויות מילי-Q-מדולל במי Agrobacterium GV3101 נושאות את גן ה-GFP ו p19 המדכא ההשתקה הנגיפי של וירוס פעלולים סבוכים עגבניות (TBSV) בשעה 1:1, 2:1, 3:01 ו04:01 יחסים. לחדור נ צמחי benthamiana כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחדור נ צמחי benthamiana בתערובת של שתי תרבויות בדילול מים מילי-Q Agrobacterium GV3101: הראשון נושא את הפלסמיד pBID4-HAC1 והשני נושא את אחד ממדכאי ההשתקה - P19 של TBSV או p23 של וירוס טריסטזה הדר, בפלסמיד pCassp ( pCassp19) ובפלסמיד בינארי PGR תחת אמרגן 35S (PGR-P23), בהתאמה, ב04:01 היחס. </li></ol> 5. מערב ניתוח הכתם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דגימות עלים אקראיות מנ benthamiana, נ נסורת או נ צמחי excelsiana ב4-7 dpi ולכתוש בחנקן נוזלי לאבקה דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף שלושה כרכים של חיץ PBS 1x מכילים 0.5% טריטוןX-100 מדגם זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נער בעדינות את הדגימות שחולצו ל15 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין התמצית במשך 5 דקות ולאסוף חלבון מסיס בסך הכל לתוך צינור Eppendorf נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את תמציות לדילול מתאים (1:50 1:100) במאגר חילוץ 1x PBS, ולהוסיף 5 × חיץ מדגם (250 מ&quot;מ טריס-HCl [pH 6.8], 10% SDS, bromophenol 0.5% הכחולים, גליצרול 50% V / V, ו500 מ&quot;מ DTT) לריכוז 1 × סופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מרתיחים במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבונים נפרדים על ידי 10% SDS-PAGE, להעביר על גבי קרום העברת Immobilon-P, ולחסום עם 0.5% I-בלוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי ה-GFP באמצעות נסיוב אנטי-GFP ארנב polyclonal ב1:5,000 וHAC1 באמצעות נוגדן חד שבטי נגד פולי היסטידין עכבר ב1:1,000 בחסימת פתרון במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תיוג נוגדן ראשוני, לשטוף את הקרומים שלוש פעמים 10 דקות כל אחד עם 1 × 20-PBST ודגירה עם חזרת peroxidase (HRP) מצומדות נוגדנים נגד ארנב ב1:5,000 או HRP-המצומדנוגדן ד אנטי עכבר ב1:10,000 עבור שעה 1, עבור ה-GFP וזיהוי HAC1, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד כתמים מערביים באמצעות מצע SuperSignal מערב פיקו Chemiluminescent. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת GeneTools לנתח עוצמת להקה של החלבון ולקבל את הכמות מכוילת הלהקה. </li></ol> ייצור חלבון: (דילול מכויל כמות x של מדגם) / כמות המדגם הטעון) x 4 = מ&quot;ג / קילוגרם. משוואה: ייצור חלבון (P), כמות מכוילת (C), דילול של המדגם (ד &#39;) וכמות לדוגמא טעונה (S). 6. Zymogram Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נ לאסוף pBID4-הסתנן-LicKM דגימות רקמה אקראית benthamiana. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ חלבונים משתמשים באותן השיטות שתוארו לעיל לניתוח כתם מערבי ולאחר מכן לנתח ידי 10% SDS-PAGE עם lichenan 0.1% נכלל בג&#39;לים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אלקטרופורזה, לשטוף את הג&#39;לים פעמיים 10 דקות כל אחד בלשטוף חיץ (100 מ&quot;מ טריס-HCl [pH 8.0] ו0.1% טריטון X-100) ולאחר מכן לדגור בחיץ לשטוף ב65 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לבטל את החיץ לשטוף ולהכתים את ג&#39;לי עם 0.5% אדומים קונגו למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את ג&#39;לי במים מילי-Q שלוש פעמים 10 דקות כל אחד, ולהוסיף 1 M NaCl לדמיין פעילות lichenase. חלבון lichenase חיידקים המטוהרים שימש כביקורת חיובית לפעילות אנזים. </li></ol> 7. הדמיה GFP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע זיהוי ויזואלי של הקרינה ה-GFP בצמחים הפכו transiently כל שימוש במנורת UV באורך גל ארוך החזיק ביד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צילום transiently הפך צמחים עם מצלמה דיגיטלית דרך צהוב 8, ES 52 מסנן (זמן חשיפה, 15 שניות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג תמונות מכתם מערבי מנתח באמצעות תוכנת GeneSnap על GeneGnome ולכמת את התוצאות באמצעות תוכנת GeneTools, עם עקומת כיול המבוססת על תקן ה-GFP מטוהר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת חלבון HAC1 באמצעות עקומת כיול המבוסס על purifiסטנדרטי חלבון ed HAC מזן A/Indonesia/05/05 של נגיף שפעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב ערכים ממוצעים 3-4 משכפל לכל הניסויים. </li></ol>

יש לנו מה למסור.

במחקר זה, פיתחנו פרוטוקול agroinfiltration פשוט לייצור חלבון חולף שיגרתי במינים Nicotiana נבחרו באמצעות זני Agrobacterium נושאים את וקטור השיגור. בנוסף, יש לנו זיהינו את התנאים האופטימליים כדי להשיג את רמת ייצור חלבון הגבוהה ביותר רקומביננטי במערכת הביטוי שלנו חולפת צמח. חדירת אבק של א &#39;בדילול tumefaciens GV3101 זן מחסה pBID4 וקטור ההשקה לנ benthamiana, נ &#39; excelsiana ונ &#39;הנסורת הביאו לרמות גבוהות יותר של ייצור חלבון המטרה תוך 7 dpi בהשוואה למינים צמחים אחרים, כגון Pisum sativum הסתנן עם GV3101 מחסה וירוס פסיפס אספסת - או פסיפס מלפפון וקטורים מבוסס וירוס המבטאים את הגן המדווח GFP תחת אמרגן 35S סאטיבה 41, או lactuca, Solanum lycothaliana persicum וארבידופסיס הסתנן עם זן C58C1 של א &#39; tumefaciens נושא את גן הכתב בטא glucuronidase 57. נ benthamiana ונ &#39; excelsiana היו קל לואקום לחדור ב50 mbar עבור 30-60 שניות, עם 90-95% יעילות הסתננות. 5-10% הנותרים של אזור עלה לא הסתננו בגלל כמה צף של עלים על פני השטח של ההשעיה Agrobacterium במהלך היישום של הוואקום. מאז יש לו את וקטור השקת יכולת לתנועת תא אל התא 18, הצטברות חלבון חולפת מתרחשת בעלים שלמים, כמו גם פטוטרות ב7 dpi. ב10 dpi, ייצור ה-GFP המוערך היה נמוך במקצת בגלל וקטור ביטוי pBID4 הוא מסוגל לעבור מתא לתא, אך לא לעבור מערכתי 18; לכן, עלים גדלו חדש אינם מכילים את הווקטור ואינו תורמים לייצור של היעד. בנוסף, מ &#39;לאורך זמן פירוקו של חלבון רקומביננטיאיי לתרום לרמת חלבון מופחתת ב10 dpi. התוצאות שלנו הראו כי חדירה של א &#39; רמות גבוהות GV3101 מתח tumefaciens תיווך של ייצור חלבון החולף בנ benthamiana. יתר על כן, חלבון המטרה יכול להיות מהונדס כהתכת N-מסוף, טרמינל C-או פנימית לlichenase (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-glucanase, שהוא אנזים חום מthermocellum Clostridium ומקנה thermostability רבים יעד היתוך חלבון 18. הסתננות של נ &#39; benthamiana עם א &#39; tumefaciens wild-type זנים (at6, at10 וat77) מחסה הגן של עניין שהושרו על תסמינים מתונים או חמורים: סלסול עלים, התארכות פטוטרת, ומסתלסל. אין תסמינים פתולוגיים נצפו בנ benthamiana הסתנן עם GV3101 זן המעבדה מחסה וקטור pBID4 ריק, בעוד כמה גנים מוכנסים לתוך pBID4 והפכו למעבדת זני GV3101, C58C1 או LBA4404 עורר תגובות נמקים קלות ועלהירקון / מצהיבים סימפטומים באזורי שחדר של עלים. סימפטומים הנגרמים על ידי נימקי Agrobacterium wild-type או זני מנשקו בצמחי הסולניים כבר דיווחו בעבר 56,57. תגובת נמקים יכולה לנבוע מגורמים ארסי של מערכת הפרשת סוג III, חלבוני חיידקים מועברים לתא הצמח על ידי מערכת הפרשת סוג ד &#39;, ו / או רגישות לflagellin 58-60. מצאנו כי ייצור חולף של חלבוני Heterologous עשוי גם לעורר פתוגניות ותגובת רגישות יתר בצמח חדר עוזבת. חוקרים רבים דיווחו agroinfiltration זה של מיני צמחים שונים עם וקטורים בינאריים מפעל מיוצרים עד לרמות גבוהות יותר 5-20 זמנים של ייצור חלבון חולף בהשוואה לצמחים הפכו ביציבות 28,57. הנתונים שלנו מראה שנ &#39; benthamiana הסתנן עם GV3101 מחסה רמות גבוהות של ה-GFP, שהיא דומה לתשואת ה-GFP דיווחה להביעו transiently pBID4-GFPנ benthamiana הסתנן עם Agrobacteria נושא את וקטור Pich-GFPSYS הנגיפי (עד 80% מחלבון מסיס בסך הכל) 44. Agroinfiltration באמצעות וקטור ההשקה שלנו הביא לייצור גבוה של חלבון LicKM החום, 50 לקפל גבוה יותר מזה שנצפה באמצעות פלסמיד בינארי סטנדרטי 18. כדי לבדוק את ההדבקה של א &#39; tumefaciens והיציבות של וקטור ההשקה, אנחנו הסתננו שטוחים אחד נ benthamiana כל שעה עד 8 ​​שעות שימוש באותה התרבות בדילול מים מילי-Q של GV3101 מחסה פלסמיד pBID4-GFP. הנתונים שלנו הראו כי מתח GV3101 הוא יעילות התולעת לפחות 8 שעות וpBID4 (וקטור ההשקה) הוא מאוד יציב במהלך החדירה ארוכת שעות 8. מניית גליצרול של מתח GV3101 מחסה וקטור השקת pBID4-HAC1 (בנק תא) מאוחסן ב -80 C ° הוכח להיות מאוד יציב במשך שלוש שנים ללא שינויים בהגנה של מחזור חולףבייצור במפעלים שחדר. צמחי נ benthamiana גדלו בתנאים אופטימליים ובין 35 42 הודעה ימי זריעה היו אופטימליים לביטוי ואקום בתיווך החדירה חולף גן 40. צמחים צעירים יותר (3-4 שבועות) לא יכולים להיות שחדר כולו בגלל עלים צפים על פני ההשעיה תא ונזק לרקמות מפני ההשפעות מכאניות של החלת ואקום. בצמחים מבוגרים יותר מ45 ימים, נ &#39; benthamiana הנעילה במה, בתנאי האור האופטימלי בשימוש, ברמה של ביטוי החולף היא נמוכה. תרכובות פנוליות נמוכה מולקולריות משקל (acetosyringone) וmonosaccharaides (גלוקוז) ידועים כדי לגרום לגני vir בא tumefaciens 55,61. יתר על כן, חדירה של נ &#39; benthamiana עם pCAMBIA ינארי הווקטור (GFP) בנוכחות acetosyringone בריכוזים של 50-600 מיקרומטר הוצג כדי להגדיל מעט חולף<html> ביטוי גנים 40. אנחנו בחנו את ההשפעה של ריכוזים שונים של acetosyringone וגלוקוז במערכת שלנו על ידי הוספת תרכובות אלה לתרבויות GV3101 מחסה pBID4-GFP בMMA למשך 3 שעות, ולא מצאנו הבדל בביטוי של GFP. מעניין, תרבויות GV3101 מחסה pBID4-GFP ומדולל במים מילי-Q ל600 של 0.5 והסתננו ללא האינדוקציה גן vir הביעו אותן כמויות של ה-GFP כמו אלה הסתננו עם תרבויות מושרה. א גן tumefaciens vir (ים) שעלול להיגרם על ידי תרכובות פנוליות צמח (acetosyringone וחומצת sinapinic) וmonosaccharaides צמח (גלוקוז ופרוקטוז) הנמצא ברקמת עלה. לכן, אנו משערים כי רמות דומות של ביטוי ה-GFP בנוכחותו או היעדריו של מעוררי גן vir אקסוגני עשויות להיות תוצאה של השפעת מעוררי גן vir cytoplasmic הנוכחים במהלך השכפול של וקטור ההשקה-GFP-לבטא בתאי צמח. = &quot;Jove_content&quot;&gt; נ Wild-type benthamiana שמש כמארח מודל לייצור חלבון חולף 49. עם זאת, תשואה ביומסה נמוכה יחסית נ &#39;של benthamiana מעכבת את בקשתה לייצור בקנה מידה גדולה של חלבונים רקומביננטיים. המארח האופטימלי צריך לשלב רמה גבוהה של ביטוי חולף, צמיחה קלה בחממה, ולהיות רגיש לAgrobacterium חדירה 2. כדי לבחור מארח חלופי, אנו הסתננו שני מינים בטבע מהסוג שונים של Nicotiana (נ benthamiana ונ &#39;אקסלסיור) ונ&#39; היברידי excelsiana (נ benthamiana × נ הנסורת) עם א &#39; tumefaciens GV3101 זן מחסה פלסמיד pBID4-GFP. בין שלושת המינים הללו, רמת הביטוי של GFP הייתה מעט גבוהה יותר בנ benthamiana. נ צמחי נסורת הראו קושי בagroinfiltration ואקום בשל העלים העור שלהם, ונ &#39; excelsianaמיוצר כשני לקפל יותר ביומסה באותם תנאי גידול. הייצור הארעי של ה-GFP ב7 dpi הוא יחסית דומה בנ benthamiana ונ &#39; excelsiana. לכן, נ &#39; excelsiana עשוי להיות מארח מתאים יותר לייצור חלבון רקומביננטי. ייצור חלבון חולף בתיווך Agrobacterium מוגבל על ידי 26 PTGS, שניתן להתגבר על ידי שיתוף ביטוי של השתקת גני מדכאי ממוצא וירוס צמח 62. ייצור חלבון חולף כבר הראה בעבר להיות משופר פי 50 בנוכחותו של חלבון p19 של TBSV, אשר מעכב PTGS ברקמות הסתננו 34. במחקר שלנו, העריך את ההשפעה של שני מדכאי נגיפיים השתקה (p19 ו p23) בנפרד שיתוף הסתננו עם וקטור השקת pBID4-HAC1. שיתוף ההסתננות של מדכאי השתקה אלה נראית שיש השפעה מועטת על ביטוי חולף של HAC1, עם עלייה קלה בלבד בHAC1הצטברות חלבון (15-25%) בנוכחות של p23 או p19 שיתוף הסתנן. כדי להשפיע על ייצור חלבון באופן חיובי, מדכאי השתקה ייתכן שיהיו הצורך שנבחרו במיוחד כדי להיות יעיל עבור מיני צמחים הממוקדים ווקטור ויראלי 63. יש helicase TMV מדכאי פעילות השתקת RNA 64,65. הנתונים שלנו לאשר תצפית זו כמו שיתוף ההסתננות של p23 או p19 עם pBID4-HAC1 לא גרמה לעלייה בGFP או עלייה קלה בייצור חלבון HAC1 החולף. לסיכום, יש לנו שונה ומותאם צמח ותנאי גידול Agrobacterium ושיפרו את היעילות של חדירת אבק. טכנולוגיה זו אפשרה לנו לגדול ולחדור מאות קילוגרמים של חומר צמחי בכמה שעות. אנחנו אוטומטיים בהצלחה טכניקת הביטוי חולפת המפעל לייצור חיסון תפוקה גבוהה בקני מידה תעשייתיות בשיטות ייצור טוב הנוכחיות תנאים (cGMP). לקבלת מידע נוסף אבוהאוטומציה ut וניצול של מערכת הצמח חולפת חלבון הייצור לייצור חלבונים רקומביננטיים, כולל מועמדי חיסון למקטע, תחת תנאי cGMP, קוראים מופנים לאתר <a href="http://fhcmb.org/">www.fhcmb.org/.</a>

צמחי החברה מוכרים כפלטפורמה בטוחה, אמינה, ניתן להרחבה וזולה לייצור תרופות הביולוגיים רקומביננטי Heterologous וחלבונים תעשייתיים 1-3 ויש לי יתרונות חשובים על פני מערכות ביטוי תא של חיידקים ובעלי חי 4. צמחים מסוגלים לבטא חלבונים מקופלים בצורה נכונה עם שלאחר translational שינויים, כולל נוגדנים Multimeric התאספו 5-7. חלבונים רקומביננטיים תרופות צמחיות כמה עוברים הערכה קלינית 8. אלה כוללים חיסוני מטופל ספציפי רקומביננטי אזוטיפ (scFv) לטיפול בלימפומה שאינה הודג&#39;קין 9, מגיפה מבוססת hemagglutinin ומועמדים חיסון שפעת עונתיים 10,11 (קאמינגס et al., שהוגש לחיסון), אני אנטיגן פני השטח נגד סטרפטוקוקוס / נוגדן השני לטיפול בעששת 12, והאינסולין אנושי לטיפול בסוכרת 13. יתר על כן, reco אדםglucocerebrosidase mbinant לטיפול בתחליפי אנזים בחולים עם מחלת גושה כבר אושר בישראל ובארצות הברית, והוא ניתן במסגרת תכנית הגישה המורחבת מחוץ לארה&quot;ב 14,15. ניתן לייצר חלבוני Heterologous בהפכו ביציבות (מהונדס או transplastomic) או צמחים הפכו transiently. ייצור חלבון חולף מציע מספר יתרונות על פני ייצור בצמחים הטרנסגניים, כוללים פרק זמן קצר כדי להשיג ביטוי והצטברות 16, ויכול להיות מושגת על ידי החדרת וקטורים בינאריים חיידקים או וקטורים ויראליים צמח רקומביננטי לתוך רקמות צמח 4. מערכת הביטוי חולפת המתקדמת ביותר מבוססת על השימוש ב&#39;וקטורי השקה &#39;המשלבים רכיבים של וירוסי צמחים ופלסמידים בינארי, ומועברים על ידי agroinfiltration 17,18. Agroinfiltration של וקטור השקה המבוסס על נגיף פסיפס טבק (TMV) יושם בהצלחה במעבדהאת קנה המידה כדי לייצר אנטיגנים חיסון נגד פתוגנים כגון וירוס הפפילומה אנושי 19, Yersinia pestis 20, שפעת וירוסים, anthracis Bacillus 21,22 23, ונגיף אבעבועות שחורות 24 בנ benthamiana עוזב. ביטוי חולף בתיווך Agrobacterium הוא גם שיטה מבטיחה לייצור בו זמני של חלבונים רבים 2,25-27. לדוגמא, מערכות ביטוי חולפות צמח היו בשימוש כדי לייצר נוגדני גידול ספציפי רקומביננטי 28,29, נוגדן מסוכר רקומביננטי כנגד הקולטן לגורם גדילה באפידרמיס 30, ונוגדנים חד שבטיים ספציפיים לאנטיגן מגן האנתרקס 31,32. שיתוף חדירה של צמחי benthamiana Nicotiana עם גן מטרה ומדכא של תוצאות להשתקת גנים בביטוי חלבון המטרה משופרת 33,34. Agroinfiltration היא שיטה נפוצה לintrodu אחידחיידקי cing מחסה גן של עניין למפעל רקמות 35-37. חדירת אבק של Agrobacterium לביטוי גנים חולף בצמח שלם משאיר היא שיטה מהירה, ניתן להרחבה, ושימושית לייצור של חלבונים זרים ללא הצורך לייצר צמחים מהונדסים 38-41. במהלך agroinfiltration ואקום, צמחים התהפך במהופך וחלקי אוויר שקוע בהשעית Agrobacterium. אז ואקום מיושם גורם גזים לפינוי מחללים אינטר עלה דרך הפיוניות. השחרור מחדש על לחץ הבא מהיר של תוצאות הוואקום בעירוי של ההשעיה Agrobacterium לעלה. בעקבות חדירת אבק של Agrobacteria, צמחי מעובדות נוספות וביטוי היעד הוא תחת פיקוח. הרמות הגבוהות ביותר של ביטוי היעד הם נצפו בדרך כלל 2-3 ימים שלאחר חדירה (dpi) עם וקטור בינארי ו4-7 dpi עם וקטור השקה, לאחר שרמת הביטוי בדרך כלל decreases 17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens הוא הרכב הנפוץ ביותר להעברת גן של עניין למפעל לייצור חלבון. Agroinfiltration עובד מצוין בנ benthamiana אבל יחסית גרוע ברוב הצמחים אחרים, כולל thaliana ארבידופסיס 46. במחקר זה, פיתחנו שיטה פשוטה, יעילה וחסכונית לייצור חלבון חולף בנ &#39;בן השבוע 5-6 benthamiana באמצעות א tumefaciens הסתננות. החסרון העיקרי של קנה מידה תעשייתית של טכניקת agroinfiltration הוא צנטריפוגה של חיידקים וresuspension של גלולה החיידקים במצע המכילה 4&#39;-hydroxy-3 שנקטפו &quot;, 5&#39;-dimethoxyacetophenone (acetosyringone), מונוסכרידים, ו 2 - (N-morpholino) -Ethanesulfonic חומצה (MES) חיץ לאינדוקציה של גנים vir. אנחנו כבר מסוגלים להתגבר על בעיות אלה על ידי אופטימיזציה של Agrobacterium </em&gt; צמיחה במדיום AB (מדיום מינימאלי) ואחריו ישירות דילול במים מילי-Q ועל ידי שליטה על משך החדירה ותנאים. יש לנו גם בהשוואה ייצור חלבון המטרה בנ &#39;מיני מארח טבק wild-type benthamiana ונ &#39; נסורת, כמו גם בנ ההיברידי excelsiana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="792">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana benthamiana</td>
			<td style="width:221px;">Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td>
			<td style="width:119px;">PI 555478 TW16</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana excelsior</td>
			<td style="width:221px;">Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td>
			<td style="width:119px;">PI 555685 TW47</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana excelsiana</td>
			<td style="width:221px;">Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA</td>
			<td style="width:119px;">LSBC EBA 042304.02</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vacuum skid</td>
			<td style="width:221px;">Abbas, Ashland, MA</td>
			<td style="width:119px;">Custom made</td>
			<td style="width:236px;">Plant infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rockwool</td>
			<td style="width:221px;">Grodan Inc., Ontario, Canada</td>
			<td style="width:119px;">AO 50/40</td>
			<td style="width:236px;">Hydroponic media for growing plant</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid</td>
			<td style="width:221px;">Acros Organics, Thermo Fisher Scientific&#160; 
			NJ</td>
			<td style="width:119px;">172595000</td>
			<td style="width:236px;">Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Murashige &#38; Skoog salt (MS salt)</td>
			<td style="width:221px;">Phyto Technology Lab</td>
			<td style="width:119px;">M524</td>
			<td style="width:236px;">Tissue culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">D134406-5G</td>
			<td style="width:236px;">Agrobacterium induction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Immobilon-P transfer membrane</td>
			<td style="width:221px;">Millipore, Billerica, MA</td>
			<td style="width:119px;">IPVH00010</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">I-block</td>
			<td style="width:221px;">Applied Biosystems, Foster City, CA</td>
			<td style="width:119px;">T2015</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rabbit polyclonal anti-GFP antiserum&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Washington Biotechnology, Baltimore, MD&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse anti&#8211;poly-histidine monoclonal antibody</td>
			<td style="width:221px;">Qiagen GmbH, Hilden</td>
			<td style="width:119px;">34670</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td style="width:119px;">111-035-003</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:221px;">Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td style="width:119px;">115-035-003</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SuperSignal&#174; West Pico chemiluminescent substrate</td>
			<td style="width:221px;">Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL</td>
			<td style="width:119px;">34078</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan)</td>
			<td style="width:221px;">Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland&#160;</td>
			<td style="width:119px;">P-LICHN</td>
			<td style="width:236px;">Lichenase Activity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Congo Red&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">C6277&#160;</td>
			<td>Gel staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Digital camera&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Olympus, Center Valley, PA</td>
			<td style="width:119px;">C-8080</td>
			<td>Chemiluminescence imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GeneGnome</td>
			<td style="width:221px;">Syngene, Frederick, MD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chemiluminescence imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GFP standard&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Made in house&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chemiluminescence imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plant fertilizer solution</td>
			<td style="width:221px;">Griffin Greenhouse &#38; Nursery Supplies, Newark, DE</td>
			<td style="width:119px;">67-23-20</td>
			<td>Plant growing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lichenase Standard</td>
			<td style="width:221px;">Purified in house&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroPulser Electroporator</td>
			<td style="width:221px;">BioRad, Hercules, CA&#160;</td>
			<td>165-2100</td>
			<td>Agrobacterium transformation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization and utilization of agrobacterium-mediated transient protein production in nicotiana

ייצור חלבון חולף בתיווך Agrobacterium בצמחים הוא גישה מבטיחה לייצר אנטיגנים חיסון וחלבונים טיפוליים בתוך תקופה קצרה של זמן. עם זאת, טכנולוגיה זו היא רק מתחילה להיות מיושמת על מכשולים טכנולוגיים רבים ייצור בקנה מידה גדולה בהיקף של עד הם עתה להתגבר עליו. הנה, אנחנו מדגימים שיטה פשוטה ולשעתק לייצור חלבון חולף בקנה מידה תעשייתית המבוססים על חדירת אבק של צמחי Nicotiana עם Agrobacteria ביצוע וקטורי השקה. אופטימיזציה של טיפוח Agrobacterium במדיום AB מאפשרת דילול ישיר של תרבות החיידקים במים מילי-Q, לפשט את תהליך החדירה. בין שלושה מינים שנבדקו של Nicotiana, נ &#39; excelsiana (נ benthamiana × נ הנסורת) נבחר כמארח המבטיח ביותר בשל הקלות של חדירה, רמה גבוהה של ייצור חלבון כתב, ועל שני-fייצור ישן גבוה יותר ביומסה בתנאים סביבתיים מבוקרים. אינדוקציה של Agrobacterium מחסה pBID4-GFP (מבוסס נגיף פסיפס טבק) שימוש בכימיקלים כגון acetosyringone וmonosaccharide לא הייתה השפעה על רמת ייצור החלבון. צמח שחדר מתחת 50-100 mbar ל30 או 60 שניות הביא לחדירת% על 95 של רקמות עלים צמח. הסתננות עם GV3101 זן המעבדה Agrobacterium הראתה ייצור החלבון הגבוה ביותר בהשוואה לזני Agrobacteria מעבדה LBA4404 וC58C1 ופראי מהסוג Agrobacteria זני at6, at10, at77 וA4. שיתוף ביטוי של השתקת RNA נגיפי מדכא, p23 או p19, בנ benthamiana הביא להצטברות מוקדם יותר וייצור מוגבר (15-25%) חלבון המטרה (hemagglutinin וירוס שפעת) של.

Watch this Scientific Journal Video about Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana at JoVE.com

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

ייצור חלוף חלבון בצמחי Nicotiana מבוססים על חדירת אבק עם Agrobacteria ביצוע וקטורי השקה (מבוסס נגיף פסיפס טבק) הוא גישה מהירה וכלכלית להפקת אנטיגנים חיסון וחלבונים טיפוליים. אנחנו פישטנו את ההליך ושיפור בהצטברות יעד על ידי אופטימיזציה של תנאי גידול חיידקים, בחירת מין מארח, ושיתוף מציג מדכאי RNA השתקה.

אופטימיזציה וניצול<em&gt; Agrobacterium</emייצור חלבון חלוף&gt; בתיווך ב<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

optimization-utilization-agrobacterium-mediated-transient-protein

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

41.2K Views.  Fraunhofer USA Center for Molecular Biotechnology.  ייצור חלוף חלבון בצמחי Nicotiana מבוססים על חדירת אבק עם Agrobacteria ביצוע וקטורי השקה (מבוסס נגיף פסיפס טבק) הוא גישה מהירה וכלכלית להפקת אנטיגנים חיסון וחלבונים טיפוליים. אנחנו פישטנו את ההליך ושיפור בהצטברות יעד על ידי אופטימיזציה...

Video: Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFR&#945;, etc.). We are able to model and study a human-like disease in our mouse model, by transplanting bone marrow cells previously infected with a retrovirus expressing the oncogene of interest. Replication-defective retrovirus encoding a human oncogene and a marker (GFP, RFP, antibiotic resistance gene, etc.) is produced by a transient transfection protocol using 293T cells, a human renal epithelial cell line transformed by the adenovirus E1A gene product. 293 cells have the unusual property of being highly transfectable by calcium phosphate (CaPO4), with up to 50-80% transfection efficiency readily attainable. Here, we co-transfect 293 cells with a retroviral vector expressing the oncogene of interest and a plasmid that expresses the gag-pol-env packaging functions, such as the single-genome packaging constructs kat or pCL, in this case the EcoPak plasmid. The initial transfection is further improved by use of chloroquine. Stocks of ecotropic virus, collected as culture supernatant 48 hrs. post-transfection, can be stored at -80&deg;C and used for infection of cell-lines in view of transformation and in vitro studies, or primary cells such as mouse bone marrow cells, that can then be used for transplant in our mouse model.

This technique demonstrates an efficient way to prepare replication-defective retroviral stocks encoding a human oncogene, and subsequently used for induction of myeloproliferative disease in the mouse model.

הפקה של רטרווירוס שכפול פגומים-by transfection חלוף של תאים 293T

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated heavy chains that are noncovalently associated with beta2-microglobulin. They bind lipids rather than peptides. Although their structure confirms the similarity of CD1 proteins to MHC class I and class II antigen presenting molecules, the mCD1d groove is relatively narrow, deep, and highly hydrophobic and it has two binding pockets instead of the several shallow pockets described for the classical MHC-encoded antigen-presenting molecules. Based upon their amino acid sequences, such a hydrobphobic groove provides an ideal environment for the binding of lipid antigens. The Natural Killer T (NKT) cells use their TCR to recognize glycolipids bound to or presented by CD1d. T cells reactive to lipids presented by CD1 have been involved in the protection against autoimmune and infectious diseases and in tumor rejection. Thus, the ability to identify, purify , and track the response of CD1-reactive NKT cell is of great importance . The generation of tetramers of alpha Galactosyl ceramide (a-Galcer) with CD1d has significant insight into the biology of NKT cells. Tetramers constructed from other CD1 molecules have also been generated and these new reagents have greatly expanded the knowledge of the functions of lipid-reactive T cells, with potential use in monitoring the response to lipid-based vaccines and in the diagnosis of autoimmune diseases and other treatments.

A Method to prepare Insect cells and infect them with baculovirus for the the purpose of production of recombinant mCD1d proteinand generating mCD1d tetramers.

שיטה לייצור של חלבון רקומביננטי mCD1d בתוך תאים חרקים.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Virus-Induced להשתקת גנים (VIGS) ב ניקוטיאנה benthamiana עגבניות

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Agrobacterium בתיווך Virus-induced ג&#39;ין השתקת Assay כותנה

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

The tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the Human Protein Atlas project for global analysis of protein expression patterns in normal human tissues, cancer and cell lines. Here we present the assembly of 1 mm cores, retrieved from microscopically selected representative tissues, into a single recipient TMA block. The number and size of cores in a TMA block can be varied from approximately forty 2 mm cores to hundreds of 0.6 mm cores. The advantage of using TMA technology is that large amount of data can rapidly be obtained using a single immunostaining protocol to avoid experimental variability. Importantly, only limited amount of scarce tissue is needed, which allows for the analysis of large patient cohorts 1 2. Approximately 250 consecutive sections (4 &mu;m thick) can be cut from a TMA block and used for immunohistochemical staining to determine specific protein expression patterns for 250 different antibodies. In the Human Protein Atlas project, antibodies are generated towards all human proteins and used to acquire corresponding protein profiles in both normal human tissues from 144 individuals and cancer tissues from 216 different patients, representing the 20 most common forms of human cancer. Immunohistochemically stained TMA sections on glass slides are scanned to create high-resolution images from which pathologists can interpret and annotate the outcome of immunohistochemistry. Images together with corresponding pathology-based annotation data are made publically available for the research community through the Human Protein Atlas portal (<a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a>) (Figure 1) 3 4. The Human Protein Atlas provides a map showing the distribution and relative abundance of proteins in the human body. The current version contains over 11 million images with protein expression data for 12.238 unique proteins, corresponding to more than 61% of all proteins encoded by the human genome.

Tissue microarrays allows for an efficient method to gain concurrent information from a multitude of tissues. Representative parts of tissues are assembled into a single paraffin block. Sections from the block are used for immunohistochemistry and analysis of protein expression patterns. Digital scanning generates corresponding images for distribution of data.

הפקה של microarrays רקמות, צביעה אימונוהיסטוכימיה ו דיגיטציה בתוך אטלס החלבון האנושי

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most commonly used agent for agroinfiltration is Agrobacterium tumefaciens, a pathogen of many dicot plant species. This implies that agroinfiltration can be applied to many plant species. Here, we present our protocols and expected results when applying these methods to the potato (Solanum tuberosum), its related wild tuber-bearing Solanum species (Solanum section Petota) and the model plant Nicotiana benthamiana. In addition to functional analysis of single genes, such as resistance (R) or avirulence (Avr) genes, the agroinfiltration assay is very suitable for recapitulating the R-AVR interactions associated with specific host pathogen interactions by simply delivering R and Avr transgenes into the same cell. However, some plant genotypes can raise nonspecific defense responses to Agrobacterium, as we observed for example for several potato genotypes. Compared to agroinfiltration, detection of AVR activity with PVX agroinfection is more sensitive, more high-throughput in functional screens and less sensitive to nonspecific defense responses to Agrobacterium. However, nonspecific defense to PVX can occur and there is a risk to miss responses due to virus-induced extreme resistance. Despite such limitations, in our experience, agroinfiltration and PVX agroinfection are both suitable and complementary assays that can be used simultaneously to confirm each other&#39;s results.

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are routine functional assays for transient ectopic expression of genes in plants. These methods are efficient assays in effectoromics strategies (rapid resistance and avirulence gene discovery) and crucial to modern research in molecular plant pathology. They meet the demand for robust high-throughput functional analysis in plants.

אגרוינפינציה ו- PVX אגרוינבינציה בתפוח אדמה וניקוטיאנה בנתאמיאנה

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

לוציפראז קומפלמנטציה הדמיה Assay העלים טבק benthamiana עבור Transiently קביעת חלבון אינטראקציה דינמיקה

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...