המחברים מבקשים להודות לכל קונסורציום ACEnano על דיונים פוריים לאורך כל שלבי הכנת הפרוטוקול המוצג כאן. המחברים מעריכים גם מימון מתוכנית Horizon 2020 של האיחוד האירופי (H2020) במסגרת הסכם המענק nº 720952 במסגרת פרויקט ACEnano.

כל המחברים של כתב יד זה הם עובדים של Postnova Analytics GmbH, שמוצריה מנוצלים בפרוטוקול זה.

הגודל ההידרודינמי של AuNP לא ידוע הוערך במדויק על ידי AF4 יחד עם גלאי UV-vis באמצעות תקני גודל מוגדרים היטב של AuNP הנעים בין 20 ננומטר ל -100 ננומטר. שיטת AF4 המפותחת עברה אופטימיזציה באמצעות פרופיל זרימה צולבת קבוע על מנת ליצור קשר ליניארי בין זמן שמירה מדוד לגודל AuNP, ובכך לאפשר קביעת גודל פשוטה מניתוח רגרסיה ליניארית. התמקדות מיוחדת הייתה גם בהשגת שיעורי התאוששות גבוהים מספיק המציין שום אובדן מדגם משמעותי במהלך השבר, וכי שיטת AF4 שפותחה, כולל האלונט המוחל והממברנה התאימה היטב עם כל דגימות AuNP מופרדות.
פיתוח שיטה הוא ללא ספק הצעד הקריטי ביותר ב- AF4 וכמה פרמטרים, כולל ממדי ערוץ, פרמטרי זרימה, כמו גם eluent, קרום, גובה מרווח, ואפילו תכונות מדגם יש לקחת בחשבון על מנת לשפר את השבר בתוך חלון זמן elution נתון. מטרת פסקה זו היא להנחות את הקורא לאורך השלבים הקריטיים שמוטבו כדי לקבוע בהצלחה את גודל מדגם AuNP הלא ידוע הנדון כאן. לתיאור מפורט יותר של איך בדרך כלל לפתח שיטת AF4, הקורא מתייחס לסעיף AF4 של 'ISO /TS21362:2018 - Nanotechnologies - ניתוח של ננו-אובייקטים באמצעות זרימה אסימטרית ושבר זרימת שדה צנטריפוגלי'25. לאחר מבט מקרוב על תנאי השבר החלים שניתנו בטבלה 3, הצעד הקריטי הראשון הוא הקדמה והרפיה של מדגם AuNP בערוץ AF4. שלב זה נשלט על ידי זרימת ההזרקה, זרימת המיקוד והזרימה הצולבת, אשר יחסי הגומלין שלהם מאלצים את המדגם לאתר קרוב לפני השטח של הממברנה ולרכז אותו ברצועה צרה ליד יציאת ההזרקה של ערוץ AF4 בעצם הגדרת נקודת ההתחלה של השבר. הרפיה מספקת של המדגם היא חובה כמו במהלך שלב זה, מדגם מרכיבים בגדלים שונים לאתר בגבהים שונים של ערוץ AF4 ובכך לספק את הבסיס לשבר גודל מוצלח. הרפיה מדגם לא שלם הוא בדרך כלל גלוי על ידי שטח שיא חלל מוגבר הנובע מרכיבים מדגם unretained (כלומר, לא רגוע). ניתן לצמצם אפקט זה על-ידי הגדלת זמן ההזרקה ו/או קצב הזרימה הצולבת המוחל. עם זאת, שני הפרמטרים זקוקים לאופטימיזציה זהירה, במיוחד עבור דגימות הנוטות להתלכדות וספיחות על קרום AF4, וניתן לפקח עליהם על ידי שיעורי השחזור המתאימים המתקבלים עבור הגדרות פרמטר שונות36,37. זמן ההזרקה החל של 5 דקות יחד עם קצב זרימה צולבת של 1.0mL∙min-1 גילה שיעורי התאוששות >80% עבור כל דגימות AuNP ואזור שיא חלל זניח המציין תנאי הרפיה כמעט אופטימליים. לאחר הרפיה מספקת של מדגם AuNP, זרימת המיקוד הופסקה והובלת מדגם לאורך ערוץ AF4 לגלאי UV-vis בהתאמה החלה המייצגת את הצעד הקריטי השני. על מנת להבטיח כוח שבר גבוה מספיק בזמני ניתוח סבירים, קצב זרימה צולבת קבוע של 1.0 mL∙min-1 למשך 30-50 דקות (בהתאם לתקן גודל AuNP המוקטן בהתאמה) ואחריו ריקבון זרימה צולבת ליניארית של 10 דקות בקצב זרימת גלאי של 0.5 מ"ל.min-1 הוחל. באמצעות פרופיל זרימה צולבת קבוע על פני ההפרדה של כל תקני גודל AuNP גילה קשר ליניארי בין זמן שמירה לגודל AuNP בעקבות FFF-Theory22, ובכך לאפשר קביעת גודל של מדגם AuNP לא ידוע על ידי ניתוח רגרסיה ליניארית פשוטה. עם זאת, פרופילים שאינם זרימה צולבת מתמדת נוצלו גם לשינוי גודל של חלקיקים, ובסופו של דבר מובילים ליחסים לא ליניאריים בין זמן השמירה לגודל החלקיקים38,39. בנוסף, קביעת גודל AF4 באמצעות תקני גודל מוגדרים היטב אינה מוגבלת AuNP, אבל יכול להיות מיושם גם על חלקיקים עם גדלים אחרים הרכב אלמנטלי (למשל, כסף38,40 או חלקיקי סיליקה41,42). בנוסף, כאשר עובדים עם דגימות מדוללות, ICP-MS הוא גלאי יסוד רגיש מאוד, אשר ניתן לצמיד עם AF4, הוספת צדדיות של גישה אנליטית זו לשינוי גודל של מגוון גדול של חלקיקים בהשעיה.
למרות היישום הנרחב שלה, כיול גודל חיצוני באמצעות תקני גודל מוגדרים היטב AF4 יש כמה מוזרויות שיש לקחת בחשבון בעת שימוש בו עבור גודל מדויק של דגימות לא ידועות. קודם כל, זה מסתמך במידה רבה על היישום של תנאים דומים במהלך השבר של תקני הגודל בהתאמה ואת המדגם בפועל. במקרה המוצג כאן, לכן חובה כי הן את תקני גודל AuNP, כמו גם את מדגם AuNP לא ידוע מופרדים באמצעות אותה שיטת AF4, כמו גם את אותה התרוממות רוח ואותו קרום מה שהפך גישה זו לבלתי גמישה למדי. יתר על כן, ללא גלאים רגישים לגודל, למשל, פיזור אור (MALS ו- DLS) בהישג יד, קשה לקבוע אם שיטת AF4 בהתאמה באמצעות תקני גודל עובד מספיק טוב או לא. זה נכון במיוחד עבור דגימות לא ידועות המציגות התפלגויות גודל רחבות מאוד, שם עדיין לא ברור אם כל המרכיבים מדגם בצע את דפוס elution נורמלי: שבר מחלקיקים קטנים יותר לגדולים יותר, או אם מרכיבי מדגם גדולים כבר elute במצב סטריק-hyperlayer ובכך פוטנציאל co-eluting עם מרכיבים מדגם קטןיותר 43,44. בנוסף, למרות FFF-התיאוריה מדגישה כי AF4 מפריד אך ורק על בסיס הבדלים בגודל הידרודינמי עם חלקיקים נחשבים מסות נקודה ללא כל אינטראקציות עם הסביבה שלהם22, המציאות מספרת סיפור אחר עם חלקיק חלקיקים וחלקיקים-לי אינטראקציות ממברנה (כגון משיכה אלקטרוסטטית / דחייה או ואן דר-ואלס אטרקציה) עשוי לשחק תפקיד ניכר והוא יכול להציג הטיה מדידה לתוך קביעות גודל באמצעות כיול גודל חיצוני45,46. לכן מומלץ להשתמש בתקני גודל התואמים באופן אידיאלי את הרכב ואת תכונות פני השטח (פוטנציאל זטה) של החלקיק שלעניין 40,42 או, אם אלה אינם זמינים, לפחות להשתמש בתקני גודל חלקיקים מאופיינים היטב (למשל, חלקיקי לטקס פוליסטירן) ולהעריך בזהירות את ההשלמות שלהם עם החלקיק של עניין במיוחד במונחים של פוטנציאל זטה פני השטח שלהם בסביבה המתאימה, שבו הניתוח יבוצע41,47.
הרבגוניות של AF4 נחשבת לעתים קרובות לעוצמתה הגדולה ביותר, שכן היא מציעה טווח יישומים החורג מרוב טכניקות הגודל הנפוצות האחרות בתחום זה22,48,49. עם זאת, בשל המורכבות הנלווית אליו, הוא עשוי להיחשב גם כחיסרון המשמעותי ביותר שלו במיוחד נגד טכניקות שינוי גודל מהירות וקלות לשימוש לכאורה כגון DLS, ניתוח מעקב חלקיקים או חלקיק יחיד ICP-MS. עם זאת, כאשר מכניסים את AF4 לפרספקטיבה עם טכניקות שינוי גודל פופולריות אלה, מתברר כי לכל הטכניקות יש את היתרונות והחסרונות שלהן, אך כולן תורמות להבנה מקיפה יותר של האופי הפיזיו-כימי של חלקיקים ולכן יש לראות בהן משלימות ולא תחרותיות.
נוהל הפעולה הסטנדרטי (SOP) המוצג כאן, מדגיש את הישימות המצוינת של AF4-UV-vis עם כיול גודל חיצוני לשינוי גודל של מדגם AuNP לא ידוע בהשעיה ובסופו של דבר הוחל כקו מנחה מומלץ לניתוח AF4 של מדגם AuNP לא ידוע בתוך השוואה בינלאומית interlaboratory (ILC) שנערך במסגרת פרויקט Horizon 2020, ACEnano (התוצאה של ILC זה יהיה הנושא של פרוטוקול זה, אם כן, מסתכם במאמצים הבינלאומיים המעודדים והמתמשכים לאמת ולתקנן מתודולוגיות AF425,50,51,52 המדגישות את הפוטנציאל המבטיח של AF4 בתחום אפיון הננו-חלקיקים.

חלקיקי זהב (AuNP) בצורה של זהב קולואידי היו חלק מתרבות האדם הרבה לפני שהייתה הבנה של מה הם חלקיקים ולפני שהמונח חלקיקים מצאו את דרכם לאוצר מילים מדעי עכשווי. ללא ידע ברור על המראה הננומטרי שלהם, AuNP מושעה כבר שימש למטרות רפואיות ואחרות בסין העתיקה, ערב, והודו במאות V-VI לפני הספירה1, וגם הרומאים העתיקים ניצלו את צבעם האדום האודם כדי להכתים את כלי החרס שלהם בתערוכת גביע Lycurgus במוזיאון הבריטי2. בעולם המערבי, לאורך מאות שנים מימי הביניים ועד העידן המודרני, AuNP מושעה שימשו בעיקר כסוכני צביעה עבור זכוכית ואמייל (סגול של קאסיוס)3, כמו גם לטיפול במגוון מחלות (זהב ראוי לשתייה), במיוחד עגבת4.
עם זאת, כל המחקרים הללו התמקדו בעיקר ביישום של AuNP מושעה וזה היה תלוי מייקל פאראדיי בשנת 1857 כדי להציג את הגישה הרציונלית הראשונה לחקור את היווצרותם, טבעם, כמו גם את המאפיינים שלהם5. למרות פאראדיי כבר היה מודע לכך AuNP אלה חייב להיות ממדים דקה מאוד, זה לא היה עד הפיתוח של מיקרוסקופ אלקטרונים כאשר מידע מפורש על התפלגות הגודל שלהם היה נגיש6,7, בסופו של דבר המאפשר את המתאם בין גודל ומאפיינים אחרים AuNP.
כיום, הודות לסינתזה קלה ופשוטה למדי שלהם, תכונות אופטיות מדהימות (תהודה פלסמון פני השטח), יציבות כימית טובה ובכך רעילות מינורית, כמו גם צדדיות גבוהה שלהם במונחים של גדלים זמינים ושינויים פני השטח, AuNP מצאו יישומים נרחבים בתחומים כגון nanoelectronics8,אבחון 9, טיפול בסרטן10, או משלוח סמים11. ברור, עבור יישומים אלה, ידע מדויק של התפלגות גודל וגודל של AuNP להחיל הוא תנאי מוקדם בסיסי כדי להבטיח יעילות אופטימלית12 ויש ביקוש משמעותי עבור כלים חזקים ואמינים כדי לקבוע את הפרמטר הזה physico-כימי מכריע. היום, יש שפע של טכניקות אנליטיות המסוגלות לשנות את גודל AuNP בהשעיה כולל, לדוגמה, ספקטרוסקופיית UV-vis (UV-vis)13, פיזור אור דינמי (DLS)14 או ספקטרומטריית מסה פלזמה משולבת UV-vis (spICP-MS)15 עם שבר זרימת שדה (FFF) להיות שחקן מפתח בתחום זה16,17,18,19,20.
הומשג לראשונה בשנת 1966 על ידי J. קלווין גידינגס21, FFF כולל משפחה של טכניקות שבר מבוסס elution, שבו ההפרדה מתרחשת בתוך ערוץ דק, כמו סרט ללא שלב נייח22,23. ב- FFF, ההפרדה נגרמת על ידי אינטראקציה של מדגם עם שדה כוח חיצוני הפועל בניצב לכיוון זרימת ערוץ למינאר, שבו המדגם מועבר במורד הזרם בדרך כלל לכיוון גלאים בשורה בהתאמה. בין טכניקות FFF קשורות אלה, שבר שדה זרימה-זרימה אסימטרי (AF4), שבו זרימה שנייה (זרימה צולבת) משמש כשדה הכוח, הפך לסוג המשנה הנפוץ ביותר24. ב- AF4, תחתית הערוץ (קיר הצטברות) מצוידת בקרום סינון אולטרה-סינון הניתן למחצה המסוגל לשמור על הדגימה ובו זמנית לאפשר לזרימת הצלב לעבור דרך הממברנה ולהשאיר את הערוץ דרך שקע נוסף. באמצעות זה, הזרימה הצולבת יכולה לדחוף את המדגם לכיוון קיר ההצטברות ובכך לנטרל את השטף הנגרמת על ידי דיפוזיה (תנועה בראוניאנית). בשיווי משקל וכתוצאה מכך של שטף שדה ופיזור-induced; מרכיבי מדגם קטנים יותר המציגים מקדמי דיפוזיה גבוהים יותר מתיישרים קרוב יותר למרכז התעלה, בעוד מרכיבי מדגם גדולים יותר המציגים מקדמי דיפוזיה נמוכים יותר מאתרים קרוב יותר לקיר ההצטברות. בשל פרופיל הזרימה הפרבולית בתוך הערוץ, מרכיבי מדגם קטנים יותר מועברים אפוא בלמינה המהירה יותר של זרימת התעלה ו elute לפני מרכיבי מדגם גדולים יותר. באמצעות פרמטר שימור FFF ומשוואות מקדם דיפוזיה סטוקס-איינשטיין, זמן ההעלאה, בהתאמה נפח elution, של מדגם AF4 אז יכול להיות מתורגם ישירות לגודל הידרודינמי שלה22. כאן התנהגות elution המתואר מתייחס למצב elution נורמלי והוא תקף בדרך כלל עבור AF4 בתוך טווח גודל החלקיקים בין כ 1-500 ננומטר (לפעמים עד 2000 ננומטר בהתאם למאפייני חלקיקים ופרמטרים שבר) ואילו elution סטריק-hyperlayer מתרחשת בדרך כלל מעל סף גודל זה25.
קיימות שלוש דרכים נפוצות להפקת מידע גודל לאחר ההפרדה על-ידי FFF. מאז FFF הוא מכשיר מודולרי, זה יכול להיות משולב במורד הזרם עם גלאים מרובים כגון גלאי פיזור אור רגישים לגודל המבוססים על העיקרון של פיזור אור רב זוויתי (MALS)26,27, פיזור אור דינמי (DLS)28,29, או אפילו שילוב של שניהם כדי לקבל מידע צורה נוסף30,31. עם זאת, מאז התנהגות השמירה של מדגם בערוץ FFF נשלטת בדרך כלל על ידי כוחות פיזיים מוגדרים היטב, גודל יכול גם להיות מחושב באמצעות גישה מתמטית (תורת FFF), שבו גלאי ריכוז פשוט (למשל, גלאי UV-vis) מספיק כדי להצביע על נוכחות של מדגם eluting32,33.
כאפשרות שלישית, אנו מדווחים כאן על יישום של כיול גודל חיצוני34,35 באמצעות תקני AuNP מוגדרים היטב בטווח הגודל של 20-100 ננומטר לשינוי גודל של מדגם חלקיקי זהב לא ידוע במתלה באמצעות AF4 בשילוב עם זיהוי UV-vis. מערך ניסיוני פשוט זה נבחר בכוונה כדי לאפשר לכמה שיותר מעבדות להצטרף להשוואה בינלאומית בין-לאומית (ILC), שבוצעה מאוחר יותר במסגרת פרויקט אופק 2020 של האיחוד האירופי ACEnano על סמך הפרוטוקול המוצג כאן.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 &#181;m Membrane Filters (hydrophilic PVDF)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>Z-FIL-TEF-002</td>
			<td>Used for filtration of aqueous solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m PVDF Syringe Filter (d = 33 mm)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>Durapore Millex</td>
			<td>Used for filtration of NovaChem100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable Volume Pipettes (1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>Research Plus</td>
			<td>Used to prepare diluted AuNP suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF4 cartridge</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>AF2000 MF - AF4 Analytical Channel</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF4 Membrane - Regenerated Cellulose (10 kDa MWCO)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>Z-AF4-MEM-612-10KD</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance (0.1 mg precision)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>ENTRIS124I-1S</td>
			<td>Used to weigh SDS and NaOH pellets for preparation of cleaning solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN5300</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Channel Oven</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN4020</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crossflow Module</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>AF2000 MF Control Module</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>ep T.I.P.S</td>
			<td>Used to prepare diluted AuNP suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks (e.g. 2 liter volume)</td>
			<td>neoLab</td>
			<td>1-0199</td>
			<td>Used for eluent storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Focus Pump</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN1131</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>VIA-002</td>
			<td>Used for sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Nanoparticle Size Standards (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>NovaCal Gold</td>
			<td>50 mg L-1 each, used to establish the size calibration function</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>VIBRAX-VXR</td>
			<td>Used to accelerate dissolution of SDS and NaOH pellets in UPW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Personal Computer (PC)</td>
			<td>Dell Technologies</td>
			<td>/</td>
			<td>Unit to control AF4 runs, record and evaluate collected data, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Personal protection gear (gloves, lab coat, glasses etc.)</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>In accordance with respective laboratory&#8217;s safety rules for working with chemicals including engineered nanomaterials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Top for Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>Z-VIA-09150868</td>
			<td>Used for sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), &#8805;99 %, Blotting Grade</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co KG</td>
			<td>2326.1</td>
			<td>Used for the preparation of the cleaning solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH) Pellets, &#8805;98 %, p.a</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co KG</td>
			<td>6771.1</td>
			<td>Used for the preparation of the cleaning solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Package for Control and Data Acquisition</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>NovaFFF AF2000 Software</td>
			<td>Software for performing Af4 runs and data aquisition, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Package for Data Evaluation</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>NovaAnalysis Software</td>
			<td>Software for AF4 data evaluation, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova NovaAnalysis manual</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Package for final Data Processing</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>Origin 2019</td>
			<td>Used for final data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Degasser</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN7520</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Selector</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN7310</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Organizer</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN7140</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfactant Mixture</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>NovaChem100</td>
			<td>Mixture of different surfactants and salts used for eluent preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Pump</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN1130</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unknown AuNP sample</td>
			<td>BBI Solutions</td>
			<td>EM.GC60</td>
			<td>60 nm AuNP sample used for size determination via size calibration function</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-vis Detector</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN3211</td>
			<td>UV-vis detector For downstream coupling with the AF4 system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration Unit</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>Eluent Filtration System</td>
			<td>Used to ensure low particle backgrounds and removal of dissolved air in the used eluents to ensure optimum AF4 fractionation conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>IKA</td>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Used for homogenization of diluted AuNP suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purification System</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>Milli-Q Integral 5</td>
			<td>Used to generate ultrapure water (UPW, 18.2 M&#937;cm resistivity) for preparation of cleaning solution, eluents and dilution of AuNP suspensions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

asymmetrical flow field-flow fractionation for sizing of gold nanoparticles in suspension

גודל החלקיקים הוא ללא ספק הפרמטר הפיזיקו-כימי החשוב ביותר הקשור לרעיון של חלקיק. ידע מדויק של התפלגות גודל וגודל של חלקיקים הוא בעל חשיבות עליונה עבור יישומים שונים. טווח הגודל חשוב גם, שכן הוא מגדיר את המרכיב "הפעיל" ביותר של מינון ננו-חלקיקים.
שבר זרימת זרימה אסימטרי (AF4) היא טכניקה רבת עוצמה לשינוי גודל של חלקיקים בהשעיה בטווח הגודל של כ 1-1000 ננומטר. קיימות מספר דרכים להפיק מידע גודל מניסוי AF4. מלבד צימוד AF4 באינטרנט עם גלאים רגישים לגודל המבוססים על העקרונות של פיזור אור רב זוויתי או פיזור אור דינמי, יש גם את האפשרות לתאם את הגודל של מדגם עם זמן השמירה שלה באמצעות גישה תיאורטית מבוססת היטב (תאוריית FFF) או על ידי השוואתו עם זמני השמירה של תקני גודל חלקיקים מוגדרים היטב (כיול גודל חיצוני).
אנו מתארים כאן את הפיתוח ואת האימות בתוך הארגון של הליך פעולה סטנדרטי (SOP) לשינוי גודל של מדגם חלקיקי זהב לא ידוע על ידי AF4 בשילוב עם זיהוי UV-vis באמצעות כיול גודל חיצוני עם תקני חלקיקי זהב בטווח הגודל של 20-100 ננומטר. הליך זה מספק תיאור מפורט של זרימת העבודה שפותחה כולל הכנת מדגם, הגדרת מכשיר AF4 והסמכה, פיתוח שיטת AF4 ושבר של מדגם חלקיקי זהב לא ידוע, כמו גם את המתאם של התוצאות שהתקבלו עם כיול גודל חיצוני הוקמה. ה- SOP המתואר כאן אומת בסופו של דבר בהצלחה במסגרת מחקר השוואה interlaboratory המדגיש את החוסן והאמינות המצוינים של AF4 לשינוי גודל של דגימות ננו-חלקיקים בהשעיה.

ראשית, תקני גודל AuNP היו מופרדים על ידי AF4 וזוהו על ידי UV-vis מדידת הספיגה של AuNP באורך גל של 532 ננומטר (תהודה פלסמון פני השטח של AuNP). כיסוי של הפרקטוגרמות המתקבלות מוצג באיור 1. זמני השמירה של כל AuNP בשיא UV-vis בהתאמה שלה המרבי המתקבל ממדידות משולשות מפורטים בטבלה 5. סטיית התקן היחסית של כל זמני השמירה הייתה מתחת ל-1.1% עם סטיית מדידה פוחתת עם הגדלת הגודל. בסך הכל הושגה חזרה מצוינת. כוח הפרדה מתמיד הופעל, מה שגרם למערכת יחסים ליניארית של זמן elution וגודל הידרודינמי. קו הכיול של הגודל החיצוני הוקם על-ידי התוויית הרדיוס ההידרודינמי שצוין כנגד זמן הריק המתוקן של זמן ההקצנה (זמן שמירה נטו). ניתוח רגרסיה ליניארית הביא לפונקציית כיול ליניארית עם יירוט a = -3.373 ננומטר ± 1.716 ננומטר ושיפוע b = 1.209 ננומטר∙ מינימום-1 ± 0.055 nm∙min-1. ההתנהגות הליניארית של elution אושרה עם מקדם מתאם בריבוע R2 של 0.9958. פונקציית הכיול המתאימה מוצגת באופן חזותי באיור 2.
החלק השני עסק בניתוח מדגם AuNP לא ידוע. שלושה אלציטוטים של המדגם הוכנו בהתאם לנוהל המתואר בסעיף הפרוטוקול (סעיף 4.2). כל אחד משלושת aliquots נחקר משולש באמצעות אותה שיטת שבר AF4 כי הוחל גם על תקני גודל AuNP. כל תשעת הפרקטוגרמות AF4-UV-vis שהתקבלו מדגם AuNP הלא ידוע מוצגות באיור 3 וההערכות שלהן מסוכמות בטבלה 6. סטיית התקן היחסית של זמני השמירה בהתאמה הייתה נמוכה משמעותית וננועה בין 0.1% ל-0.5%. באמצעות פונקציית כיול גודל החלקיקים המתקבלת מהשבר של תקני הגודל של AuNP ומתאימה אותו עם זמני השמירה המתקבלים של מדגם AuNP הלא ידוע בשיא המרבי של UV-vis, ניתן לחשב רדיוס הידרודינמי ממוצע כולל של 29.4 ננומטר ± 0.2 ננומטר. יתר על כן, התאוששות המונית סבירה של 83.1% ± 1.2% הושגה המציין שום agglomeration משמעותי או פירוק של מדגם AuNP או ספיחה ניכרת של חלקיקים על פני השטח של הממברנה. איור 4 מציג את התפלגות גודל החלקיקים המתקבלת עם כל תשעת עקבות האותות של UV-vis בממוצע המדגישות את החוסן המצוין של שיטת AF4 שהוחלה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig01.jpg"> איור 1: AF4-UV-vis fractograms המתקבלים מניתוח משולש של ארבעת תקני הכיול הבודדים בגודל AuNP עם עוצמות אותות מנורמלות וקצב זרימה צולבת קבוע (קו שחור). שיא החלל מודגש באפור בסביבות 5.9 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61757/61757fig01large.jpg" target="_blank">דקות.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig02.jpg"> איור 2: פונקציית כיול גודל חיצוני שהתקבלה, כולל קווי שגיאה הנגזרים מסטיות התקן המתאימות של מדידות DLS ( טבלה 4 ) ושונות בזמני השמירה המתקבלים של AF4 (טבלה 5), לאחר התוויית הרדיוס ההידרודינמי שצוין כנגד זמן השמירה של כלתקןכיול גודל AuNP בודד בשיאו המרבי. פונקציית כיול ליניארית עם שגיאות סטנדרטיות בצורת y = a + bx עם = -3.373 ננומטר ± 1.716 ננומטר ו- b = 1.209 nm·min-1 ± 0.055 nm·min-1 חושב מניתוח רגרסיה ליניארית. נקבע מקדם מתאם בריבוע עם R2 = 0.9958, המציין קשר גומלין ליניארי. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61757/61757fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig03.jpg"> איור 3: AF4-UV-vis fractograms של מדידות משולשות של שלושה aliquots המציג את AuNP לא ידוע. קצב הזרימה הצולבת הקבוע המוחל לאורך זמן המדידה מאויר כקו שחור. שיא החלל בסביבות 5.9 דקות מודגש באפור. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61757/61757fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig04.jpg"> איור 4: כיסוי של התפלגות גודל החלקיקים הממוצע המתקבל (אדום) של מדגם AuNP לא ידוע ופונקציית הכיול הליניארית המוחלת (קו מנוקד). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61757/61757fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">רכיב</td>
			<td>CAS-לא</td>
			<td>משקל (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">מים</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>88.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">9-Octadecenoic חומצה (Z)-, תרכובת עם 2,2 ',2'-nitrilotris[אתנול](1:1)</td>
			<td>2717-15-9</td>
			<td>3.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">נתרן קרבונט</td>
			<td>497-19-8</td>
			<td>2.7</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">אלכוהול, C12-14 משני, אתוקסילי</td>
			<td>84133-50-6</td>
			<td>1.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">טטרסודיום אדטה</td>
			<td>64-02-8</td>
			<td>1.4</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">פוליאתילן גליקול</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">נתרן אולאט</td>
			<td>143-19-1</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">סודיום ביקרבונט</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: רשימת המרכיבים של תערובת פעילי שטח המשמש להכנת eluent (ראה גם טבלה של חומרים).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>פרמטרי AF4-UV-vis</td>
			<td>יחידת</td>
			<td>ערך</td>
		</tr>
<tr>
<td>עובי מרווח</td>
			<td>מיקרומטר</td>
			<td>350</td>
		</tr>
<tr>
<td>קצב זרימה של גלאי</td>
			<td>mL מינימום-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>קצב זרימה צולבת</td>
			<td>mL מינימום-1
</td>
			<td>0 (קבוע במשך 8 דקות)</td>
		</tr>
<tr>
<td>קצב זרימת מיקוד</td>
			<td>mL מינימום-1
</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>זמן השהיה / זמן ייצוב</td>
			<td>דקות</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>קצב הזרמת הזרקה</td>
			<td>mL מינימום-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>זמן מעבר</td>
			<td>דקות</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>זמן הזרקה</td>
			<td>דקות</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>שלב אלויון</td>
			<td>דקות</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>זמן שלב שטיפה</td>
			<td>דקות</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>שטף את קצב זרימת הצעדים</td>
			<td>mL מינימום-1
</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>נפח הזרקה</td>
			<td>μL (μL)</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>ריכוז דגימה</td>
			<td>מ"גL-1
</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>סוג ממברנה</td>
			<td></td>
			<td>תאית מחדש</td>
		</tr>
<tr>
<td>ממברנה מולקולרית משקל מנותק</td>
			<td>kDa</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>אלונט (שני)</td>
			<td></td>
			<td>תערובת פעילי שטח 0.025% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>אורך גל UV-vis</td>
			<td>ננומטר</td>
			<td>532</td>
		</tr>
<tr>
<td>רגישות UV-vis</td>
			<td>-</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: סיכום הפרמטרים של שיטת השבר AF4-UV-vis כדי לבצע את ריצת ההזרקה הישירה ללא יישום של כוח הפרדה.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>פרמטרי AF4-UV-vis</td>
			<td>יחידת</td>
			<td>ערך</td>
		</tr>
<tr>
<td>עובי מרווח</td>
			<td>מיקרומטר</td>
			<td>350</td>
		</tr>
<tr>
<td>קצב זרימה של גלאי</td>
			<td>mL מינימום-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>קצב זרימה צולבת</td>
			<td>mL מינימום-1
</td>
			<td>1 (קבוע 60 דקות, 10 דקות ליניארי)</td>
		</tr>
<tr>
<td>קצב זרימת מיקוד</td>
			<td>mL מינימום-1
</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>זמן השהיה / זמן ייצוב</td>
			<td>דקות</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>קצב הזרמת הזרקה</td>
			<td>mL מינימום-1
</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>זמן מעבר</td>
			<td>דקות</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>זמן הזרקה</td>
			<td>דקות</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>שלב אלויון</td>
			<td>דקות</td>
			<td>70 (קבוע 60 דקות, 10 דקות ליניארי)</td>
		</tr>
<tr>
<td>שלב שטיפה</td>
			<td>דקות</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>שטף את קצב זרימת הצעדים</td>
			<td>mL מינימום-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>נפח הזרקה</td>
			<td>μL (μL)</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>ריכוז דגימה</td>
			<td>מ"גL-1
</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>סוג ממברנה</td>
			<td></td>
			<td>תאית מחדש</td>
		</tr>
<tr>
<td>ממברנה מולקולרית משקל מנותק</td>
			<td>kDa</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>אלונט (שני)</td>
			<td></td>
			<td>תערובת פעילי שטח 0.025% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>אורך גל UV-vis</td>
			<td>ננומטר</td>
			<td>532</td>
		</tr>
<tr>
<td>רגישות UV-vis</td>
			<td>-</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 3: סיכום הפרמטרים של שיטת השבר AF4-UV-vis כדי לבצע את ריצת השבר עם יישום של זרימה צולבת ככוח הפרדה.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>תקן כיול</td>
			<td>סוכן מכסה</td>
			<td>גודל ממוצע (TEM) (nm)</td>
			<td>קורות חיים (גודל ממוצע TEM) (%)</td>
			<td>זטה פוטנציאל (mV)</td>
			<td>SD (פוטנציאל זטה) (mV)</td>
			<td>רדיוס הידרודינמי (DLS) (nm)</td>
			<td>SD (רדיוס הידרודינמי) (nm)</td>
			<td>PDI</td>
			<td>SD (PDI)</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 20 ננומטר</td>
			<td>ציטראט (ציטראט)</td>
			<td>20.1</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-48.9</td>
			<td>1.5</td>
			<td>10.95</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0.082</td>
			<td>0.009</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 40 ננומטר</td>
			<td>ציטראט (ציטראט)</td>
			<td>40.8</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-30.4</td>
			<td>1.0</td>
			<td>20.30</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0.127</td>
			<td>0.006</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 80 ננומטר</td>
			<td>ציטראט (ציטראט)</td>
			<td>79.2</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-51.5</td>
			<td>1.3</td>
			<td>38.85</td>
			<td>0.23</td>
			<td>0.138</td>
			<td>0.013</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 100 ננומטר</td>
			<td>ציטראט (ציטראט)</td>
			<td>102.2</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-50.9</td>
			<td>0.9</td>
			<td>52.30</td>
			<td>0.37</td>
			<td>0.078</td>
			<td>0.009</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 4: סיכום הפרמטרים הפיזיו-כימיים של תקני הכיול החלים של AuNP, כולל סוכן מכסה, גודל ממוצע של TEM, פוטנציאל זטה שנקבע בהשעיה המקורית, כמו גם רדיוס הידרודינמי של DLS, ומדד פולידיספרסיטי (PDI) שנקבע בהשעיה האמידה.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>תקן כיול</td>
			<td>להפעיל</td>
			<td>זמן שמירה בשיא מרבי (מינימום)</td>
			<td>זמן שמירה נטו בשיא מרבי (מינימום)</td>
			<td>זמן שמירה נטו ממוצע (מינימום)</td>
			<td>SD (%) (זמן שמירה נטו)</td>
			<td>SD (מינימום) (זמן שמירה נטו)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 20 ננומטר</td>
			<td>1</td>
			<td>17.368</td>
			<td>11.468</td>
			<td rowspan="3">11.56</td>
			<td rowspan="3">1.02</td>
			<td rowspan="3">0.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>17.409</td>
			<td>11.509</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>17.589</td>
			<td>11.689</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 40 ננומטר</td>
			<td>1</td>
			<td>25.316</td>
			<td>19.416</td>
			<td rowspan="3">19.49</td>
			<td rowspan="3">0.68</td>
			<td rowspan="3">0.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>25.32</td>
			<td>19.42</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>25.548</td>
			<td>19.648</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 80 ננומטר</td>
			<td>1</td>
			<td>42.095</td>
			<td>36.195</td>
			<td rowspan="3">36.29</td>
			<td rowspan="3">0.23</td>
			<td rowspan="3">0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>42.219</td>
			<td>36.319</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>42.257</td>
			<td>36.357</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 100 ננומטר</td>
			<td>1</td>
			<td>50.975</td>
			<td>45.075</td>
			<td rowspan="3">45.06</td>
			<td rowspan="3">0.07</td>
			<td rowspan="3">0.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>50.924</td>
			<td>45.024</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>50.986</td>
			<td>45.086</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 5: זמני השמירה של תקני הכיול של AuNP בשיא UV-Vis בהתאמה נגזרו מהפרקטוגרמות המתאימות של AF4-UV-vis בשיטה המתוארת בטבלה 3.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>אלציטוטה</td>
			<td>להפעיל</td>
			<td>זמן שמירה מרבי (מינימום)</td>
			<td>זמן שמירה ממוצע בשיא מרבי (מינימום)</td>
			<td>זמן שמירה נטו בשיא מרבי (מינימום)</td>
			<td>SD (%) זמן שמירה</td>
			<td>רדיוס הידרודינמי (nm)</td>
			<td>שחזור (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1</td>
			<td>1</td>
			<td>32.689</td>
			<td rowspan="3">32.70</td>
			<td>26.789</td>
			<td rowspan="3">0.07</td>
			<td rowspan="3">29.03</td>
			<td rowspan="3">85.34</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>32.687</td>
			<td>26.787</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>32.719</td>
			<td>26.819</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">2</td>
			<td>1</td>
			<td>32.989</td>
			<td rowspan="3">33.08</td>
			<td>27.089</td>
			<td rowspan="3">0.37</td>
			<td rowspan="3">29.49</td>
			<td rowspan="3">81.73</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>33.073</td>
			<td>27.173</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>33.187</td>
			<td>27.287</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">3</td>
			<td>1</td>
			<td>33.053</td>
			<td rowspan="3">33.14</td>
			<td>27.153</td>
			<td rowspan="3">0.49</td>
			<td rowspan="3">29.56</td>
			<td rowspan="3">82.14</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>33.071</td>
			<td>27.171</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>33.291</td>
			<td>27.391</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 6: סיכום זמני השמירה במקסימום השיא של UV-Vis בהתאמה, הרדיוס ההידרודינמי שחושב מכייל הגודל החיצוני (איור 2) וקצב ההחלמה של דגימת AuNP הלא ידועה המתקבלת מניתוח AF4-UV-vis.

Watch this Scientific Journal Video about Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension at JoVE.com

Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בשבר שדה זרימה-זרימה אסימטרי בשילוב עם זיהוי UV-vis לקביעת הגודל של מדגם חלקיקי זהב לא ידוע.

שבר זרימה א-סימטרי שדה זרימה לשינוי גודל של חלקיקי זהב בהשעיה

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and ...

asymmetrical-flow-field-flow-fractionation-for-sizing-gold

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.1K Views.  Postnova Analytics GmbH. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בשבר שדה זרימה-זרימה אסימטרי בשילוב עם זיהוי UV-vis לקביעת הגודל של מדגם חלקיקי זהב לא ידוע.

Video: Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion fluxes at the cellular level are required for initiating action potentials in excitable cells.2 Sodium regulation plays an important role in both of these cases; however, no method currently exists for continuously monitoring sodium levels in vivo 3 and intracellular sodium probes 4 do not provide similar detailed results as calcium probes. In an effort to fill both of these voids, fluorescent nanosensors have been developed that can monitor sodium concentrations in vitro and in vivo.5,6 These sensors are based on ion-selective optode technology and consist of plasticized polymeric particles in which sodium specific recognition elements, pH-sensitive fluorophores, and additives are embedded.7-9 Mechanistically, the sodium recognition element extracts sodium into the sensor. 10 This extraction causes the pH-sensitive fluorophore to release a hydrogen ion to maintain charge neutrality within the sensor which causes a change in fluorescence. The sodium sensors are reversible and selective for sodium over potassium even at high intracellular concentrations.6 They are approximately 120 nm in diameter and are coated with polyethylene glycol to impart biocompatibility. Using microinjection techniques, the sensors can be delivered into the cytoplasm of cells where they have been shown to monitor the temporal and spatial sodium dynamics of beating cardiac myocytes.11 Additionally, they have also tracked real-time changes in sodium concentrations in vivo when injected subcutaneously into mice.3 Herein, we explain in detail and demonstrate the methodology for fabricating fluorescent sodium nanosensors and briefly demonstrate the biological applications our lab uses the nanosensors for: the microinjection of the sensors into cells; and the subcutaneous injection of the sensors into mice.

Fluorescent nanoparticles produced in our lab are used for imaging ion concentrations and ion fluxes in biological systems such as cells during signaling and interstitial fluid during physiological homeostasis.

חלקיקים ניאון למדידה של ריכוז יון במערכות ביולוגיות

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

ניתוח הפנמה נייד של חלקיקים וחיידקים על ידי Cytometry Multi-Flow דימות ספקטרלי

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

חלקיקים נגיפיים עבור<em&gt; בחי</em&gt; הדמית גידול

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

הערכת משלוח גן פולימרית חלקיקים על ידי Nanoparticle מעקב ניתוח וזרימת cytometry תפוקה גבוהה

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, biomedical device coatings, and drug delivery tools. Nanoporous gold (np-Au), produced by a nano-scale self-assembly process, is a relatively new material that exhibits large effective surface area, high electrical conductivity, and catalytic activity. These properties have made np-Au an attractive material to scientific community. Most studies on np-Au employ macro-scale specimens and focus on fundamental science of the material and its catalytic and sensor applications. The macro-scale specimens limit np-Au's potential in miniaturized systems, including biomedical devices. In order to address these issues, we initially describe two different methods to micropattern np-Au thin films on rigid substrates. The first method employs manually-produced stencil masks for creating millimeter-scale np-Au patterns, while the second method uses lift-off photolithography to pattern sub-millimeter-scale patterns. As the np-Au thin films are obtained by sputter-deposition process, they are compatible with conventional microfabrication techniques, thereby amenable to facile integration into microsystems. These systems include electrically-addressable biosensor platforms that benefit from high effective surface area, electrical conductivity, and gold-thiol-based surface bioconjugation. We describe cell culture, immunostaining, and image processing techniques to quantify np-Au's interaction with mammalian cells, which is an important performance parameter for some biosensors. We expect that the techniques illustrated here will assist the integration of np-Au in platforms at various length-scales and in numerous applications, including biosensors, energy storage systems, and catalysts.

We report on techniques to micropattern nanoporous gold thin films via stencil printing and photolithography, as well as methods to culture cells on the microfabricated patterns. In addition, we describe image analysis methods to characterize morphology of the material and the cultured cells using scanning electron and fluorescence microscopy techniques.

Microfabrication של דפוסי זהב Nanoporous לסלולרי מהותי מחקרי אינטראקציה

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation nanoparticles (HNPs). The latter are a new family of probes recently introduced for labeling biological samples for multi-photon imaging. HNPs are capable of doubling the frequency of excitation light by the nonlinear optical process of second harmonic generation with no restriction on the excitation wavelength.
Multi-photon based methodologies for hESC differentiation into cardiac clusters (maintained as long term air-liquid cultures) are presented in detail. In particular, evidence on how to maximize the intense second harmonic (SH) emission of isolated HNPs during 3D monitoring of beating cardiac tissue in 3D is shown. The analysis of the resulting images to retrieve 3D displacement patterns is also detailed.

Protocol details are provided for in vitro labeling human embryonic stem cells with second harmonic generating nanoparticles. Methodologies for hESC investigation by multi-photon microscopy and their differentiation into cardiac clusters are also presented.

הרמוני חלקיקים למחקר הרגנרציה

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

כימות של פונקציה הגלובלית הדיאסטולי על ידי ניתוח המבוסס על דוגמנות Kinematic של Transmitral זרימה באמצעות הפורמליזם מילוי Parametrized הדיאסטולי

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

מוצקים שומנים חלקיקים (SLNs) אפליקציות לתאיות מיקוד

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

ייצור של חלקיקי מתכת על ידי פעימה לייזר ablation בנוזלים: כלי לחקר מאפיינים אנטיבקטריאליים של חלקיקים

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Protein Kinase C-delta Inhibitor Peptide Formulation using Gold Nanoparticles

Protein kinase C-delta inhibitor (PKC&#948;i) is a promising drug to prevent ischemia-reperfusion-induced organ injury. It is usually conjugated to a cell-penetrating peptide, TAT, for intracellular delivery. However, TAT has shown non-specific biological activities. Gold nanoparticles (GNPs) can be used as drug delivery carriers without recognized toxicity. Therefore, we have used a GNP/peptide hybrid to deliver PKC&#948;i. Two short peptides (P2: CAAAAE and P4: CAAAAW), at a 95:5 ratio, were used to modify the surface properties of GNP. GNPs conjugated with PKC&#948;i (GNP/PKCi) are stable in distilled water, 0.9% NaCl, and phosphate-buffered saline (PBS) containing bovine serum albumin or fetal bovine serum. Intravenous injection of GNP-PKCi was previously shown to prevent ischemia-reperfusion injury of the lung. This article outlines a protocol to formulate GNP/PKCi and assess the physiochemical properties of GNP/PKCi. We have used similar methods to formulate other peptide-based drugs with GNP. This article will hopefully draw more attention to this novel intracellular drug delivery technology and its applications in vivo.

We have previously used a gold nanoparticle peptide hybrid to intravenously deliver a synthetic peptide, protein kinase C-delta inhibitor, which reduced ischemia-reperfusion-induced acute lung injury. Here we show the detailed protocol of the drug formulation. Other intracellular peptides can be formulated similarly.

חלבון קינאז C-דלתא מעכב פפטיד ניסוח באמצעות חלקיקי זהב

Protein kinase C-delta inhibitor (PKC&#948;i) is a promising drug to prevent ischemia-reperfusion-induced organ injury. It is usually conjugated to a ...