Research reported in this publication was supported by The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory&#8217;s Research and Exploratory Development Department, Office of Technology Transfer, and Stuart S. Janney Fellowship Program, in addition to the National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health under Award Number R21HL127355.

1. עיבוד של SLNs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינתזה של SLNs הערה: השתמש בשיטת PIT 1,17,20 להכין 20 תת-SLNs ננומטר 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בטכניקה מזוהמת, bioreagents או ריאגנטים כיתה תרבית תאים, וחומרי סטרילי (כלומר, טפטפות, מריות, בקבוקונים, וכו &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בארון בטיחות ביולוגית לסינתזה של SLNs (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב 0.6 מ&quot;ג של צבע פלואורסצנטי (הנילוס אדום (ניר), ריכוז הניר הוא כ 0.3 מ&quot;ג / מיליליטר) ו0.10 גרם של Heneicosane (שומנים בדם, 5 WT% WT ריכוז שומנים בדם /) לתוך בקבוקון (15 מיליליטר), שיתוף להמס ב 90 מעלות צלזיוס, ומערבבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף polyoxyethylene 0.11 גר &#39;(10) אתר oleyl (פעיל שטח, 5.5% WT ריכוז חומרים פעילי שטח WT /). שיתוף להמס את התערובת וכתוצאה מכך על 90 מעלות צלזיוס ומערבבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1.79 גרם של מים סטריליים לתערובת, החום עד 90 מעלות צלזיוס, ומערבבים עד שnanoemulsion שקוף נוצר. שים לב: תחת ערבוב המשיך וקירור מבוקר, SLNS נוצרים. תנאים אלה גורמים היפוך של תחליב מים בשמן לתחליב שמן ב-מים. מולקולות lipophilic כגון מחיצת NiR לטיפי שומנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן nanoemulsion במקביל מבלי להוסיף צבע הניאון, כדי לשמש דוגמא שליטה. שלב 0.10 גרם של Heneicosane ו0.11 polyoxyethylene גרם (10) אתר oleyl לתוך בקבוקון (15 מיליליטר) שיתוף להמיס על 90 מעלות צלזיוס, ומערבבים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1.79 גרם של מים סטריליים לתערובת, החום עד 90 מעלות צלזיוס, ומערבבים עד שnanoemulsion שקוף נוצר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוסף לעקר כל nanoemulsion באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר סטרילי. </li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53102/53102fig2.jpg" /> איור 2. סכמטי של סינתזה של SLNs. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53102/53102fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גודל חלקיקים ופולydispersity <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפיזור אור דינמי (DLS) כדי למדוד את גודל החלקיקים וpolydispersity של SLNs 1 באמצעות קובט זכוכית וכלי שנועד למדוד את גודל חלקיקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני המדידות של הדגימות, למדוד את גודל החלקיקים של שני סטנדרטים ידועים הבאים הפרוטוקול של היצרן לעריכה ולמדידת הסטנדרטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את קובט הזכוכית עם 1.5 מיליליטר של תמיסה סטנדרטית ולמדוד את הפתרון הסטנדרטי באמצעות אותם תנאי המדידה כדוגמאות. הערה: הצעד קודם חזר על עצמו עבור כל תקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הדגימות כפי שהוכן. לכל אחד, להשתמש בפרמטרים של הניסוי הבא: זמן ריצה של 100 שניות, מקדם שבירה של מים (1.33), צמיגות של מים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס (1.002 שניות · MPA). הערה: טכניקה זו משתמשת בתדירות השתנתה אור כדי למדוד את הגודל של חלקיקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דווח הקוטר הממוצע של החלקיקים וpolydispersity של Partiהתפלגות גודל CLE. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקודת התכה וכמוסה חום של התכה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בקלורימטר סריקת ההפרש (DSC) מצויד ברכב-סמפלר ומקור קירור חנקן נוזלי כדי לחקור את התנהגות התרמית של SLNs 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה SLNs המוכן כמו למחבת אלומיניום 40 μl עם מסה של כ 25 מ&quot;ג והרמטית לאטום את המחבת באמצעות עיתונות crimper אוניברסלית כדי להקטין את איבוד לחות במהלך סריקת DSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד כל nanoemulsion 5-80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דווח על נקודת ההתכה והחום הכמוס של היתוך מעלילת DSC, שבו העמק מייצג את נקודת ההתכה ונפרדת מהשטח מתחת לעקומה בעלילת DSC מחולקת בכמות החומר מייצגים את החום הכמוס של היתוך. </li></ol></li></ol> אינטראקציה 2. SLNs עם fibroblasts ותאים דנדריטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות של fibroblasts האדם היסודי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> fi האנושי ראשוני התרבותbroblasts לפי הוראות היצרן במדיום נוזלי לתרבות של fibroblasts אדם עורי (הבינוני 106), בתוספת ערכת תוספת צמיחה בסרום הנמוכה (LSGS). שמור על תאים באווירת humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ותת-תרבות עם הגעת מפגש 80%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור שני MTT וניתוח הדמיה, תאי זרע בצלחת 96-היטב, בצפיפות של 2 x 10 4 תאים לכל גם, ולאפשר לאזן ב 37 CO ° / N לפני חשיפת בלוטת זקיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן אפס, לדלל SLNs במדיום מלא כפי שצוין (איור 4), ביחס לריכוז שומנים בדם, ולהוסיף 10 μl לכל גם לכל לשכפל גם בצלחת 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, בתקופת הדגירה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MTT הרעילות Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות של דגירה עם SLNs, לקבוע כדאיות סלולרית באמצעות assay MTT, על פי הפרוטוקול של היצרן. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את תאי פעם אחת ולהוסיף בינוני טרי היטב כל אחד (100 μl / טוב). הרוג בארות שליטה על ידי דוגרים בפתרון מתנול 70% במשך 10 דקות לפני החלפה עם מדיום חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף מגיב MTT (10 μl לכל גם) היטב בכל microplate דגירה O / N על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה O / N, solubilize גבישים תאיים formazin עם תמיסת הניקוי סיפקה (לכל גם 100 μl) על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 3 שעות של דגירה על RT, לקבל ערכי הספיגה באורך גל של 570 ננומטר מדידה באמצעות קורא microplate. מגיב MTT משמש צריך להיות פחות מ 1% (w / v) 3 (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2 ברומיד, 5-diphenyl-tetrazolium: הערה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ פלואורסצנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודות זמן ספציפיות הבאות מינון של fibroblasts עם בלוטות זקיף, לשטוף את fibroblasts פעמיים עם תמיסת מלח סטרילית פוספט (PBS) ולתקן במשך 10 דקות עם מתנול 70% קרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10 דקות, להחליף את מתנול עם PBS וללכוד תמונות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה, באמצעות לעבור להקה (BP) 690/50 ננומטר מערכת סינון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות של תאי עכבר מח עצם דנדריטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום לתאי עצם עכבר נגזר מח הדנדריטים (BMDC) כפי שתוארו לעיל 23,24. בקצרה, השעיות תא בודד צלחת של C57BL מח עצם / 10 ב 100 מ&quot;מ צלחות פטרי ב 2 x 10 6 / צלחת עם הגורם מגרה מושבה רקומביננטי עכברי granulocyte-מקרופאג (GM-CSF, 300 U / ml) ועכברי רקומביננטי IL-4 (ב תא גירוי גורם, 200 U / ml). שינוי תקשורת בכל 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 7, להוסיף SLNs הטעון-ניר למאכלים בריכוז סופי של 0.5 ו 5.0 מיקרוגרם / מיליליטר שומנים בדם ולשמור על התאים ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור לאורך הרצוי של חשיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים מהמנות על ידי aspirating כל אמצעי התקשורת בצלחת, לגבות אותו בצינור 50 מיליליטר, ואחרי שטיפה יסודית של הצלחת (כדי לסלק את המודעה באופן רופףתאי Herent) עם 5 מיליליטר של תמיסת מלח שנאגרו פוספט (PBS) המכיל 4 מ&quot;מ חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA). אסוף את ההשעיה התא שהושגה באותו הצינור 50 מיליליטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכה של SLNs התאגדות באמצעות cytometry הזרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הריכוז של ההשעיה התא שהושגה בנקודת 2.4.3 ולהפיץ 3x10 5 תאים לתחתית עגולה צינור FACS 12 מ&quot;מ x 75 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים על ידי הוספת 1 מיליליטר של PBS ולאחר מכן צנטריפוגה הצינורות במשך 5 דקות ב 400 XG, בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend גלולה עם של PBS / 2 / 0.1% אלבומין בסרום שור mM EDTA 100 μl (BSA) (חיץ מכתים) המכיל נוגדנים חד שבטיים נגד CD11c-FITC (סופי 0.25 מיקרוגרם / מיליליטר). דגירה של 30 דקות על קרח בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם 1 מיליליטר של PBS ואז צנטריפוגות הצינורות במשך 5 דקות ב 400 XG, בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend כלגלולה עם 400 μl של חיץ מכתים. התאים מוכנים לרכישת הדגימות עם cytometer זרימה (אולי מצויד בלייזרים כחולים ואדום) עכשיו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות cytometry זרימת תוכנת ניתוח, להעריך את רמת התאגדות של SLNs ידי DC על ידי gating על האוכלוסייה של CD11c תאים + (FITC חיובי) ולהשוות את עוצמת הקרינה הקשורים SLNs (נמדדה בערוצי PerCP-Cy5.5 או APC). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Calderon-Colon, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+sub-10+nm+solid+lipid+nanoparticles+for+topical+and+biomarker+detection+applications.">Synthesis of sub-10 nm solid lipid nanoparticles for topical and biomarker detection applications.</a> J Nanopart Res. 16 (2252), 1-10 (2014).</li><li>Patwekar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+nanoparticles+used+in+cosmetics+and+dermal+products.">Review on nanoparticles used in cosmetics and dermal products.</a> World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 3 (8), 1407-1421 (2014).</li><li>Martins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+lipid+nanoparticles+as+intracellular+drug+transporters:+An+investigation+of+the+uptake+mechanism+and+pathway.">Solid lipid nanoparticles as intracellular drug transporters: An investigation of the uptake mechanism and pathway.</a> International Journal of Pharmaceutics. 430, 216-227 (2012).</li><li>Yadav, N., Khatak, S., Sara, U. V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+Lipid+Nanoparticles+-+A+Review.">Solid Lipid Nanoparticles - A Review.</a> International Journal of Applied Pharmaceuticals. 5 (2), 8-18 (2013).</li><li>Weber, S., Zimmer, A., Solid Pardeike, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Nanoparticles+(SLN)+and+Nanostructured+Lipid+Carriers+(NLC)+for+pulmonary+application:+a+review+of+the+state+of+the+art.">Lipid Nanoparticles (SLN) and Nanostructured Lipid Carriers (NLC) for pulmonary application: a review of the state of the art.</a> Eur J Pharm Biopharm. 86 (1), 7-22 (2014).</li><li>Mahajan, A., Kaur, S., Grewal, N. K., Kaur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+Lipd+Nanoparticles+(SLNs)+-+As+Novel+Lipd+based+Nanocarriers+for+Drugs.">Solid Lipd Nanoparticles (SLNs) - As Novel Lipd based Nanocarriers for Drugs.</a> International Journal of Advanced Research. 2 (1), 433-441 (2014).</li><li>Buse, J., El-Aneed, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties,+engineering+and+applications+of+lipid-based+nanoparticle+drug-delivery+systems:+current+research+and+advances.">Properties, engineering and applications of lipid-based nanoparticle drug-delivery systems: current research and advances.</a> Nanomedicine (Lond). 5, 1237-1260 (2010).</li><li>Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+and+nanoparticles:+nanosized+vehicles+for+drug+delivery+in+cancer.">Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer.</a> Trends Pharmacol Sci. 30 (11), 592-599 (2009).</li><li>Lim, S. B., Banerjee, A., Onyuksel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+drug+safety+by+the+use+of+lipid-based+nanocarriers.">Improvement of drug safety by the use of lipid-based nanocarriers.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 163, 34-45 (2012).</li><li>Ali Khan, A., Mudassir, J., Mohtar, N., Darwis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+drug+delivery+to+the+lymphatic+system:+lipid-based+nanoformulations.">Advanced drug delivery to the lymphatic system: lipid-based nanoformulations.</a> International journal of nanomedicine. 8, 2733-2744 (2013).</li><li>Oussoren, C., Storm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+to+target+the+lymphatics+by+subcutaneous+administration.">Liposomes to target the lymphatics by subcutaneous administration.</a> Advanced drug delivery reviews. 50, 143-156 (2001).</li><li>Shang, L., Nienhaus, K., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+nanoparticles+interacting+with+cells:+size+matters.">Engineered nanoparticles interacting with cells: size matters.</a> J Nanobiotechnology. 12, 5 (2014).</li><li>Joshi, M. D., Muller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanoparticles+for+parenteral+delivery+of+actives.">Lipid nanoparticles for parenteral delivery of actives.</a> European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.V. 71, 161-172 (2009).</li><li>Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micellar+nanocarriers:+pharmaceutical+perspectives.">Micellar nanocarriers: pharmaceutical perspectives.</a> Pharmaceutical research. 24, 1-16 (2007).</li><li>Ashley, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+targeted+delivery+of+multicomponent+cargos+to+cancer+cells+by+nanoporous+particle-supported+lipid+bilayers.">The targeted delivery of multicomponent cargos to cancer cells by nanoporous particle-supported lipid bilayers.</a> Nature materials. 10, 389-397 (2011).</li><li>Patchan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotech;+Nanotechnology+2013:+Bio+Sensors+Instruments,+Medical,+Environment+and+Energy;+Chapter+3:+Materials+for+Dru.,+and+Gene+Delivery.">Nanotech; Nanotechnology 2013: Bio Sensors Instruments, Medical, Environment and Energy; Chapter 3: Materials for Dru., and Gene Delivery.</a> Nanobandage for controlled release of topical therapeutics. 3, 255-258 (2013).</li><li>Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., C, S., Koutsoukos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+stability+of+nano-emulsions+in+mixed+nonionic+surfactant+systems.+Trends+in+colloid+and+interface+science+XV.">Formation and stability of nano-emulsions in mixed nonionic surfactant systems. Trends in colloid and interface science XV.</a> Progress in Colloid and Polymer Science. 118, 184-189 (2001).</li><li>Nantarat, T., Chansakaow, S., Leelapornpisid, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization,+characterization+and+stability+of+essential+oils+blend+loaded+nanoemulsions+by+PIC+technique+for+anti-tyrosinase+activity.">Optimization, characterization and stability of essential oils blend loaded nanoemulsions by PIC technique for anti-tyrosinase activity.</a> International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 7, 308-312 (2015).</li><li>Sevcikova, P., Vltavska, P., Kasparkova, V., Formation Krejci, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+Stability+of+Nanoemulsions+Prepared+by+Phase+Inversion.">Characterization and Stability of Nanoemulsions Prepared by Phase Inversion.</a> , 132-137 (2011).</li><li>Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., Solans, C., Buckin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+relation+between+phase+behavior+and+emulsification+methods+with+nanoemulsion+formation.+Trends+in+colloid+and+interface+science+XIV.">Studies of the relation between phase behavior and emulsification methods with nanoemulsion formation. Trends in colloid and interface science XIV.</a> Progress in Colloid and Polymer Science. 115, 36-39 (2000).</li><li>Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., Solans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+nano-emulsions+by+low-energy+emulsification+methods+at+constant+temperature.">Formation of nano-emulsions by low-energy emulsification methods at constant temperature.</a> Langmuir. 17 (7), 2076-2083 (2001).</li><li>Cabone, C., Tomasello, B., Ruozi, B., Renis, M., Puglisi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+optimization+of+PIT+solid+lipid+nanoparticles+via+statistical+factorial+design.">Preparation and optimization of PIT solid lipid nanoparticles via statistical factorial design.</a> Eur J Med Chem. 49, 110-117 (2012).</li><li>Raimondi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Target+of+Rapamycin+Inhibition+and+Alloantigen-Specific+Regulatory+T+Cells+Synergize+To+Promote+Long-Term+Graft+Survival+in+Immunocompetent+Recipients.">Mammalian Target of Rapamycin Inhibition and Alloantigen-Specific Regulatory T Cells Synergize To Promote Long-Term Graft Survival in Immunocompetent Recipients.</a> J Immunol. 184, 624-636 (2010).</li><li>Jhunjhunwala, S., Raimondi, G., Thomson, A. W., Little, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+rapamycin+to+dendritic+cells+using+degradable+microparticles.">Delivery of rapamycin to dendritic cells using degradable microparticles.</a> J Control Release. 133 (13), 191-197 (2009).</li><li>Kapse-Mistry, S., Govender, T., Srivastava, R., Yergeri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodrug+delivery+in+reversing+multidrug+resistance+in+cancer+cells..">Nanodrug delivery in reversing multidrug resistance in cancer cells..</a> Front Pharmacol. 5 (159), 1-22 (2014).</li><li>Musacchio, T., Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+lipid-based+pharmaceutical+nanocarriers.">Recent developments in lipid-based pharmaceutical nanocarriers.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 1 (16), 1388-1412 (2011).</li><li>Cerpnjak, K., Zvonar, A., Ga&#353;perlin, M., Vre&#269;er, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-based+systems+as+a+promising+approach+for+enhancing+the+bioavailability+of+poorly+water-soluble+drugs).">Lipid-based systems as a promising approach for enhancing the bioavailability of poorly water-soluble drugs).</a> Acta Pharm. 63 (4), 27-445 (2013).</li><li>Rodr&#236;guez-Gasc&#242;n, A., Pozo-Rodr&#236;guez, A., Solin&#236;s, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+nucleic+acid+vaccines:+use+of+self-amplifying+RNA+in+lipid+nanoparticles.">Development of nucleic acid vaccines: use of self-amplifying RNA in lipid nanoparticles.</a> Int J Nanomedicine. 9, 1833-1843 (2014).</li><li>Almeida, A. J., Souto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+lipid+nanoparticles+as+a+drug+delivery+system+for+peptides+and+proteins.">Solid lipid nanoparticles as a drug delivery system for peptides and proteins.</a> Adv Drug Deliv Rev. 59, 478-490 (2007).</li><li>Pardeshi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+lipid+based+nanocarriers:+an+overview.">Solid lipid based nanocarriers: an overview.</a> Acta Pharm. 62, 433-472 (2012).</li><li>Attama, A. A., Momoh, M. A., Builders, P. F., Sezer, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Nanoparticulate+Drug+Delivery+Systems:+A+Revolution+in+Dosage+Form+Design+and+Development.">Lipid Nanoparticulate Drug Delivery Systems: A Revolution in Dosage Form Design and Development.</a> Recent Advances in Novel Drug Carrier Systems. , 107-140 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

במחקר זה, הסינתזה של SLNs ותחולתם ליישומי מיקוד תאיים נחקרו. חלקיקים ביולוגית אלה הראו הבטחה ככלי רכב משלוח עבור יישומים רבים, כולל משלוח סמים, השתקת גנים, וטכנולוגיות חיסון 25-30. SLNs קטן במיוחד היו מסונתז באמצעות תהליך קליל, ויחסי הגומלין שלהם עם תאי עור עיקריים ותאים חיסוניים ראשוניים נחקרו. SLNs נועד כוללת אנקפסולציה של צבע פלואורסצנטי (ניר), ששימש כמטען טיפולי מודל. שיטת PIT הועסקה לסנתז בלוטות זקיף ואת המאפיינים וכתוצאה מכך חלקיקים (גודל חלקיקים, polydispersity, נקודת התכה, וסמוי חום של היתוך) הוערכו באמצעות פיזור אור דינאמי וסריקת calorimetry ההפרש. גודל חלקיקים וניתוח polydispersity חשפו את הסינתזה של SLNs קטן במיוחד עם polydispersity הצר, אידיאלי למטרה תאיתיישומי ing. כפי שדווח בעבר, גודל חלקיקים יכול לשחק תפקיד חשוב באינטראקציות הסלולר 12. הגודל של חלקיקים הוכח להיות השפעה דרמטית, המשפיע על יעילות ספיגה, בחירת מסלול הפנמה, לוקליזציה תאית, ורעיל 12. חלק מהמגמות הכללית ביחס לאינטראקציות תא-ננו-חלקיקים מתועדים בספרות כולל: גודל קריטי יכול להשתנות עם מאפייני סוג התא ופני שטח של חלקיקים, ויש לי חלקיקים קטנים הסתברות גבוהה יותר ליופנם על ידי פסיבי עד-לקחת יותר גדולים אלה 12 . ניתוח תרמי של החלקיקים במחקר זה גילה רמת crystallinity (כלומר, חום כמוס של היתוך) בין SLNs השליטה ואלה עמוסים בצבע NiR שונה. Crystallinity של SLNs ירד בשל התוספת של צבע הניאון, אשר משמש כטומאה. Crystallinity של מערכת המסירה הטיפולית הוכח bדואר גורם חשוב שמשפיע על המשלוח והמנה 31. ירידה בcrystallinity של רכב בלוטת הזקיף יכולה להשפיע פרמטרים כגון קיבולת טעינה טיפולית וקינטיקה שחרור תרופת 31. שיטת PIT היא טכניקה עדינה יותר סינתזה בהשוואה לשיטות אחרות, עם ההגבלה שרק תרופות lipophilic ניתן לשלב חלקיקים. למרות מגבלה זו, SLNs מסונתז בשיטה זו היא ביולוגית מאוד, מה שהופך את פלטפורמת אספקה ​​לאחר מכן מתאימה ליישומים רבים במחקר ביו-רפואי. ההשפעות של אינטראקציה בלוטת זקיף על כדאיות פיברובלסטים עור אנושית נותחו באמצעות assay MTT. ירידה תלויה-מינון בכדאיות נצפתה עם עלייה בריכוזים של בלוטות זקיף. במהלך סינתזת בלוטת זקיף, חלקיקי השומנים הם התייצבו בשכבה פעילי שטח. כגודל החלקיקים יורד, מגדיל את פני שטח, כפי שעושה את הפוטנציאל לאינטראקציות פני תא ולא חשיפה סלולריתo השכבה פעילי השטח, שעלול לפגוע בקרום תא. ניסויים אלה אפשרו לקביעת ריכוז המינון שבו ספיגה תאית של חלקיקים יכולה להיבחן תוך הימנעות מירידה משמעותית בכדאיויות תא בשל שיבוש קרום. ניתוח MTT הוא טכניקה כמותית שיכול להיות מיושמת באופן נרחב להבנת בריאות סלולרית. במקביל, תאים נבדקו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להמחיש את הקרינה של צבע ניאון מטען, ניר. שימוש בטכניקה זו, ספיגת חלקיקים נצפתה רק לאחר 2 שעות של דגירה עם fibroblasts אדם. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מספק מידע איכותי הקשורים למורפולוגיה ומאפיינים סלולריים. יש להקפיד להימנע מהכתמת רקע מוגזמת והדמיה של חפצים. בנוסף, כמודלים של עכברים הם בדרך כלל הבחירה הראשונה לעומק סלולארי וחקירות מולקולריות, נתחנו את יחסי הגומלין בין SLNs ותאים עכברי. בפרט, גדולעניין טמון בשימוש בננו-חלקיקים לשחרור סלקטיבי ומבוקר של תרופות שהיו לשנות את ההתנהגות של המערכת החיסונית. כתוצאה מכך, cytometry זרימה הועסק למדוד את הספיגה של חלקיקים על ידי תאי דנדריטים עכבר. נתונים אלה אישרו כי תאי phagocytic כמו תאים דנדריטים יכולים לסבול טווח דומה של ריכוז SLNs (עם כדאיות מופחתת שנצפתה ב 50 מיקרוגרם / מיליליטר שומנים בדם כמו עם fibroblasts עורי האנושי) ורמת התאגדות ישירות בקורלציה עם הריכוז של חשיפת בלוטת זקיף. יתר על כן, DC חשף התאגדות מהירה מאוד של SLNs, המצביע על כך אוכלוסייה זו עשויה לייצג יעד בעל ערך באמצעות משלוח סמים בתיווך בלוטת זקיף. מחקר זה כולל תיאור של שיטה לסינתזה של אוכלוסיות קטנות במיוחד של חלקיקים ביולוגית, כמו גם כמה במבחנה שיטות שבאמצעותו להעריך האינטראקציות הסלולריות שלהם. במחקרים עתידיים, מבחני נוספיםיכול להיות מועסק כדי להמשיך ולאפיין אינטראקציות חלקיקי התאים וסופו של דבר להנחות את הפיתוח המוצלח של nanocarriers הטיפולי. אלה יכולים לכלול לימודים של קינטיקה שחרור תרופה, ניתוח של כמיהות סלולריות, מדידה של רמות ציטוקינים פרו-דלקתיים, וניתוח של שינויי transcriptomic סלולריים לאורך זמן.

כלי רכב המבוסס על ננו-חלקיקי משלוח הראו הבטחה גדולה עבור יישומי מיקוד תאיים, מתן מנגנון לשנות איתות תאית וביטוי גנים ספציפי. ניתן לטעון כלי רכב אלה עם סמים, חלבונים, וחומצות גרעין נועדו להשפיע תגובות הסלולר ולהשיג אפקט רצוי ברקמות יעד. סוגים רבים של nanocarriers נחקרו לתועלת טיפולית ואבחון כוללים שומנים, פולימרים, סיליקון, וחומרים מגנטיים. מערכות אלו הן אטרקטיביות בשל הפוטנציאל שלהם למשלוח סמים מקומיים, גדל ריכוז טיפולי ברקמות יעד, והפחתה של רעילות מערכתית. חלקיקים מוצקים שומנים (SLNs) הם דוגמא למדה היטב של מערכת מסירת ננו-חלקיקים שנוצר ככלי להעברת תרופות מבטיח בשנים האחרונות. SLNs אפשר לנסח בקלות ליישומים רבים, כולל 1 חישת ביו, קוסמטיקה 2, ולאמשלוח herapeutic 3-7. השירות שלהם נובע מהעובדה שהם מורכבים כולו משומני resorbable, רעילים, וכתוצאה מכך ההתאמה ביולוגית משופרת. במהלך סינתזה, ניתן לשלב תרופות lipophilic לכלי רכב בלוטת זקיף, ובכך להגדיל את מסיסות תרופה והתאמת לממשל parenteral. כלי רכב בלוטת זקיף גם לעזור לייצב תרופות כמוסות, הפחתת השפלה ואישורם, ולמקסם את הפעולה טיפולית. כלי רכב אלה הם גם מתאימים במיוחד למשחק ארוך, הכנות שחרור מבוקר בשל היציבות שלהם ב3,4,8,9 טמפרטורת גוף. חשוב לציין, אנקפסולציה של תרופות בחלקיקי שומנים משנה את פרופילי pharmacokinetic הפנימיים של מולקולות התרופה. זה מספק יתרון פוטנציאלי על ידי המאפשר שחרור המבוקר של תרופות עם מדד טיפולי צר. שיעור השחרור של תרופות-התאגד בלוטת זקיף יכול להיות מכוון המבוסס על קצב פירוק שומנים או שיעור דיפוזיה התרופה במטריצת שומנים. SLNs לעתים קרובות מהונדס להצטבר ברקמות יעד ספציפיות. לדוגמא, בגודל שלהם (בדרך כלל יותר מ -10 ננומטר) מגביר שייר במחזור, שבו כלי הדם הדולפים של רקמת גידול מקל בתצהיר. בנוסף, המסלול של ממשל חלקיקים הוכח לשנות biodistribution עם הפוטנציאל למקד מבנים פיסיולוגיים ספציפיים כגון בלוטות לימפה 10,11. על התצהיר ברקמות יעד, השיג אינטראקציות הסלולר מתאימות והפנמה סופית של חלקיקים הוא מאתגר בשל היכולת של קרום תא לשלוט באופן סלקטיבי את הזרימה של יונים ומולקולות לתוך ומחוץ לתא 12. כדי להקל על ספיגה תאית, ניתן לשנות nanocarriers עם ligands הספציפי כוללים פפטידים, מולקולות קטנות, ונוגדנים חד-שבטיים 13,14. מספר מנגנונים כוללים שתי חדירה פסיבית ותחבורה פעילה של חלקיקיםעל פני קרום התא תוארו בעבר 3,12,15. באופן כללי, זה כבר הוכיח כי אינטראקציות תא-ננו-חלקיקים מושפעות ממאפייני physicochemical של חלקיקים כולל גודל, צורה, תשלום פני השטח וכימיה של פני השטח, בנוסף לפרמטרי תא ספציפי כגון סוג תא או שלב מחזור תא 12. חקירה קודמת הדגימה את הסינתזה של תת-10 SLNs ננומטר עבור יישומי זיהוי אקטואליים 16 וסמן ביולוגי 1 בשיטת טמפרטורת היפוך השלב (PIT) 17. זוהי שיטת סינתזה עדינה שבו 2 הרכב נשאר קבוע בעוד הטמפרטורה משתנה בהדרגה. ערבוב רציף של הפתרון המחומם, כפי שהוא מתקרר לתוצאות RT בnanoemulsion. תוצאות תהליך זה בסינתזה של SLNs עם גודל חלקיקים קטן יותר 1 מזה שדווחו בעבר תוך שימוש בשיטות שונות לסינתזה של השומנים נאןoparticles 17-22. הגודל בקנה מידה וכתוצאה מכך, פחות מ -20 ננומטר, מספק יתרון עבור יישומי מיקוד תאיים בשל הגדלת שטח פנים ואת הפוטנציאל לאינטראקציות סלולריות משופרות. סכמטי של SLNs, נועד לספק צבע ניאון או טיפולי, מוצג באיור 1. SLNs מורכב (למשל, האלקאן ליניארי) מאפשר שילוב של תרכובות lipophilic (למשל, צבעים או הרפוי) וחיצוני פעילי שטח פנים שומנים (פעילי שטח לדוגמא, ליניארי nonionic) מוקף במים. במחקר זה, SLNs היו עמוס בצבע ניאון ומשמש כמודל לחקור אינטראקציות חלקיקי תאים. fibroblasts העיקרי אדם עור ותאים דנדריטים עכבר נחשפו לצבוע טעונים בלוטת זקיף לאורך זמן כדי לאפיין אינטראקציות ביחס לרעילות וספיגת חלקיקים. Assay 3 רומיד -2,5-diphenylphenyltetrazolium (4,5-dimethylthiazol-2-י.ל.) (MTT) היה utilized כדי להקים רמות מינון מתאימות. מיקרוסקופ פלואורסצנטי וcytometry זרימה היו שתי שיטות מועסקות לבחון ספיגת חלקיקים במבחנה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53102/53102fig1.jpg" /> איור 1. סכמטי של בלוטת הזקיף מראה את המרכיבים העיקריים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53102/53102fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nile Red (NiR)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>19123</td>
			<td>BioReagent, suitable for fluorescence, &#8805;98.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heneicosane</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>286052</td>
			<td>98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij O10</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6136</td>
			<td>Brij 97, C18-1E10, Polyoxyethylene (10) oleyl ether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W3500</td>
			<td>Sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter 0.2 &#181;m Supor Membrane Low Protein Binding</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>PN4612</td>
			<td>Non-Pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotrac Ultra&#160;</td>
			<td>Microtrac</td>
			<td>serial number U1985IS</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential Scanning Calorimeter</td>
			<td>Mettlet-Toledo</td>
			<td>----</td>
			<td>Instument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary human fibroblasts&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C-004-5C</td>
			<td>Neonatal (HDFn)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 106</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>M-106-500</td>
			<td>A sterile, liquid medium for the culture of human dermal fibroblasts.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S-003-K</td>
			<td>All the components of complete LSGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT Cell Proliferation Assay Kit</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>4890-025-K</td>
			<td>Sensitive kit for the measurement of cell proliferation based upon the reduction of the tetrazolium salt, 3,[4,5-dimethylthiazol-2- yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safire2 microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>----</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493</td>
			<td>For molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine GM-CSF&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>415</td>
			<td>&#62;97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IL-4&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>404</td>
			<td>&#62;97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

solid lipid nanoparticles (slns) for intracellular targeting applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

שיטת PIT שימשה לסנתז SLNs וטמפרטורת היפוך השלב נקבעה ניצול אמבט מים. הדגימות היו מחוממות לאט ובעדינות נסערת עד הפתרון הופיע ברור. טמפרטורת היפוך השלב לSLNs נעשה באמצעות השומנים heneicosane היא 45 מעלות צלזיוס. טבלת 1 מסכמת את גודל חלקיקים, polydispersity, נקודת התכה וחום כמוס של היתוך לSLNs. SLNs מסונתז באמצעות תנאי העיבוד שתוארו לעיל הביא SLNs השליטה וSLNs הטעון-ניר עם קוטר חלקיקים ממוצע של 18.59 ו16.87 ננומטר ועם polydispersity של 5.83 ו4.47, בהתאמה (איור 3). היציבות של פיזור SLNs הייתה פיקוח על ידי המדידה של גודל החלקיקים מעל 6 ימים בשתי טמפרטורות שונות אחסון (4 ו -23 מעלות צלזיוס). גודל החלקיקים לא ישתנה במשך 6 ימים (מידע לא מוצג). התנהגות התרמית של SLNs הייתה investigated באמצעות סריקת calorimetry ההפרש. יש לי SLNs מסונתז נקודת התכה של 38.0 (± 0.4) ו36.8 (± 0.2) מעלות צלזיוס במשך SLNs השליטה וSLNs הטעון-ניר, בהתאמה. לעומת זאת, נקודת ההתכה לשומנים בדם בכמות גדולה היא 40.0 מעלות צלזיוס, המציין את הדיכוי של נקודת SLNs ביחס לשומנים בתפזורת ההיתוך. כצפוי, הריתוק לממדים קטנים ויחס אזור בנפח גבוה משטח לדכא את נקודת התכת 1 ננו-חלקיקים. יתר על כן, החום הכמוס של היתוך לSLNs השליטה וSLNs הטעון-ניר הוא 5.1 (± 0.2), ו4.0 (± 0.1) J / g, בהתאמה. תוצאות אלו מצביעות על כך שרמת crystallinity של SLNs מושפעת מהמטען, שבו נטען SLNs-ניר הראה crystallinity נמוך בהשוואה לSLNs השליטה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53102/53102fig3highres.jpg" width="600" /> התפלגות גודל חלקיקים 3. דמותו שלnanoemulsions הטיפוסי. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53102/53102fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> לִטעוֹם </td><td> גודל חלקיקים (ננומטר) </td><td> Polydispersity </td><td> נקודת התכה (מעלות צלזיוס) </td><td> חום כמוס של היתוך (J / g) </td></tr><tr><td> SLNs (בקרה) </td><td> 18.59 </td><td> 5.83 </td><td> 38.0 ± 0.4 </td><td> 5.1 ± 0.2 </td></tr><tr><td> הניר-SLNs </td><td> 16.87 </td><td> 4.47 </td><td> 36.8 ± 0.2 </td><td> 4.0 ± 0.1 </td></tr></tbody></table> סיכום טבלה 1. התכונות הפיסיקליות והתנהגות תרמית של SLNs השליטה וSLNs הטעון-ניר כולל גודל חלקיקים, polydispersity, נקודת התכה וחום כמוס של<html> הַתָכָה. כדי לחקור את האינטראקציות של חלקיקים ודגמים סלולריים, מגבלות המינון של בלוטת הזקיף מיושמות באופן ישיר לתאים ראשוניים בתרבות, הוקמו ראשון. באמצעות assay MTT, השפעת המנה-תגובה על חילוף חומרים תאיים נמדדה, שבו ריכוז חלקיקים גובר הביא לירידה בכדאיות סלולרית (ביחס לתאי קבוצת הביקורת). לא היה הבדל שנצפה ברעילות בין התאים שנחשפו לבלוטת הזקיף לבד מול בלוטות זקיף טעונים-ניר במינונים שנקבעו מראש אלה. במקביל, תאים נבדקו מבחינה ויזואלית לדבקות בקלקר תרבית הרקמה ותמונות נלקחו להפגין שתי מורפולוגיה הנציג סלולרית ואת הספיגה של חלקיקי ניאון לאורך זמן (איור 5). שימוש במינון שווה לשומנים בדם / מיליליטר 5 מיקרוגרם (כ -80% כדאיות סלולרית) ספיגת חלקיקים נצפתה בדואר חשיפה 2 שעות. י&quot;ש &quot;&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53102/53102fig4.jpg" /> הכדאיות 4. איור של fibroblasts עורי האנושי הראשוני לאחר דגירה 24 שעות עם חלקיקים. הכדאיות נמדדה באמצעות assay MTT, והנתונים מייצגים תאי קיימא אחוזים ביחס לבקרות שלא טופלו. ריכוזים מייצגים שומנים משקל / נפח. הנתונים משקפים לפחות שלושה ניסויים בלתי תלויים, שבוצעו בשלושה עותקים. ברים שגיאה מצביעים סטיית ההתקן של הממוצע. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53102/53102fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53102/53102fig5.jpg" /> איור 5. fibroblasts עורי האנושי יסודי לאחר () 2 ודגירת 24 שעות עם חלקיקים טעונים-ניר. ריכוז Nanoparticle שווה 5 מיקרוגרם / מיליליטר שומנים בדם (B).תמונות נציג של לפחות שלושה ניסויים בלתי תלויים, שבוצעו בשני עותקים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53102/53102fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> בהתבסס על התוצאות של מחקרי הגבלת המינון, המתאם בין המינון של SLNs ורמת התאגדות בBMDC עכברי נחקר. תאים אלה נחשבים נרחב ביותר במודל חוץ גופית של תת מרובים DC הקיים in vivo ולאפשר לחקירות רמת מחקר בסיסיות של שני תופעות תאיות ומולקולריות של מניפולציות שנועדו. BMDC היה מטופל או חשוף O / N לאו 0.5 או 5.0 מיקרוגרם / מיליליטר של שומנים SLNs הטעון-ניר (בדומה לפיברובלסטים אנושיים, שימוש של 50 מיקרוגרם / מיליליטר שומנים בדם הביא תאי קיימא פחות מ -10%) ורמת התאגדות ננו-חלקיקים שנקבעה על ידי מדידת עוצמת הקרינה הניר בBMDCs באמצעות cytometry זרימה. קור ישירויסות בין הריכוז של SLNs משמש ואת כמות הקרינה שהוערכה בBMDCs נצפה (איור 6 א). ניתוח הקינטית של התאגדות SLNs טעונה-ניר גילה ספיגה מהירה מאוד על ידי BMDC. אות ניאון בלוטת הזקיף הייתה כבר ברורה אחרי שעה 1 של חשיפה, ואילו plateauing בסביבות 5 שעות של חשיפה (איור 6). <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/53102/53102fig6.jpg" /> איור התאגדות 6. בלוטת זקיף על ידי תאים דנדריטים בקורלציה עם ריכוז של חשיפה. (א) בתאים שמקורם במח עצם Murine הדנדריטים (BMDC) נחשפו O / N לניר-SLNs, בריכוז של שומנים בדם הצביע, ורמת התאגדות העריכה באמצעות cytometry זרימה. כל שכבות היסטוגרמה הם מגודרת על CD11c + האוכלוסייה. (ב) קינטי התאגדות בלוטת זקיף על ידי BMDC. תאים נחשפו לניר-SLNs (5מיקרוגרם / מיליליטר) לזמן המצוין ורמת הקרינה (על CD11c + תאים מגודרות) הוערך על ידי cytometry זרימה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53102/53102fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications at JoVE.com

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

מוצקים שומנים חלקיקים (SLNs) אפליקציות לתאיות מיקוד

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

solid-lipid-nanoparticles-slns-for-intracellular-targeting

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

16.8K Views.  The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory. In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions. 

Video: Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

חלקיקים נגיפיים עבור<em&gt; בחי</em&gt; הדמית גידול

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation nanoparticles (HNPs). The latter are a new family of probes recently introduced for labeling biological samples for multi-photon imaging. HNPs are capable of doubling the frequency of excitation light by the nonlinear optical process of second harmonic generation with no restriction on the excitation wavelength.
Multi-photon based methodologies for hESC differentiation into cardiac clusters (maintained as long term air-liquid cultures) are presented in detail. In particular, evidence on how to maximize the intense second harmonic (SH) emission of isolated HNPs during 3D monitoring of beating cardiac tissue in 3D is shown. The analysis of the resulting images to retrieve 3D displacement patterns is also detailed.

Protocol details are provided for in vitro labeling human embryonic stem cells with second harmonic generating nanoparticles. Methodologies for hESC investigation by multi-photon microscopy and their differentiation into cardiac clusters are also presented.

הרמוני חלקיקים למחקר הרגנרציה

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in biology, where clustering and the spatial organization of biomolecules is often the object of study. We describe here a protocol to produce monovalent quantum dots (mQDs) that can be accomplished in most biological research laboratories via a simple mixing of CdSe/ZnS core/shell QDs with phosphorothioate DNA (ptDNA) of defined length. After a single ptDNA strand has wrapped the QD, additional strands are excluded from the surface. Production of mQDs in this manner can be accomplished at small and large scale, with commercial reagents, and in minimal steps. These mQDs can be specifically directed to biological targets by hybridization to a complementary single stranded targeting DNA. We demonstrate the use of these mQDs as imaging probes by labeling SNAP-tagged Notch receptors on live mammalian cells, targeted by mQDs bearing a benzylguanine moiety.

We provide detailed instructions for the preparation of monovalent targeted quantum dots (mQDs) from phosphorothioate DNA of defined length. DNA wrapping occurs in high yield, and therefore, products do not require purification. We demonstrate the use of the SNAP tag to target mQDs to cell-surface receptors for live-cell imaging applications.

ייצור ומיקוד של חד-אנרגיה קוונטית נקודות

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticles for Multimodal Molecular Imaging Applications

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, complementary imaging techniques. These imaging agents facilitate the real-time assessment of pathways and mechanisms in vivo, which enhance both diagnostic and therapeutic efficacy. This article presents the protocol for the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles (PB NPs) - a novel class of agents for use in multimodal, molecular imaging applications. The imaging modalities incorporated in the nanoparticles, fluorescence imaging and magnetic resonance imaging (MRI), have complementary features. The PB NPs possess a core-shell design where gadolinium and manganese ions incorporated within the interstitial spaces of the PB lattice generate MRI contrast, both in T1 and T2-weighted sequences. The PB NPs are coated with fluorescent avidin using electrostatic self-assembly, which enables fluorescence imaging. The avidin-coated nanoparticles are modified with biotinylated ligands that confer molecular targeting capabilities to the nanoparticles. The stability and toxicity of the nanoparticles are measured, as well as their MRI relaxivities. The multimodal, molecular imaging capabilities of these biofunctionalized PB NPs are then demonstrated by using them for fluorescence imaging and molecular MRI in vitro.

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

Biofunctionalized הכחול פרוסים חלקיקים ליישומי הדמיה מולקולריים Multimodal

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, ...

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the target site while minimizing deleterious effects to off-target sites. Magnetic cell targeting is an efficient, safe, and straightforward delivery technique. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) are biodegradable, biocompatible, and can be endocytosed into cells to render them responsive to magnetic fields. The synthesis process involves creating magnetite (Fe3O4) nanoparticles followed by high-speed emulsification to form a poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) coating. The PLGA-magnetite SPIONs are approximately 120 nm in diameter including the approximately 10 nm diameter magnetite core. When placed in culture medium, SPIONs are naturally endocytosed by cells and stored as small clusters within cytoplasmic endosomes. These particles impart sufficient magnetic mass to the cells to allow for targeting within magnetic fields. Numerous cell sorting and targeting applications are enabled by rendering various cell types responsive to magnetic fields. SPIONs have a variety of other biomedical applications as well including use as a medical imaging contrast agent, targeted drug or gene delivery, diagnostic assays, and generation of local hyperthermia for tumor therapy or tissue soldering.

Targeted cell delivery is useful in a variety of biomedical applications. The goal of this protocol is to use superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) to label cells and thereby enable magnetic cell targeting approaches for a high degree of control over cell delivery and localization.

תיוג תא ומיקוד עם פאראמגנטי תחמוצת ברזל חלקיקים

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial applications. Here we describe how electrospinning or electrospraying a polymer mixture containing a biodegradable, biocompatible aliphatic polyester (e.g., polycaprolactone and poly(lactide-co-glycolide)), as the major component, doped with a hydrophobic copolymer composed of the polyester and a stearate-modified poly(glycerol carbonate) affords a superhydrophobic biomaterial. The fabrication techniques of electrospinning or electrospraying provide the enhanced surface roughness and porosity on and within the fibers or the particles, respectively. The use of a low surface energy copolymer dopant that blends with the polyester and can be stably electrospun or electrosprayed affords these superhydrophobic materials. Important parameters such as fiber size, copolymer dopant composition and/or concentration, and their effects on wettability are discussed. This combination of polymer chemistry and process engineering affords a versatile approach to develop application-specific materials using scalable techniques, which are likely generalizable to a wider class of polymers for a variety of applications.

Two- and three-dimensional superhydrophobic polymeric materials are prepared by electrospinning or electrospraying biodegradable polymers blended with a lower surface energy polymer of similar composition.

בודה חומרים פולימריים עבור יישומים ביו-הידרופובי

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and biodegradability, as well its ability to protect and subsequently release its payload in response to a trigger. While silk can be formulated into various material formats, silk nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems. Therefore, this article covers the procedures for reverse engineering silk cocoons to yield a regenerated silk solution that can be used to generate stable silk nanoparticles. These nanoparticles are subsequently characterized, drug loaded and explored as a potential anticancer drug delivery system. Briefly, silk cocoons are reverse engineered first by degumming the cocoons, followed by silk dissolution and clean up, to yield an aqueous silk solution. Next, the regenerated silk solution is subjected to nanoprecipitation to yield silk nanoparticles &#8211; a simple but powerful method that generates uniform nanoparticles. The silk nanoparticles are characterized according to their size, zeta potential, morphology and stability in aqueous media, as well as their ability to entrap a chemotherapeutic payload and kill human breast cancer cells. Overall, the described methodology yields uniform silk nanoparticles that can be readily explored for a myriad of applications, including their use as a potential nanomedicine.

Nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems for a broad range of indications. Here, we describe a simple yet powerful method to manufacture silk nanoparticles using reverse engineered Bombyx mori silk. These silk nanoparticles can be readily loaded with a therapeutic payload and subsequently explored for drug delivery applications.

יישומי ייצור משלוח סמים של חלקיקי משי

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Antimicrobial Characterization of Advanced Materials for Bioengineering Applications

The development of new advanced materials with enhanced properties is becoming more and more important in a wide range of bioengineering applications. Thus, many novel biomaterials are being designed to mimic specific environments required for biomedical applications such as tissue engineering and controlled drug delivery. The development of materials with improved properties for the immobilization of cells or enzymes is also a current research topic in bioprocess engineering. However, one of the most desirable properties of a material in these applications is the antimicrobial capacity to avoid any undesirable infections. For this, we present easy-to-follow protocols for the antimicrobial characterization of materials based on (i) the agar disk diffusion test (diffusion method) and (ii) the ISO 22196:2007 norm to measure the antimicrobial activity on material surfaces (contact method). This protocol must be performed using Gram-positive and Gram-negative bacteria and yeast to cover a broad range of microorganisms. As an example, 4 materials with different chemical natures are tested following this protocol against Staphylococcus aureus, Escherichia coli, and Candida albicans.The results of these tests exhibit non-antimicrobial activity for the first material and increasing antibacterial activity against Gram-positive and Gram-negative bacteria for the other 3 materials. However, none of the 4 materials are able to inhibit the growth of Candida albicans.

We present a protocol for the antimicrobial characterization of advanced materials. Here, the antimicrobial activity on material surfaces is measured by two methods that complement each other: one is based on the agar disk diffusion test, and the other is a standard procedure based on the ISO 22196:2007 norm.

אפיון מיקרוביאלית של חומרים מתקדמים ליישומים בביו-הנדסה

The development of new advanced materials with enhanced properties is becoming more and more important in a wide range of bioengineering applications. ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and size by low-density lipoproteins (LDLs) because cancer cells have an increased need for cholesterol to proliferate, and this has been exploited as a mechanism for delivering anticancer drugs to cancer cells. Moreover, depending on drug chemistry, encapsulating the drug can be advantageous to avoid degradation of the drug during circulation in vivo. Therefore, in this&#160;study, this design is used to fabricate lipid-coated nanoparticles of the anticancer drug falcarindiol, providing a potential new delivery system of falcarindiol in order to stabilize its chemical structure against degradation and improve its uptake by tumors. Falcarindiol nanoparticles, with a phospholipid and cholesterol monolayer encapsulating the purified drug core of the particle, were designed. The lipid monolayer coating consists of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (Chol), and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) along with the fluorescent label DiI (molar ratios of 43:50:5:2). The nanoparticles are fabricated using the rapid injection method, which is a fast and simple technique to precipitate nanoparticles by good-solvent for anti-solvent exchange. It consists of a rapid injection of an ethanol solution containing the nanoparticle components into an aqueous phase. The size of the fluorescent nanoparticles is measured using dynamic light scattering (DLS) at 74.1 &#177; 6.7 nm. The uptake of the nanoparticles is tested in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and imaged using fluorescence and confocal microscopy. The uptake of the nanoparticles is observed in hMSCs, suggesting the potential for such a stable drug delivery system for falcarindiol.

This article describes the encapsulation of falcarindiol in lipid-coated 74 nm nanoparticles. The cellular uptake of the nanoparticles&#160;by human stem cells into lipid droplets is monitored by fluorescent and confocal imaging. Nanoparticles are fabricated by the rapid injection method of solvent shifting, and their size is measured with the dynamic light scattering technique.

ספיגת של חלקיקים חדשים מצופים השומנים, המכיל Falcarindiol על ידי גזע אנושי Mesenchymal

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well as large-scale high-throughput screening (HTS) campaigns. Though laboratory automation has greatly increased the utility of microplates there remain instances where automation-based instrumentation is not feasible, cost-effective or compatible with microplate formatting needs. In these cases, microplates must be manually prepared. Problematic to manual microplate manipulations is that a number of difficulties can arise pertaining to the accurate tracking of sample operations, data record keeping and quality control (QC) inspection for well artifacts or formatting errors. As microplate well densities increase (i.e., 96-well, 384-well, 1536-well) the potential for introducing errors also drastically increases.&#160; Moreover, for small bench-top laboratory operations there exists a need to improve the ease and accuracy of sample handling in a cost-effective fashion. Herein, we describe a system that acts as a semi-automated pipetting guide referred to as the Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.). &#160;M.A.P.L.E. has multiple uses for supporting compound hit-picking and microplate preparation for assay development in high-throughput screening or laboratory benchtop operations, as well as QC/quality assurance (QA) diagnostic evaluation of microplate quality or visualizing well formatting errors.

Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.) is a computer-driven device that systematically illuminates microtiter wells to provide guidance for the manual preparation of microplates.&#160; M.A.P.L.E. improves the accuracy of microplate preparation while automating data recordkeeping. &#160;In addition, it can assist with examining microplate quality or aid in the detection of errors.&#160; &#160;

יישומים ללוחות תאורה בקוד פתוח מיקרופלייט

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...