This study was supported by the Swiss National Science Foundation (Grant 32003B_127619).

הביופסיה השרירה ארבעה הראשים נלקחת חזיר מורדם, שממנו המיטוכונדריה מבודד על ידי צנטריפוגה הפרש. החזיר משמש לאחר מכן עבור ניסוי נוסף. המחקר מתבצע בהתאם המכונים הלאומיים הנחיות בריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ובאישור ועדת טיפול בבעלי חיים של קנטון ברן, שוויץ. 1. המגון שרירי השלד ובידוד מיטוכונדריאלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלו 5-10 ארבעה גרמו דגימת שריר מ חזיר מורדם. ב assay מופיע, השתמשו בשרירי שלד חזיריים. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לבודד המיטוכונדריה ממינים אחרים (למשל, חולדה, עכברים, אדם, וכו &#39;.). הערה: שלב זה מתבצע על ידי מומחה רפואי עם התמחות בכירורגיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזירים שלווים עם קטמין תוך שרירית (20 מ&quot;ג / ק&quot;ג) ו xylazine (2 מ&quot;ג / ק&quot;ג), לפני הרדמה מושרה עם התוךmidazolam ורידי (0.5 מ&quot;ג / ק&quot;ג, בתוספת אטרופין 0.02 מ&quot;ג / ק&quot;ג). לשמור על הרדמה עם חליטות תוך ורידי רציף של propofol (4-8 מ&quot;ג / ק&quot;ג ח) ו- פנטניל (30 מיקרוגרם / ק&quot;ג ח) במהלך הניתוח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לטבול את דגימת רקמה בתוך כוס המכילה 20 מ&quot;ל של חיץ בידוד המיטוכונדריה קר כקרח (טבלה 1). הערה: חוצצי שימוש במהלך המגון ו centrifugations צריך להיות קר כקרח יש pH פיסיולוגי רלוונטי עם כוח יוני האוסמוטי תואם cytosol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את דגימת רקמה בכוס על איזון tared אנליטי. טרה את האיזון עם כוס המכילה 20 מ&quot;ל של חיץ בידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הכוס על דלי קרח. הערה: בצע את כל השלבים הבאים עבור ההליך המגון בטמפרטורה דלי קרח ולשמור את כל המאגרים על דלי הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכך את שרירי השלד בכוס (לשמור על הקרח) לחתיכות קטנות 1-2 מ&quot;מ במשך 3-4 דקות באמצעות sciss בסדרORS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את רקמת טחון בכוס פעמים עם חיץ בידוד קר כקרח (20 מיליליטר כל צעד כביסה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את הרקמה 10 כרכים של חיץ בידוד לפי משקל רקמות (ז) המכיל רקמות 5 מ&quot;ג פרוטאז / g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הכוס באמבט קרח על stirrer המגנטי ומערבבים במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את ההשעיה בכוס עם 10 כרכים נוספים של חיץ בידוד לפי משקל רקמות (ז) בתוספת 0.2% (משקל / נפח) אלבומין בסרום שור נטול שומן (BSA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג את כל חיץ הבידוד השלים עם 0.2% BSA ולשטוף את הרקמה בכוס פעמים עם חיץ בידוד קר קרח בתוספת 0.2% BSA (20 מיליליטר כל צעד כביסה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend רקמת ב 10 כרכים של חיץ בידוד לפי משקל רקמות (ז) בתוספת 0.2% עם נטול שומן BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize רקם עם homogenizer זכוכית חצי אוטומטי (כל זמן על קרח) עם עלי רפוי (10 משייכות). הערה: Homogenizדואר הרקמה תמיד באותו אופן (אותו מספר משיכות, למשל, 10 משיכות). מספר גבוה יותר של שבץ עלול לגרום נזק ו לנתק את המיטוכונדריה. רצוי, homogenize הרקמה באמצעות homogenizer אוטומטי. באופן ידני (וסובייקטיבית) דגימות רקמת הומוגני homogenizers זכוכית עשויות לייצר איכויות שונות של המיטוכונדריה מבודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה רקמת הומוגני ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 10,000 x ז. הערה: כל השלבים צנטריפוגה מבוצעים צנטריפוגות עם רוטורים בזווית קבועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant באמצעות pipet סרולוגיות ו resuspend גלולה במדיום בידוד קר כקרח-בתוספת BSA (10 מ&quot;ל / גרם רקמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב g x 350. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שומרים לעצמנו את supernatant באמצעות pipet סרולוגיות וזורקים את הכדור (פסולת הסלולר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את supernatant לתוך מבחנה (לשמור על הקרח) באמצעות שתי שכבות של גזה (17 האשכולות / 2 ס&quot;מ) להסיר תאים debrהוא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה המסוננת על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 7000 x ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend גלולת המיטוכונדריה הגולמית במאגר הבידוד (5 רקמות מיליליטר / g) בתוספת 0.2% (משקל / נפח) BSA ו צנטריפוגות ההשעיה על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 7000 x ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend גלולת המיטוכונדריה הגולמית חיץ לשטוף (טבלה 1). צנטריפוגה ההשעיה שוב ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 7000 x ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend גלולת המיטוכונדריה הגולמית במאגר לשטוף בצנטריפוגה ההשעיה שוב ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 7000 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend גלולה המיטוכונדריה גולמי 1.0 מ&quot;ל של חיץ לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת ריכוז החלבון של ההשעיה המיטוכונדריה ולשמור ההשעיה המיטוכונדריה המרוכזת על קרח. הערה: ריכוז חלבון ניתן למדוד באמצעות כל שיטה סטנדרטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זמן קצר לפניכדי respirometry מבחני, resuspend ההשעיה המיטוכונדריה למאגר הנשימה לריכוז סופי של חלבון 0.4 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​המיטוכונדריה. </li></ol> 2. ברזולוציה גבוהה Respirometry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.1 פיפטה מ&quot;ל הנשימה חיץ (טבלה 1) 16 לתוך תא oxygraph ברזולוציה גבוהה ומערבבים למאגר ברציפות באמצעות בר בחישה מגנטית הנוכחי בתא (700 סל&quot;ד) בשעה 37 ° C עבור 1 ח עד אות השטף חמצן יציבה של חיישן חמצן polarographic מתקבל. הערה: אלקטרודות חמצן Polarographic בתוך כל תא oxygraph למדוד את ריכוז החמצן ולחשב צריכת חמצן (שטף) בתוך כל תא. ריכוז החמצן ושיעורי צריכת חמצן (שטף) מוצגים בזמן אמת באינטרנט במחשב באמצעות תוכנה עבור רכישת נתונים וניתוח. בנוסף, על מנת להבטיח תוצאות מדויקות ואמינות, תיקון רקע חמצן אינסטרומנטלי צריך להיותנעשה על פי הוראות היצרן. הערה: מדויק 2.1 מיליליטר של חיץ נשימה מתווספת לתוך התא לכיול של נפח תא סופי של 2.0 מיליליטר לאחר סגירת הפקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע כיול אוויר של חיישן חמצן polarographic פי הפרוטוקולים של יצרן 17. הערה: במהלך כיול אוויר, עם מתנת שלב גז, ריכוז חמצן התקשורת יהיה לאזן בסדר גודל של 15-20 דקות. בהתאם טמפרטורה, לחץ ברומטרי, מסיסות של -oxygen ריכוז התקשורת ניתן לחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כיול אוויר, לשאוב את המדיום הנשימה מהאולם oxygraph ולהוסיף 2.1 מ&quot;ל של השעיה המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ&quot;ג / חלבון המיטוכונדריה מ&quot;ל) משלב 1.24 אל חדר של oxygraph. הערה: היקף מאגר נשימה תלוי במכשיר להגדיר ויצרן. לקבלת respirometry ברזולוציה גבוהה, 2.1 מ&quot;ל של bu הנשימהffer מתווסף לתוך התא לכיול של נפח תא סופי של 2.0 מיליליטר לאחר סגירת הפקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את תא oxygraph ידי החדרת את הפקק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב את ההשעיה המיטוכונדריה ברציפות באמצעות בר בחישה מגנטי נוכחי בתא (700 סל&quot;ד) בשעה 37 ° C ו- נשימה תאית שיא בתחילת המחקר במשך 3-5 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת. הערה: ריכוז החמצן ואת אות שטף חמצן מוצג בזמן אמת באינטרנט במחשב באמצעות תוכנה עבור רכישת נתונים וניתוח 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, להזריק מצעים ומעכבים לנשימת המיטוכונדריה דרך יציאות הזרקה טיטניום של הפקקים באמצעות הפרוטוקולים הסטנדרטיים הבאים. </li></ol> נשימת 3. אני תלוי Complex <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תא oxygraph המכיל את ההשעיה המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ&quot;ג / מ&quot;ל) הנוהל המתואר בצעדים 2.1-2.5 ולחכות אות יציבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 12.5 μL של 0.8 M malate (5 מ&quot;מ ריכוז סופי) ו -10 μL של 2 M גלוטמט (10 מ&quot;מ הריכוז הסופי) לתוך תא oxygraph המכיל ההשעיה המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ&quot;ג / מ&quot;ל) דרך יציאת זריקה טיטניום של פקק קאמרית להקליט נשימה תאית במשך 3-5 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת. הערה: כל הזריקות בשלבים הבאים מבוצעות דרך יציאות הזרקה טיטניום של פקקים באמצעות מזרקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 10 μL של 0.05 מ ADP (0.25 מ&quot;מ) לתוך תא oxygraph דרך נמל הזרקת טיטניום של הפקק הקאמרי ולהקליט נשימה המיטוכונדריאלי עד מגביר אות שטף חמצן, ולאחר מכן יורד ומייצב (3-5 דקות). הערה: הרמה של נשימה לאחר תוספת ADP עולה כי ריכוז ADP היה גבוה להרוות. בהתאם לכמות של המיטוכונדריה בשימוש במהלך הנשימה, ריכוז ADP יש טיטרציהעבור צריכת חמצן מדינת 3 יציבה (נשימה מקסימלי). תוספת של ADP ההשעיה המיטוכונדריה תניע לעלייה בצריכת חמצן ואת אות שטף החמצן תגדל (נשימת מדינת 3). לאחר ADP הוא נצרך, אות שטף חמצן יקטן (נשימת מדינת 4). </li></ol> 4. נשימה השנייה תלויה Complex <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תא oxygraph המכיל ההשעיה המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ&quot;ג / מ&quot;ל) הנוהל המתואר בצעדים 2.1-2.5 ולחכות אות יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 2 μL של 0.2 rotenone מ&quot;מ (0.2 מיקרומטר) &#39;זהירות&#39; החדרת oxygraph דרך נמל הזרקת טיטניום של הפקק הקאמרי באמצעות מזרק ולהקליט את הנשימה התאית במשך 3-5 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת. הערה: Rotenone הוא רעל מסוכן ועלול להיות השפעה משמעותית על בריאות האדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 20 μL של 1 succinate M (10 מ&quot;מ) לתוך ch oxygraphענבר נשימה המיטוכונדריאלי שיא 3-5 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 10 μL של 0.05 מ ADP (0.25 מ&quot;מ) לתוך תא oxygraph דרך נמל הזרקת טיטניום של הפקק הקאמרי ולהקליט נשימה תאית עד מגביר אות שטף חמצן, מייצב, ולאחר מכן יורד ומייצב (3-5 דקות). הערה: תוספת של ADP ההשעיה המיטוכונדריה תניע לעלייה בצריכת חמצן ואת אות שטף החמצן תגדל (נשימת מדינת 3). לאחר ADP הוא נצרך, אות שטף חמצן יקטן (נשימת מדינת 4). </li></ol> 5. נשימה IV התלוי Complex <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין תא oxygraph המכיל השעיה המיטוכונדריה מבודדת (0.4 מ&quot;ג / מיליליטר) הנוהל המתואר בצעדים 2.1 כדי 2.5 הפרוטוקול ולחכות אות יציבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז להזריק 2.5 μL של ascorbate 0.8 מ&quot;מ (1 מ&quot;מ). מיד לאחר מכן להזריק 2.5 μL של 0.2M TMPD (0.25 מ&quot;מ) ו -10 μL של 0.05 מ ADP (0.25 מ&quot;מ) לתוך תא oxygraph ואת הנשימה התאית שיא עד מגביר אות השטף חמצן ומייצב (3-5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף להזריק 10 μL של 1 M יזיד הנתרן (5 מ&quot;מ) &#39;זהירות&#39; החדרת oxygraph ולהקליט נשימה תאית עד ירידות אות שטף חמצן ומייצבת. הערה: אזיד הנתרן הוא רעל מסוכן ועלול להיות השפעה משמעותית על בריאות האדם. </li></ol> 6. ציטוכרום C מבחן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין תא oxygraph המכיל השעיה המיטוכונדריה מבודדת (0.4 מ&quot;ג / מיליליטר) הנוהל המתואר בצעדים 2.1 כדי 2.5 הפרוטוקול ולחכות אות יציבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 12.5 μL של 0.8 M malate (5 מ&quot;מ ריכוז סופי) ו -10 μL של 2 M גלוטמט (10 מ&quot;מ הריכוז הסופי) לתוך תא oxygraph המכיל ההשעיה המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ&quot;ג / מ&quot;ל) דרך יציאת זריקה טיטניום של פקק קאמריתולהקליט נשימה תאית במשך 3-5 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 10 μL של 0.5 M ADP (2.5 מ&quot;מ) לתוך תא oxygraph דרך נמל הזרקת טיטניום של הפקק הקאמרי נשימה המיטוכונדריאלי שיא עד מגביר אות שטף חמצן, ולאחר מכן יורדת ומייצב (3-5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, להזריק 5 μL של ציטוכרום C 4 מ&quot;מ (10 מיקרומטר) לתוך תא oxygraph ולהקליט נשימה תאית במשך 5 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת. </li></ol>

<ol>
	<li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues.+I.+Isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver;+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material.">Cytochemical studies of mammalian tissues. I. Isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> J. Biol. Chem. 172, 619-635 (1948).</li><li>Sims, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+metabolically+active+mitochondria+from+rat+brain+and+subregions+using+Percoll+density+gradient+centrifugation.">Rapid isolation of metabolically active mitochondria from rat brain and subregions using Percoll density gradient centrifugation.</a> J. Neurochem. 55 (2), 698-707 (1990).</li><li>Hartwig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+comparison+between+two+classical+and+a+kit-based+method+for+mitochondria+isolation.">A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation.</a> Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li><li>Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+permeabilization+for+the+high-throughput+measurement+of+compartmented+enzyme+activities+in+mammalian+cells.">Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells.</a> Anal. Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).</li><li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers,+tissues+and+cells.">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat. Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).</li><li>Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+assessing+mitochondrial+function+in+diabetes.">Methods for assessing mitochondrial function in diabetes.</a> Diabetes. 62 (4), 1041-1053 (2013).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle:+new+perspectives+of+mitochondrial+physiology.">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1837-1845 (2009).</li><li>Vuda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+catecholamines+on+hepatic+and+skeletal+muscle+mitochondrial+respiration+after+prolonged+exposure+to+faecal+peritonitis+in+pigs.">Effects of catecholamines on hepatic and skeletal muscle mitochondrial respiration after prolonged exposure to faecal peritonitis in pigs.</a> Innate Immun. 18 (2), 217-230 (2012).</li><li>Corr&#234;a, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+in+septic+shock:+effects+on+tissue+perfusion,+organ+function,+and+mitochondrial+respiration+in+a+porcine+model+of+fecal+peritonitis.">Angiotensin II in septic shock: effects on tissue perfusion, organ function, and mitochondrial respiration in a porcine model of fecal peritonitis.</a> Crit. Care Med. 42 (8), e550-e559 (2014).</li><li>Jeger, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose+response+of+endotoxin+on+hepatocyte+and+muscle+mitochondrial+respiration+in+vitro.">Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro.</a> Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).</li><li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioenergetics. 3, (2002).</li><li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+respiratory+chain+and+oxidative+phosphorylation.">The respiratory chain and oxidative phosphorylation.</a> Adv. Enzymol. Relat. Subj. Biochem. 17, 65-134 (1956).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Gnaiger, E., M&#233;ndez, G., Hand, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+phosphorylation+efficiency+and+depression+of+uncoupled+respiration+in+mitochondria+under+hypoxia.">High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (20), 11080-11085 (2000).</li><li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+respirometry:+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle.">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods Mol. Biol. 810, 25-58 (2012).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods.">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PLoS One. 6 (3), e18317 (2011).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functional+impairment+with+aging+is+exaggerated+in+isolated+mitochondria+compared+to+permeabilized+myofibers.">Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers.</a> Aging Cell. 9 (6), 1032-1046 (2010).</li><li>Graham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+a+crude+mitochondrial+fraction+by+density-gradient+centrifugation.">Purification of a crude mitochondrial fraction by density-gradient centrifugation.</a> Curr. Protoc. Cell. Biol. Chapter 3. 3, (2001).</li><li>Franko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+pure+and+functional+mitochondria+from+mouse+tissues+using+automated+tissue+disruption+and+enrichment+with+anti-TOM22+magnetic+beads.">Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads.</a> PLoS One. 8 (12), 382392 (2013).</li><li>Pecinov&#225;, A., Drahota, Z., N&#367;skov&#225;, H., Pecina, P., Hou&#353;t&#283;k, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+basic+mitochondrial+functions+using+rat+tissue+homogenates.">Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates.</a> Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).</li><li>Lombardi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+oxidative+phosphorylation+in+skeletal+muscle+mitochondria+subpopulations+in+pig:+a+study+using+top-down+elasticity+analysis.">Characterisation of oxidative phosphorylation in skeletal muscle mitochondria subpopulations in pig: a study using top-down elasticity analysis.</a> FEBS Lett. 475 (2), 84-88 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

במחקר הנוכחי אנו מתארים פרוטוקול לבודד באיכות גבוהה, ללא פגם ו המיטוכונדריה שרירי שלד מצמיד בחוזקה על ידי צנטריפוגה הפרש אשר ניתן להשתמש בם עבור מחקרים תפקודיים כגון respirometry ברזולוציה גבוהה. כדי לבודד המיטוכונדריה שלם מצמידים בחוזקה, יש כמה נקודות קריטיות כדי להיחשב בתוך הפרוטוקול הנוכחי. לאחר קצירת רקמות השלד, זה צריך להיות שקוע מיד חיץ בידוד המיטוכונדריה קר כקרח. כל צעדי צנטריפוגה צריכים להיעשות על 4 מעלות צלזיוס השעית המיטוכונדריה צריכה להישמר תמיד על קרח במהלך בידוד. הליך הבידוד צריך להיעשות כמה שיותר מהר. את homogenate צריך להיות centrifuged צינורות צנטריפוגות חומר ניקוי ללא נקיים. בסוף ההליך, השעית המיטוכונדריה צריכה להישמר מרוכזת תדולל רק לפני respirometry. בהיעדר נתוני respirometry מבוטאים pmol לכל PE השנימיליגרם r של חלבון המיטוכונדריה, חשוב להשתמש בטכניקה טובה למדוד את ריכוז החלבון המיטוכונדריה במדויק לאחר הבידוד. בחלק נהלי בידוד המיטוכונדריה, זה יכול לקרות כי המיטוכונדריה הוא זוגיים או לא צורך חמצן כראוי באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה. כדי להתגבר על בעיות אלה, הרקמה תמיד צריכה להיות הומוגני באותו אופן (באותו מספר המשייכות) באמצעות homogenizer עם העלי הרפוי (שלב 1.12). כאן, אנו תמיד homogenize הרקמה שרירי השלד באמצעות homogenizer אוטומטית עם 10 משיכות. מספר גבוה יותר של שבץ עלול לגרום נזק ו לנתק את המיטוכונדריה. באופן ידני (וסובייקטיבית) דגימות רקמת הומוגני homogenizers זכוכית עשויות לייצר איכויות שונות של המיטוכונדריה מבודד. הקפאה של המיטוכונדריה גם עלולה לגרום המיטוכונדריה זוגי ואחד צריך לוודא centrifugations נעשה על 4 מעלות צלזיוס ולא מתחתיו te זהmperature. היושרה המיטוכונדריה עלולה לסכן גם אם ה- pH של תמיסות בופר שגוי או צינורות צנטריפוגה אינם נקיים. יש לוודא כי הצינורות צנטריפוגה הם נטולי חומרי ניקוי נשטף כראוי. אחד הגורמים החשובים הראשונים כדי להיחשב במהלך הבידוד הוא homogenize רקמות בצורה עדינה. רקמות רכות דורשות כוחות מכאניים עדינים מיושמים במהלך המגון, ואילו רקמות קשות דורשות כוחות מכאניים חזקים יותר. חוצצי שימוש במהלך המגון ו centrifugations צריכים להיות קר כקרח יש pH פיסיולוגי רלוונטי עם כוח יוני האוסמוטי תואם cytosol. עבור רקמות קשות כגון שרירי שלד, לאחר המגון מכאני, פרוטאזות כגון טריפסין ניתן להוסיף עוד disaggregate הרקמה 4, 5. חלק מן המגבלות של המיטוכונדריה מבודד, מבוסס על דצנטריפוגה ifferential הם i) המיטוכונדריה הפגומה ואולי במהלך הליך המגון ובידוד 19, ii) כמויות הגדולות של דגימות הרקמה נדרשו עבור בידוד המיטוכונדריה, iii) האובדן והשינויים האפשריים יחידות משנת מתחמי שרשרת העברת אלקטרונים מסוימות המיטוכונדריה במהלך המגון ו צנטריפוגה צעדי 18, ו- IV) הייצור המוגבר של מיני חמצן הגיב במהלך שלבי המגון צנטריפוגה, אשר יכול לגרום להפרעות בתפקוד המיטוכונדריה 18. היתרונות של הומוגניזציה dounce ושיטת צנטריפוגה ההפרש לבודד המיטוכונדריה גולמי לניסויים הנשימה ביחס לשיטות הקיימות כגון צנטריפוגה שיפוע צפיפות 20 הם כי השיטה היא מהירה המיטוכונדריה מבודדים בתוך פרק זמן קצר. לכן ניסויי נשימה יכולים להתבצע בתוך 1ח. בנוסף, הנוהל הוא זול, יעיל מאוד במיטוכונדריה שהושג על ידי צנטריפוגה ההפרש יכול לשמש מבחני respirometry. חקירת צריכת החמצן המיטוכונדריה באמצעות המיטוכונדריה מבודד מציעה מספר יתרונות על פני סיבי permeabilized או תאים: אין הפרעה משמעותית עם חלבוני cytosolic שעשוי להפריע לתפקוד המיטוכונדריה bioenergetics; אין צורך permeabilization הסלולר; מצעים של מתחמי שרשרת הנשימה במיטוכונדריה ניתן להוסיף ישירות אל המיטוכונדריה המבודד. אחת השיטות חלופה למדוד הנשימה שריר השלד המיטוכונדריה הוא permeabilized השימוש סיבי שריר 9. חלק מן היתרונות של סיבי שריר permeabilized על המיטוכונדריה בודד הוא i) שום צעד המגון מכאני נחוץ, ii) כמויות קטנות מאוד של רקמות (כמה מ&quot;ג) נדרשים עבור מבחני respirometry. החיסרון של pסיבי שריר ermeabilized הוא דיפוזיה החמצן הנמוכה אל במיטוכונדריה של צרור הסיבים. הגבלת דיפוזיה זו דורשת כמויות גדולות יותר של ADP במהלך מבחני respirometry. שיטה חלופית נוספת היא שימוש homogenates כולו רקמות 22, שהיא שיטה מהירה מאוד ואינו דורש צעדי צנטריפוגה הפרש לבודד המיטוכונדריה. שימוש homogenate רקמות כולו עשוי למנוע אובדן של כמה המיטוכונדריה במהלך הבידוד שלהם, אך ייתכנו גורמים cytosolic אחרים הנוכחי, אשר עלולה להפריע ניתוח של פונקציות המיטוכונדריה כגון צריכת חמצן. לאחר שהתמחה צנטריפוגה ההפרש לבודד המיטוכונדריה גולמי עבור מבחני הנשימה, יישום בעתיד היא לחקור את יכולות הנשימה של המיטוכונדריה מבודד באמצעות טכניקות המתעוררים כגון שימוש הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה אנטי TOM22 (translocase של homolog 22 קרום המיטוכונדריה החיצוני) נוגדן-couplחרוזים מגנטיים ed 21.

bioenergetics מיטוכונדריאלי וקיבולות נשימה ניתן ללמוד לא רק בתאי permeabilized או סיבים אלא גם במיטוכונדריה מבודדת. במחקר הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול לבודד המיטוכונדריה שרירי שלד שלם באמצעות צנטריפוגה הפרש למדידות respirometry ברזולוציה גבוהה. כדי לבודד המיטוכונדריה תילן respirometry, הרקמה הומוגני המיטוכונדריה מבודד על ידי שיטת צנטריפוגה הפרש קונבנציונלית. שיטת צנטריפוגה ההפרש בוסס על centrifugations הרציף (בסדרה של גברת מהירות) של homogenates הרקמות הוצגה לראשונה על ידי Pallade ועמיתים לעבודה כמעט 70 שנים לפני 1. הרקמה טחונה ראשונה באמצעות מספריים הומוגני מכאני בתוך homogenizer זכוכית עם עלי רפוי. לאחר מכן homogenate הוא centrifuged במהירות נמוכה לבין הגלולה וכתוצאה המכילה רקמות רצופות, סלולריתפסולת גרעינים נמחקות. ואז, supernatant היא centrifuged מספר פעמים במהירות גבוהה השבר מועשר המיטוכונדריה נאסף. היתרונות של שיטת צנטריפוגה ההפרש לבודד המיטוכונדריה הוא כי: i) השיטה היא מהירה המיטוכונדריה יכול להיות מבודדת בתוך 1-1.5 שעות (ניסויי נשימה צריכות להתבצע מהר ככל האפשר); ii) הוא זול; ו- III) הוא יעיל מאוד ואת המיטוכונדריה מתקבלת על ידי צנטריפוגה הפרש טהורה מספיק עבור מבחני respirometry. החסרונות של השיטה צנטריפוגה ההפרש לבודד המיטוכונדריה הם כי אני) המיטוכונדריה עלול להיגרם מכך נזק ו זוגיים במהלך המגון; ii) את הזיהום של המיטוכונדריה עם מרכיבים תאיים אחרים (יכול להיפתר על ידי שטיפה נוספת גלולת המיטוכונדריה עם צעדים צנטריפוגה נוספים); iii) את האפשרות של בחירה תת-אוכלוסיות המיטוכונדריה שונות, למשל, במהלך שלבי centrifugations ההפרש, mitochondria עם צפופה תחתונה ניתן לשלול 7; ו- IV) בסלולרי המיטוכונדריה שמסביב חסר ורק הנשימה המקסימלי התיאורטית ניתן למדוד. שיטה נוספת לבודד המיטוכונדריה לצורך מבחני respirometry הוא שיפוע צפיפות צנטריפוגה 2. בטכניקה זו, תמצית הרקמות מונחת על פני פתרון של סוכרוז או שיפוע Percoll (עם צפיפות גבוהה יותר בחלק התחתון של צינור צנטריפוגה) ו centrifuged במהירות מסוימת, גרימת המיטוכונדריה כדי להיות מבודדת מרכיבים תאיים אחרים על פי שלהם צפיפויות. שיטה זו משמשת לעתים קרובות לבודד המיטוכונדריה מוח עם זיהום נמוך מאוד מן synaptosomes. עם זאת, המיטוכונדריה הכבד עכברוש המבודד על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות מזוהם מאוד עם אברונים תאיים אחרים 3. אחת המגבלות של שיטה זו היא כי נוכח שיפוע סוכרוז בצינור צנטריפוגה עלול להיקרע כךהמיטוכונדריה לי (הלם אוסמוטי). בהתאם לסוג של רקמות; ישנם כמה גורמים חשובים שיש להביא בחשבון עבור הבידוד של המיטוכונדריה שלם על ידי צנטריפוגה הפרש. הצורך הראשון הוא homogenize רקמות בצורה עדינה. רקמות רכות כגון כליות, מוח וכבד דורשות כוחות מכאניים עדינים מיושמים במהלך המגון. זאת לעומת רקמות קשות כגון שריר לב ו שלד שדורשים הרבה כוחות מכאניים חזקים. הרקמה הטחונה מטופל בדרך כלל עם proteinase לפני המגון לרכך את הרקמה. כל המאגרים המשמשים במהלך המגון צנטריפוגה צריכים להיות קר כקרח יש pH פיסיולוגי רלוונטי עם כוח יוני האוסמוטי תואם cytosol 4, 5. אחד היתרונות של לימוד bioenergetics המיטוכונדריה מבודד הוא כי ממברנות פלזמה הסלולר לא צריך להיות permeabilized עם דטרגנטים כגון digitonin או saponin 4, 6, אשר עלול לסכן את שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה. יתרון נוסף של המיטוכונדריה המבודד הוא עדר גורמי cytosolic אחרים, אשר עלולים להפריע הניתוח של פונקציות המיטוכונדריה כגון צריכת חמצן. החסרונות של שימוש המיטוכונדריה המבודד הם הבחירה האפשרית של אוכלוסיות המיטוכונדריה מסוימות במהלך שלבי צנטריפוגה, הפגיעה במיטוכונדריה במהלך הומוגניות, ואת דרישת כמויות גבוהות של דגימות ביולוגיות על מנת לקבל תשואה טובה של המיטוכונדריה מבודד 7, 8. לאחר שהסתיים הליך הבידוד, שיעורי הנשימה של המיטוכונדריה מתחמי אני-, II- ו- IV תלויות (מדינות 2, 3 ו -4) נקבעים באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה. לנשימה מורכבת מונחה לי, גלוטמטו malate מתווספים ואחריו diphosphate אדנוזין (ADP). לנשימה שנייה מונחה מורכבת, succinate מתווסף ואחריו ADP. שכן, נשימת IV מונחה מורכב ascorbate ו tetramethylphenylendiamine (TMPD) מתווסף ואחריו 9 ADP, 10, 11, 12. המדינה 2 מתייחסת צריכת חמצן בנוכחות מצעים לבד. המדינה 3 מתייחסת צריכת חמצן בנוכחות המצעים ADP. המדינה 4 מתייחסת צריכת חמצן לאחר דלדול ADP. יחס השליטה בדרכי הנשימה (RCR) הינו מדד של צימוד של ייצור ATP צריכת החמצן, והוא מחושב כיחס בין המדינה 3 ומדינה 4 13, 15. לסיכום, אנו מתארים פרוטוקול לבודד המיטוכונדריה שרירי שלד פונקציונלי ללא פגע על ידי צנטריפוגה הפרש ולהשתמש mitochon מבודדdria ללימודים פונקציונליים bioenergetic כגון respirometry ברזולוציה גבוהה.

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>Sigma</td><td>A 4386</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma</td><td>A 8674</td><td>Chemical, dissolve in ethanol</td></tr><tr><td>Ascorbate</td><td>Merck</td><td>1.00127</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A 7699</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A 6003</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>fluka</td><td>3779</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Glutamate</td><td>Sigma,</td><td>G 1626</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H 7523</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04936</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>1.04873</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>K-lactobionate</td><td>Sigma</td><td>L 2398</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M 9272</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS)</td><td>Merck</td><td>1.06129</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>O2k-Core: Oxygraph-2k&amp;nbsp;</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10000-02</td><td>High-resolution respirometry instrument</td></tr><tr><td>Proteinase, bacterial</td><td>Sigma</td><td>P 8038</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma</td><td>R 8875</td><td>Chemical, dissolve in ethanol</td></tr><tr><td>Succinate</td><td>Sigma</td><td>S 2378</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser&amp;nbsp;</td><td>schuett-biotec GmbH</td><td>3.201 011</td><td>Tissue homogenizer</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>T 8691</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>TMPD</td><td>Sigma</td><td>T 3134</td><td>Chemical</td></tr></tbody></table>

isolation of intact mitochondria from skeletal muscle by differential centrifugation for high-resolution respirometry measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

אני תלוי קומפלקס נשימה שיעורי נשימה שאני תלוי מורכבים המיטוכונדריה מבודד (מדינות 2, 3 ו -4) נקבעים באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה (איור 1, דיאגרמה נציג). מצעים שאני מורכבים מיטוכונדריאלי, גלוטמט malate, מתווספים ואחריו תוספת של ADP. המדינה 2 מתייחסת צריכת חמצן בנוכחות של המצעים לבד. המדינה 3 מתייחסת צריכת חמצן בנוכחות המצעים ADP. המדינה 4 מתייחסת צריכת חמצן לאחר דלדול ADP. RCR הינו מדד של צימוד של צריכת חמצן ייצור ATP, והוא מחושב כיחס בין המדינה 3 ומדינה 4. כפי שניתן לראות בתרשים 1, על תוספת של ADP, קצב הנשימה המיטוכונדריאלי מיד (הנשימה המדינה 3), ו ולאחר מכן יורד (מדינת 4 נשימה) לרמות מאוד שלimilar לזה של המדינה 2. זה מצביע על RCR גבוהה וכי שלמות המיטוכונדריה נשמרה היטב במהלך הליך בבידוד. איור 2 הוא דיאגרמה נציג למדידת קצב נשימה נמוכה מדינת 3 ו RCR, עם קצב נשימת מדינת 4 גבוה, המעיד על בידוד המיטוכונדריה הולם ולא מוצלח. שיעור נשימה גבוה מדינת 4 מהווה אינדיקטור leakiness פרוטון המיטוכונדריה 15. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55251/55251fig1.jpg" /> איור 1: בידוד המיטוכונדריה מוצלח: שלמות המיטוכונדריה נשמר היטב במהלך ההליך בבידוד. העתקים מן respirometry ברזולוציה הגבוהה באמצעות גלוטמט malate כמו מצעים (נשימה שאני תלוי מורכבת). הקו הכחול מייצג ריכוז חמצן. הקו האדום מייצג את זרימת החמצן (שיפוע ריכוז חמצן). אצטילןריכוז gen פוחת עם הזמן כמו המיטוכונדריה מבודד להשתמש חמצן זמין. צריכת חמצן מבוטאת pmol / (SX מ&quot;ג חלבון המיטוכונדריה). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55251/55251fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55251/55251fig2.jpg" /> איור 2: בידוד המיטוכונדריה פעולה נכשל: המיטוכונדריה שלמה לא נשמר גם במהלך הליך הבידוד המציין בידוד המיטוכונדריה הולם. העתקים מן respirometry ברזולוציה הגבוהה באמצעות גלוטמט malate כמו מצעים (נשימה שאני תלוי מורכבת). הקו הכחול מייצג ריכוז חמצן. הקו האדום מייצג את זרימת החמצן (שיפוע ריכוז חמצן). ריכוז החמצן יורדת עם הזמן, ככל המיטוכונדריה מבודד להשתמש availabחמצן le. צריכת חמצן מבוטאת pmol / (SX מ&quot;ג חלבון המיטוכונדריה). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55251/55251fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> נשימה השנייה תלויה Complex מורכב המיטוכונדריה מבודד השנייה תלויים שיעורי נשימה (מדינות 2, 3 ו -4) נקבעים באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה (איור 3, דיאגרמה נציג). עבור assay זה, ואני מורכב המיטוכונדריה מעוכב על ידי התוספת של rotenone, ולאחר מכן succinate (המצע II המורכב) מתווסף ואחריו ADP. איור 3 מראה כי עם תוספת של ADP, מגדילת הנשימה המיטוכונדריאלי מייד, ולאחר מכן יורד לרמות מאוד דומות לזה של המדינה 2, מציין המיטוכונדריה גם מצמיד וכישלמות המיטוכונדריה נשמרה היטב במהלך ההליך בבידוד. שווי RCR שחושב ניסוי טיפוסי זה הוא 4.23, אשר עולה בקנה אחד הדוק עם הערכים המוצגים בספרות הזמינה 10, 11, 23). איור 4 היא דיאגרמה נציג למדידת קצב הנשימה נמוך המדינה 3 ו RCR, עם קצב הנשימה המדינה 4 גבוה המעיד בידוד הולם. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55251/55251fig3.jpg" /> איור 3: בידוד המיטוכונדריה מוצלח: שלמות המיטוכונדריה נשמר היטב במהלך ההליך בבידוד. העתקים מן respirometry ברזולוציה הגבוהה באמצעות succinate כמו מצע (מורכבות נשימה השנייה תלויה). הקו הכחול מייצג ריכוז חמצן. הקו האדום מייצג את זרימת החמצן (שיפועריכוז חמצן). ריכוז החמצן יורדת עם הזמן, ככל המיטוכונדריה מבודד להשתמש חמצן זמין. צריכת חמצן מבוטאת pmol / (SX מ&quot;ג חלבון המיטוכונדריה). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55251/55251fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55251/55251fig4.jpg" /> איור 4: בידוד המיטוכונדריה פעולה נכשל: המיטוכונדריה שלמה לא נשמר גם במהלך הליך הבידוד המציין בידוד הולם. העתקים מן respirometry ברזולוציה הגבוהה באמצעות succinate כמו מצע (מורכבות נשימה השנייה תלויה). הקו הכחול מייצג ריכוז חמצן. הקו האדום מייצג את זרימת החמצן (שיפוע ריכוז חמצן). ריכוז החמצן יורדת עם הזמן, ככל mitoc מבודדhondria להשתמש החמצן הזמין. צריכת חמצן מבוטאת pmol / (SX מ&quot;ג חלבון המיטוכונדריה). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55251/55251fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> IV תלוי קומפלקס נשימה שיעורי נשימה IV התלוי מורכבים המיטוכונדריה מבודד (מדינות 2, 3) נקבע באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה (איור 5, דיאגרמה נציג). לקבלת ascorbate assay זה / TMPD ו ADP מתווספים, ואחריו אזיד הנתרן לעכב IV מורכבים. ההבדל בין צריכת חמצן לפני ואחרי תוספת של אזיד הנתרן מתפרש נשימת IV המורכבת האמיתית. איור 5 הוא דיאגרמה נציג measurement של קצב נשימת מדינת 3 IV התלוי מורכב גבוה המציין שלמות המיטוכונדריה נשמרה היטב במהלך הליך בבידוד. לעומת זאת, איור 6 היא דיאגרמה נציג מדידה של מדינה נמוכה 3 המציין בידוד הולם. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/55251/55251fig5.jpg" /> איור 5: בידוד המיטוכונדריה מוצלח: שלמות המיטוכונדריה נשמר היטב במהלך ההליך בבידוד. העתקים מן respirometry ברזולוציה הגבוהה באמצעות ascorbate / TMPD כמו מצע (נשימה מורכבת IV-תלוי). IV נשימה מורכבת (מדינה 3) מתפרשת על ידי הפחתת צריכת החמצן לפני ואחרי תוספת של אזיד הנתרן. הקו הכחול מייצג ריכוז חמצן. הקו האדום מייצג את זרימת החמצן (שיפוע ריכוז חמצן). ריכוז החמצן יורדת עם הזמן, ככל mitocho מבודדndria להשתמש החמצן הזמין. צריכת חמצן מבוטאת pmol / (SX מ&quot;ג חלבון המיטוכונדריה). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55251/55251fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/55251/55251fig6.jpg" /> איור 6: בידוד המיטוכונדריה פעולה נכשל: המיטוכונדריה שלמה לא נשמר גם במהלך הליך הבידוד המציין בידוד הולם. העתקים מן respirometry ברזולוציה הגבוהה באמצעות ascorbate / TMPD כמו מצע (נשימה מורכבת IV-תלוי). IV נשימה מורכבת (מדינה 3) מתפרשת על ידי הפחתת צריכת החמצן לפני ואחרי תוספת של אזיד הנתרן. הקו הכחול מייצג ריכוז חמצן. הקו האדום מייצג את זרימת החמצן (שיפוע ריכוז חמצן). Conce החמצןntration פוחת עם הזמן כמו המיטוכונדריה מבודד להשתמש חמצן זמין. צריכת חמצן מבוטאת pmol / (SX מ&quot;ג חלבון המיטוכונדריה). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55251/55251fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> הערכה של שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה באמצעות ציטוכרום C כדי להעריך את איכות כנת המיטוכונדריה, מבחן ציטוכרום C מתבצע על מנת לקבוע שלמות הממברנה חיצונית של המיטוכונדריה, על ידי מדידת הנשימה המיטוכונדריאלי לאחר התוספת הבאה של גלוטמט Malate, ADP ו ציטוכרום C (ADP מגורה מורכבת נשימה השנייה תלויה מדינת 3 נוכחות של ציטוכרום C). כפי שניתן לראות בתרשים 7, ציטוכרום C אינו לשפר מורכב שאני תלוי מדינת 3 מחדש<html> spiration של המיטוכונדריה המבודד, המציין כי לא היה פסד של ציטוכרום C מן הקרום החיצוני המיטוכונדריה ויושרת המיטוכונדריה נשמרה. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/55251/55251fig7.jpg" /> איור 7: ציטוכרום C אינו לשפר נשימה של המיטוכונדריה המבודד: שלמות המיטוכונדריה נשמרה היטב במהלך ההליך בבידוד. העתקים מן respirometry ברזולוציה הגבוהה באמצעות גלוטמט / Malate כמו מצע (נשימה שאני תלוי מורכבת). הקו הכחול מייצג ריכוז חמצן. הקו האדום מייצג את זרימת החמצן (שיפוע ריכוז חמצן). ריכוז החמצן יורדת עם הזמן, ככל המיטוכונדריה מבודד להשתמש חמצן זמין. צריכת חמצן מבוטאת pmol / (SX מ&quot;ג חלבון המיטוכונדריה).מ &#39;/ קבצים / ftp_upload / 55,251 / 55251fig7large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> חיץ בידוד מיטוכונדריאלי </td></tr><tr><td> כִּימִי </td><td> ריכוז </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 100 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 10 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> חומצת sulphonic morpholinopropane (מגבים) </td><td> 50 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> חומצה ethylenedinitrilotetraacetic (EGTA) </td><td> 1.0 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 1.1 מ&quot;מ </td></tr><tr><td colspan="2"> pH 7.4 </td></tr><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td colspan="2"> חיץ כביסה מיטוכונדריאלי </td></tr><tr><td> כִּימִי </td><td> ריכוז </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 100 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> מגבים </td><td> 50 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td colspan="2"> pH 7.4 </td></tr><tr><td></td><td rowspan="2"></td></tr><tr><td> חיץ הנשימה מיטוכונדריאלי 16 </td></tr><tr><td> כִּימִי </td><td> ריכוז </td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> 110 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 3.0 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 80 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> K-lactobionate </td><td> 60 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 10 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> טאורין </td><td> 20 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Hepes </tד&gt; <td> 20 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1.0 גר &#39;/ ל </td></tr><tr><td colspan="2"> pH 7.1 </td></tr></tbody></table> טבלה 1: רכב מאגרים.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements at JoVE.com

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

בידוד של המיטוכונדריה ללא פגע מן שרירי השלד על ידי דיפרנציאל צנטריפוגה מדידות Respirometry ברזולוציה גבוהה

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

isolation-intact-mitochondria-from-skeletal-muscle-differential

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.0K Views.  Inselspital, Bern University Hospital. Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

Video: Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, mitochondria exist in a series of complex morphologies, ranging from small oval organelles to a broad, reticulum-like network. Understanding how the mitochondrial reticulum expands and develops in response to diverse stimuli such as alterations in energy demand has long been a topic of research. A key aspect of this growth, or biogenesis, is the import of precursor proteins, originally encoded by the nuclear genome, synthesized in the cytosol, and translocated into various mitochondrial sub-compartments. Mitochondria have developed a sophisticated mechanism for this import process, involving many selective inner and outer membrane channels, known as the protein import machinery (PIM). Import into the mitochondrion is dependent on viable membrane potential and the availability of organelle-derived ATP through oxidative phosphorylation. Therefore its measurement can serve as a measure of organelle health. The PIM also exhibits a high level of adaptive plasticity in skeletal muscle that is tightly coupled to the energy status of the cell. For example, exercise training has been shown to increase import capacity, while muscle disuse reduces it, coincident with changes in markers of mitochondrial content. Although protein import is a critical step in the biogenesis and expansion of mitochondria, the process is not widely studied in skeletal muscle. Thus, this paper outlines how to use isolated and fully functional mitochondria from skeletal muscle to measure protein import capacity in order to promote a greater understanding of the methods involved and an appreciation of the importance of the pathway for organelle turnover in exercise, health, and disease.

Mitochondria are key metabolic organelles that exhibit a high level of phenotypic plasticity in skeletal muscle. The import of proteins from the cytosol is a critical pathway for organelle biogenesis, essential for the expansion of the reticulum and the maintenance of mitochondrial function. Therefore, protein import serves as a barometer of cellular health.

מדידה של קיבולת ייבוא חלבון של המיטוכונדריה שריר השלד

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

Biochemistry

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining samples of human Vastus lateralis, isolating mitochondria from minimal amounts of skeletal muscle tissue, and plate based respirometric profiling using an extracellular flux (XF) analyzer. Comparison of respirometric profiles obtained using 1.0, 2.5 and 5.0 &#956;g of mitochondria indicate that 1.0 &#956;g is sufficient to measure respiration and that 5.0 &#956;g provides most consistent results based on comparison of standard errors. Western blot analysis of isolated mitochondria for mitochondrial marker COX IV and non-mitochondrial tissue marker GAPDH indicate that there is limited non-mitochondrial contamination using this protocol. The ability to study mitochondrial respirometry in as little as 20 mg of muscle tissue allows users to utilize individual biopsies for multiple study endpoints in clinical research projects.

Methods for biopsy of Vastus lateralis, preparation of purified mitochondria, and respirometric profiling are described. The use of small muscle volume makes this technique suitable for clinical research applications.

ההכנה וRespirometric הערכה של המיטוכונדריה מבודדת מרקמת שריר שלד מתקבלת על ידי Percutaneous מחט ביופסיה

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

Medicine

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

בידוד מיטוכונדריאלי של שריר השלד

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

טיהור אבות מן שרירי השלד

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

<meta charset="utf8"></head><body>בידוד מיטוכונדריאלי ממכרסמים למחקרים ביואנרגטיים איכותיים

Robust Mitochondrial Isolation from Rodent Cardiac Tissue

Mitochondrial isolation has been practiced for decades, following procedures established by pioneers in the fields of molecular biology and biochemistry to study metabolic impairments and disease. Consistent mitochondrial quality is necessary to properly investigate mitochondrial physiology and bioenergetics; however, many different published isolation methods are available for researchers. Although different experimental strategies require different isolation methods, the basic principles and procedures are similar. This protocol details a method capable of extracting well-coupled mitochondria from a variety of tissue sources, including small animals and cells. The steps outlined include organ dissection, mitochondrial purification, protein quantification, and various quality control checks. The primary quality control metric used to identify high-quality mitochondria is the respiratory control ratio (RCR). The RCR is the ratio of the respiratory rate during oxidative phosphorylation to the rate in the absence of ADP. Alternative metrics are discussed. While high RCR values relative to their tissue source are obtained using this protocol, several steps can be optimized to suit the individual needs of researchers. This procedure is robust and has consistently resulted in isolated mitochondria with above-average RCR values across animal models and tissue sources.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: חשיפת התפקיד של סידן פוספט מיטוכונדריאלי באי ספיקת לב ובביו-אנרגטיקה

Bioenergetic and metabolomic studies on mitochondria have revealed their multifaceted role in many diseases, but the isolation methods for these organelles vary. The method detailed here is capable of purifying high-quality mitochondria from multiple tissue sources. Quality is determined by respiratory control ratios and other metrics assessed with high-resolution respirometry.

בידוד מיטוכונדריאלי חזק מרקמת לב מכרסם 

Mitochondrial isolation has been practiced for decades, following procedures established by pioneers in the fields of molecular biology and biochemistry ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

בידוד מהיר וטיהור של מיטוכונדריה להשתלה על ידי דיסוציאציה רקמות ודיפרנציאל סינון

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

בידוד של המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות תפוקה גבוהה microplate נשימה

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Development of a Mobile Mitochondrial Physiology Laboratory for Measuring Mitochondrial Energetics in the Field

Mitochondrial energetics is a central theme in animal biochemistry and physiology, with researchers using mitochondrial respiration as a metric to investigate metabolic capability. To obtain the measures of mitochondrial respiration, fresh biological samples must be used, and the entire laboratory procedure must be completed within approximately 2 h. Furthermore, multiple pieces of specialized equipment are required to perform these laboratory assays. This creates a challenge for measuring mitochondrial respiration in the tissues of wild animals living far from physiology laboratories as live tissue cannot be preserved for very long after collection in the field. Moreover, transporting live animals over long distances induces stress, which can alter mitochondrial energetics.
This manuscript introduces the Auburn University (AU) MitoMobile, a mobile mitochondrial physiology laboratory that can be taken into the field and used on-site to measure mitochondrial metabolism in tissues collected from wild animals. The basic features of the mobile laboratory and the step-by-step methods for measuring isolated mitochondrial respiration rates are presented. Additionally, the data presented validate the success of outfitting the mobile mitochondrial physiology laboratory and making mitochondrial respiration measurements. The novelty of the mobile laboratory lies in the ability to drive to the field and perform mitochondrial measurements on the tissues of animals captured on site.

We designed and constructed a mobile laboratory to measure respiration rates in isolated mitochondria of wild animals captured at field locations. Here, we describe the design and outfitting of a mobile mitochondrial laboratory and the associated laboratory protocols.

בידוד של המיטוכונדריה ללא פגע מן שרירי השלד על ידי דיפרנציאל צנטריפוגה מדידות Respirometry ברזולוציה גבוהה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מדידה של קיבולת ייבוא חלבון של המיטוכונדריה שריר השלד

ההכנה וRespirometric הערכה של המיטוכונדריה מבודדת מרקמת שריר שלד מתקבלת על ידי Percutaneous מחט ביופסיה

בידוד מיטוכונדריאלי של שריר השלד

טיהור אבות מן שרירי השלד

בידוד מיטוכונדריאלי חזק מרקמת לב מכרסם

בידוד מיטוכונדריאלי חזק מרקמת לב מכרסם

בידוד מיטוכונדריאלי חזק מרקמת לב מכרסם

בידוד מהיר וטיהור של מיטוכונדריה להשתלה על ידי דיסוציאציה רקמות ודיפרנציאל סינון

בידוד של המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות תפוקה גבוהה microplate נשימה

פיתוח מעבדה ניידת לפיזיולוגיה מיטוכונדריאלית למדידת אנרגיה מיטוכונדריאלית בתחום