סימולציה דינמית מולקולרית היא טכניקה חישובית שניתן להשתמש בה כדי לחקור תנועות מולקולריות והוא יכול לחשוף שינויים קונפורמיים החיוניים להבנת תפקוד ביוכימי ותאי. קשה לתדרך את טווח התנועות הדינמיות הנגישות למאקרומולקול. שימוש בתוצאות מסימולציות דינמיות מולקולריות בשילוב עם נתונים ניסיוניים מאפשר הערכה של משמעותם התפקודית.
אנו נדגים באמצעות סימולציות דינמיות מולקולריות כיצד מוטציות שנצפו אצל חולי סרטן משפיעות על אישורי מיקוד EGFR וקשירת ליגנד. כדי להכין את EGFR פעיל apo מסוג פראי מבנה kinase שלנו, לפתוח את תוכנית הדמיה קימרה, ותחת תפריט הקובץ, לחץ להביא על ידי ID.Select את מסד הנתונים של בנק נתוני חלבון ולציין את קוד בנק נתוני חלבון 2GS2. כדי לבנות את האלמנטים המבניים החסרים של 2GS2, רכוש מקטעים אלה ממבני EGFR אחרים.
כדי לבנות את חמש שאריות גלוטמט 746 כדי אלנין 750 ELREA מחיקה ב EGFR, לחץ על מועדף, רצף, ולהראות רצף כדי לפתוח את רצף 2GS2 מסוג פראי. ובחלון הרצף שנוצר, לחץ על ערוך והוסף רצף כדי לבחור את רצף תבנית FASTA המוטנטי למחיקה. בחלון היישור, בחר את המבנה והמודל או הומולוגיה.
בחלון המוקפץ, ציין את המבנה המורכב של 2GS2 כתבנית ואת רצף המוטנטים כשאילתה שיש לדגמן ולאחר מכן בחר מודל מוטנט מהמודלים המתקבלים בהתבסס על ציון zDOPE ובדיקה חזותית. כדי להכין את מבנה ה- EGFR קינאז הלא פעיל מסוג פראי, פתח את מבנה בנק הנתונים של החלבון 2GS7 והוסף את המקטעים החסרים ממבני EGFR האחרים, מידול טופס מוטנט המחיקה כפי שהוכח. כדי להכין את מבנה הקינאז הפעיל EGFR מסוג ATP, השתמש במבנה בנק הנתונים של חלבון 2ITX כמבנה העיקרון, בניית המקטעים החסרים באמצעות מבני EGFR אחרים ומידול טופס מוטנט המחיקה באמצעות המדגים כפי שהוכח.
כדי לבנות את מבנה העמעום האסימטרי מסוג Wild-TYPE EGFR, פתח את 2GS2 בקימרה ולחץ על כלים, מבנה מסדר גבוה יותר ותא יחידה כדי להמיר את המבנה להרכבה הביולוגית המכילה את המפעיל והמקלט kinases בסידור האסימטרי. בחר את מבנה 2GS2 והזן ליצור עותקים, ולאחר מכן בחר ושמור עמעום אסימטרי יחיד מהעותקים המרובים של העמעום הנובע מפעולות הסימטריה. כדי לבנות את מוטציית הולין אלנין 702, בחר כלים, עריכת מבנה ורוטמרים כדי להחליף את אלנין 702 בולין.
פתחו את המבנים ב-Maestro ולחצו על כפתור אשף הכנת החלבון, ולאחר מכן בחרו להוסיף אטומי מימן ולמלא אטומי שרשרת צדדיים חסרים ולחצו על תהליך מקדים. כדי לקבוע את מצבי הפרוטונציה של שאריות יוניות ב- pH 7.0, לחץ על עידון ולהשתמש PROPKA כדי לייעל את האוריינטציה של אספרג'ין, גלוטמין, שאריות היסטמין עבור מליטה מימן, ולאחר מכן למזער את המבנה. כדי להגדיר את מערכת הסימולציה, פתח את תוכנית LEAP וייבא את שדה כוח FF14SB ענבר ומולקולות מים TIP3P.
עבור המערכות המאוגדות ל- ATP, יבא פרמטרים עבור ATP וטען את המבנה. לתפוך את המבנה בקופסת אוקטהדרל עם מולקולות מים TIP3P מפורשות המשתרעת על פני 10 אנגסטרום לכל הכיוונים מאטומי פני השטח של החלבון. בדוק את מערכת החגורה ולהוסיף את היונים הדרושים כדי לנטרל אותו.
כדי מודל מספיק מערכות biomolecular, להוסיף נתרן נוסף אטומי כלוריד לתיבת הסימולציה כדי להביא את ריכוז מלח המערכת 0.15 טוחנת, ולאחר מכן ליצור ולשמור את הטופולוגיה ולתאם קבצים של המערכת כדי לשמש תשומות עבור סימולציית הייצור הבאה. באמצעות אמבר, בתחילה אנרגיה למזער את מערכת הסימולציה כדי לעקוף את כל תצורות שליליות. בקובץ קלט המזעור, התאם את משתנה המחזור המרבי עבור מחזור המזעור הכולל ואת מספר המחזורים כדי לציין את מספר המחזורים עבור אלגוריתם הירידה התלול ביותר.
השתמש במשתנה משקל הריסון כדי להחיל את כוח הריסון על האטומים המסיסים שצוינו על ידי הפרמטר מסיכת ריסון. בצע את המזעור בצעדים מרובים, בהדרגה להוריד את האיפוק להחיל על אטומים מסיסים מ 25 כדי 0 קילוקלוריות לכל כיכר אנגסטרום שומה, ולאחר מכן להשתמש בפקודה כדי להפעיל את מזעור. מחממים את המערכת עבור 100 picoseconds מ 0 עד 300 קלווין ולהשתמש בפקודות כדי להגדיר 10 טוחן kilocalorie לכל איפוק אנגסטרום מרובע על אטומים מסיסים.
לאחר מכן השתמש בפקודה כדי לבצע את החימום. לצייד את המערכת עבור 900 picoseconds תחת אנסמבל isothermal isobaric ולהגדיר ניתוק מרחק אנגסטרום תשעה עבור אינטראקציות אלקטרוסטטיות לטווח ארוך, בהדרגה להוריד את ריסון האטום מסיס ל 0.1 kilocalorie לכל ריבוע אנגסטרום שומה ולגבש את שיווי המשקל עם סימולציה ננו-שנייה ללא מעצורים. הפעל את הה השוויון עם הפקודה כפי שצוין.
התאם את הטקסט כדי לאפשר את הדמיית הייצור להתבצע במשך 100 ננו שניות עם הקונפורמציות נשמר כל 10 picoseconds, ולאחר מכן להפעיל את הסימולציה עם הפקודה כפי שצוין. כדי להמחיש את דגימת הקונפורמציה במהלך הדמיות EGFR קינאז מסוג פראי ומוטנטים, פתח את קבצי הטופולוגיה של Amber ואת קבצי המסלול המתאימים בדינמיקה מולקולרית חזותית. ובשימוש בייצוגי מבנה משני נוח, לנתח את הדינמיקה המבנית הכוללת של החלבונים מהמסלול המתועד.
לאחר מכן הצג אינטראקציות ספציפיות בין אטומים ושאריות של עניין, כגון lysine חיוני קטליטטית 745-גלוטמט 762 גשר מלח. לחלופין, שמרו קונפורמציות מרובות שנדגמו במהלך הסימולציה בפורמט Protein Data Bank ופתחו את הקונפורמציות בקימרה. השתמש באפשרות השדכן כדי להמחיש את המבנים על המבנה הראשוני או החציוני ולהציג את המבנה החציוני מוצק ואת שאר המבנים מיושר בלבן דהוי כדי לאפשר הדמיה של תנועות מבניות מוקלטות בבהירות רבה יותר.
כדי לנתח את היציבות הגלובלית של EGFRs מסוג פראי ומוטנטים ולבחון את הגמישות של היחידות המבניות השונות, יבא את טיפולוגיית הענבר ואת קבצי המסלול המתאימים. בקובץ הקלט של סטיית ריבוע השורש, ציין את אטומי עמוד השדרה של המבנה ההתחלתי כהפניה להתאמה הריבועית הממוצעת של השורש. בקובץ קלט התנודות הריבועיות של ממוצע השורש, ציין את אטומי C-alpha של המבנה ההתחלתי כהפניה להתאמה הריבועית הממוצעת של השורש.
לאחר מכן הפעל את הניתוח באמצעות תוכנית CPPTRAJ והתוות את נתוני הפלט. לחלופין, כדי ליישר את ההרכבים הקונפורמיים ולצבע כל שאריות בהתבסס על השורש C-alpha אטום פירושו סטייה ריבועית, לפתוח את הקונפורמציות בקימרה וליישר אותן עם אפשרות השדכן. בחר כלים, תיאור ועיבוד לפי תכונה.
בחרו שאריות של ההרכבים הקונפורמיים והגדירו את הסטייה הריבועית הממוצעת של שורש C-alpha כתכונות ולחצו על הלחצן 'אשר'. עקבות השרשרת של הקונפורמציות יהיו בצבע כחול, לבן או אדום המשקף את אזורי היציבות המבנית הגבוהה, הבינונית והנמוכה בהתאמה. כדי לנתח את אינטראקציות קשר המימן בין ATP לבין EGFRs מסוג פראי ומחיקה, הכן סקריפט CPPTRAJ לביצוע משימה זו. ציין את הניתוח עבור קשרי המימן הבין-תאיים רק עם משתנה הנוינדרמול והגדר קשר מימן עם מרחק מקבל תורם של פחות או שווה ל- 3.5 אנגסטרום וזווית קשר של גדול או שווה ל - 135 מעלות.
כדי להעריך את האינטראקציות התוך-מולקולריות, למשל, בין שאריות ליזין וגלוטמט חשובות מבחינה קטליטטית, ציין ליזין כתורם המימן וגלוטמט כשאריות המקבל והפעל את התסריט כפי שצוין כדי לאפשר ניתוח של התוצאה. כדי לחשב את האנרגיות החופשיות המחייבות בין ATP לבין EGFRs מסוג פראי ומחיקה, הכן את קולטן ליגנד שלב הגז וקבצי בנק נתוני חלבון מורכבים של קולטן ליגנד בתוכנית LEAP והגדר את ATP כליגנד ו- EGFR כ הקולטן. הגדר את ערך הרדיו שנולד באופן כללי ל- M Bond I2. לאחר מכן ליצור את הטופולוגיה אמבר לתאם קבצים עבור שלב הגז חלבון נתונים קבצי בנק.
באופן דומה, כדי לחשב אנרגיות חופשיות מחייבות בין מפעיל ומקלט kinases של סוג פראי ואלנין 702 valine EGFRs, לציין את kinase המקלט כמו הליגנד ואת kinase מפעיל כמו הקולטן ולשמור את הטופולוגיה המתאימה לתאם קבצים. הכן קובץ קלט שטח פנים מוכלל של מכניקה מולקולרית והגדר את ערך ה- IGB לשניים ואת ה- saltcon ל- 0.1. ואז להשתמש באמפבסה.
py סקריפט זמין ענבר, הזן את הפקודה כפי שצוין כדי לבצע את חישובי האנרגיה מחייב לנתח את נתוני הפלט. במהלך סימולציה זו נציג 100 ננו שנייה, מוטציה ולין אלנין 702 הראה יציבות קונפורמציה מוגברת של קטע B juxtamembrane ככל הנראה בשל אינטראקציות הידרופוביות הדוקות יותר בהשוואה EGFR מסוג פראי. המוטנט אלנין 702 ולין גם הפגין אנרגיה חופשית נמוכה יותר של קשירה בין המפעיל לבין kinases מקלט יחסית EGFR מסוג פראי, המייצג אינטראקציות עמעום נוח יותר לשמור על קונפורמציה EGFR קינאז פעיל.
הדמיה של מוטציית המחיקה הביאה לתנודות אטומיות C-alpha נמוכות יותר של סליל אלפא C-helix של מפתח תפקודי בהשוואה ל- EGFR מסוג פראי, והאריך את זמן המצב הפעיל של EGFR. מוטציית המחיקה הביאה גם להיווצרות תכופה של קשרי מימן בין אטומי הקוטב של השרשרת הצדדית של ליזין 745 וגלוטמט 762, אינטראקציה מרכזית עבור פעילות אנזימטית EGFR בהשוואה ל- EGFR מסוג פראי. בנוסף, מספר קשרי המימן בין ATP ל- EGFR היה גדול יותר עבור מוטציית המחיקה מאשר עבור EGFR מסוג פראי.
מוטציית המחיקה הביאה גם לתנועה פנימית של מצב EGFR לא פעיל אלפא C-סליל, שינוי מבני צפוי במהלך המעבר למצב פעיל. לעומת זאת, סליל אלפא C של EGFR לא פעיל מסוג פראי שמר על הקונפורמציה הראשונית שלו. כדי להעריך את ההשפעה של המוטציות, חיוני לבחור את המצבים הקונפורמיים המתאימים של המבנים כדי להכין כראוי לצייד מבנים אלה.
חשוב לשלב סימולציות דינמיות מולקולריות עם מחקרים ניסיוניים, גם כאשר הסינרגיה בין טכניקות אלה מועילה לפרשנות התוצאות ומודיעה על ניסויי מעבדה רטובים נוספים.
