We thank E. Arzt for his support through INM, M. Koch for help with the ESEM, and DENS Solutions for providing the microchips. Research in part supported by the Leibniz Competition 2013.

<ol>
	<li>Dukes, M. J., Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+fluorescence+microscopy+and+scanning+transmission+electron+microscopy+of+quantum-dot-labeled+proteins+in+whole+cells+in+liquid.">Correlative fluorescence microscopy and scanning transmission electron microscopy of quantum-dot-labeled proteins in whole cells in liquid.</a> ACS Nano. 4, 4110-4116 (2010).</li><li>Nishiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atmospheric+scanning+electron+microscope+observes+cells+and+tissues+in+open+medium+through+silicon+nitride+film.">Atmospheric scanning electron microscope observes cells and tissues in open medium through silicon nitride film.</a> J. Struct. Biol. 169, 438-449 (2010).</li><li>Kinoshita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-electron+microscopy+of+primary+cell+cultures+from+genetically+modified+animals+in+liquid+by+atmospheric+scanning+electron+microscopy.">Immuno-electron microscopy of primary cell cultures from genetically modified animals in liquid by atmospheric scanning electron microscopy.</a> Microsc. Microanal. 20, 469-483 (2014).</li><li>Jonge, N., Peckys, D. B., Kremers, G. J., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+whole+cells+in+liquid+with+nanometer+resolution.">Electron microscopy of whole cells in liquid with nanometer resolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2159-2164 (2009).</li><li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+Scanning+Transmission+Electron+Microscopy:+Imaging+Protein+Complexes+in+their+Native+Environment+in+Whole+Eukaryotic+Cells.">Liquid Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging Protein Complexes in their Native Environment in Whole Eukaryotic Cells.</a> Microsc. Microanal. 20, 189-198 (2014).</li><li>Peckys, D. B., Baudoin, J. P., Eder, M., Werner, U., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+subunit+locations+determined+in+hydrated+cells+with+environmental+scanning+electron+microscopy.">Epidermal growth factor receptor subunit locations determined in hydrated cells with environmental scanning electron microscopy.</a> Sci. Rep. 3, 2621-2626 (2013).</li><li>Peckys, D. B., Korf, U., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+variations+of+HER2+dimerization+in+breast+cancer+cells+discovered+by+correlative+fluorescence-+and+liquid+electron+microscopy.">Local variations of HER2 dimerization in breast cancer cells discovered by correlative fluorescence- and liquid electron microscopy.</a> Science Advances. under revision, (2015).</li><li>Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+and+electron+microscopic+imaging+of+multiple+endogenous+proteins+using+Quantum+dots.">Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots.</a> Nat. Meth. 2, 743-749 (2005).</li><li>Herbst, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+epidermal+growth+factor+receptor+biology.">Review of epidermal growth factor receptor biology.</a> Int. J.Radiat. Oncol. Biol. Phys. 59, S21-S26 (2004).</li><li>Normanno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+signaling+in+cancer.">Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer.</a> Gene. 366, 2-16 (2006).</li><li>Hofman, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+induces+coalescence+of+different+lipid+rafts.">EGF induces coalescence of different lipid rafts.</a> J. Cell Sci. 121, 2519-2528 (2008).</li><li>Irwin, M. E., Mueller, K. L., Bohin, N., Ge, Y., Boerner, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+raft+localization+of+EGFR+alters+the+response+of+cancer+cells+to+the+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitor+gefitinib.">Lipid raft localization of EGFR alters the response of cancer cells to the EGFR tyrosine kinase inhibitor gefitinib.</a> J. Cell Physiol. 226, 2316-2328 (2011).</li><li>Lillemeier, B. F., Pfeiffer, J. R., Surviladze, Z., Wilson, B. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane-associated+proteins+are+clustered+into+islands+attached+to+the+cytoskeleton.">Plasma membrane-associated proteins are clustered into islands attached to the cytoskeleton.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 103, 18992-18997 (2006).</li><li>Mayawala, K., Vlachos, D. G., Edwards, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneities+in+EGF+receptor+density+at+the+cell+surface+can+lead+to+concave+up+scatchard+plot+of+EGF+binding.">Heterogeneities in EGF receptor density at the cell surface can lead to concave up scatchard plot of EGF binding.</a> FEBS Lett. 579, 3043-3047 (2005).</li><li>Valley, C. C., Lidke, K. A., Lidke, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatiotemporal+organization+of+ErbB+receptors:+insights+from+microscopy.">The spatiotemporal organization of ErbB receptors: insights from microscopy.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 6, (2014).</li><li>Peckys, D. B., Bandmann, V., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+fluorescence-+and+scanning+transmission+electron+microscopy+of+quantum+dot+labeled+proteins+on+whole+cells+in+liquid.">Correlative fluorescence- and scanning transmission electron microscopy of quantum dot labeled proteins on whole cells in liquid.</a> Meth. Cell Biol. 124, 305-322 (2014).</li><li>Peckys, D. B., Dukes, M. J., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+fluorescence+and+electron+microscopy+of+quantum+dot+labeled+proteins+on+whole+cells+in+liquid.">Correlative fluorescence and electron microscopy of quantum dot labeled proteins on whole cells in liquid.</a> Methods Mol. Biol. 1117, 527-540 (2014).</li><li>Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+nitride+windows+for+electron+microscopy+of+whole+cells.">Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells.</a> J. Microsc. 243, 273-283 (2011).</li><li>Bogner, A., Thollet, G., Basset, D., Jouneau, P. H., Gauthier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wet+STEM:+A+new+development+in+environmental+SEM+for+imaging+nano-objects+included+in+a+liquid+phase.">Wet STEM: A new development in environmental SEM for imaging nano-objects included in a liquid phase.</a> Ultramicroscopy. 104, 290-301 (2005).</li><li>Chung, I., Akita, R., Vandlen, R., Toomre, D., Schlessinger, J., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+control+of+EGF+receptor+activation+by+reversible+dimerization+on+living+cells.">Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells.</a> Nature. 464, 783-787 (2010).</li><li>Stoyan, D., Stoyan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+pair+correlation+functions+of+planar+cluster+processes.">Estimating pair correlation functions of planar cluster processes.</a> Biom. J. 38, 259-271 (1996).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+tumor-targeted+fluorescence+imaging+using+near-infrared+non-cadmium+quantum+dots.">In vivo tumor-targeted fluorescence imaging using near-infrared non-cadmium quantum dots.</a> Bioconjug. Chem. 21, 604-609 (2010).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+super-resolution+fluorescence+microscopy+to+work.">Putting super-resolution fluorescence microscopy to work.</a> Nat. Meth. 6, 21-23 (2009).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem. Sci. 32, 407-414 (2007).</li><li>Warren, C. M., Landgraf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+through+ERBB+receptors:+Multiple+layers+of+diversity+and+control.">Signaling through ERBB receptors: Multiple layers of diversity and control.</a> Cell. Signal. 18, 923-933 (2006).</li><li>Leuchowius, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+visualization+of+multiple+protein+complexes+in+individual+cells+in+tumor+tissue.">Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue.</a> Mol. Cell. Proteomics. 12, 1563-1571 (2013).</li><li>Hoenger, A., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+macromolecular+organization+of+cells+by+electron+tomography.">Probing the macromolecular organization of cells by electron tomography.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 21, 89-96 (2009).</li><li>Zhang, J., Leiderman, K., Pfeiffer, J. R., Wilson, B. S., Oliver, J. M., Steinberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+topography+of+membrane+receptors+and+signaling+molecules+from+spatial+patterns+obtained+using+nanometer-scale+electron-dense+probes+and+electron+microscopy.">Characterizing the topography of membrane receptors and signaling molecules from spatial patterns obtained using nanometer-scale electron-dense probes and electron microscopy.</a> Micron. 37, 14-34 (2006).</li><li>Pinto da Silva, P., Kan, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-fracture:+a+method+for+high+resolution+labeling+of+cell+surfaces.">Label-fracture: a method for high resolution labeling of cell surfaces.</a> J. Cell Biol. 99, 1156-1161 (1984).</li><li>Bergersen, L. H., Storm-Mathisen, J., Gundersen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogold+quantification+of+amino+acids+and+proteins+in+complex+subcellular+compartments.">Immunogold quantification of amino acids and proteins in complex subcellular compartments.</a> Nat. Protoc. 3, 144-152 (2008).</li><li>Orlov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+immunogold+labelling+of+RNA+polymerase.">Live cell immunogold labelling of RNA polymerase.</a> II. Sci. Rep. 5, 8324 (2015).</li><li>Fiala, G. J., Kaschek, D., Blumenthal, B., Reth, M., Timmer, J., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clustering+of+the+B+cell+antigen+receptor+demonstrated+by+mathematically+extended+electron+microscopy.">Pre-clustering of the B cell antigen receptor demonstrated by mathematically extended electron microscopy.</a> Front. Immunol. 4, 427 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

לומד את הפריסה המרחבית והרכב של החלבונים בממברנה, כגון EGFR, בכל תאים מספק מידע חשוב על הקשר תפקודו ושינויים האפשריים 11-14. זה מאתגר ללמוד ההפצה של מונומרים, הדימרים, ואשכולות ישירות על רמת subcellular באמצעות שיטות ביוכימיות נפוצות, שמידע הולך לאיבוד על הלוקליזציה של החלבון בתא או הבדלים בין תאי 15. שיטות התיוג ומיקרוסקופיה המתוארות כאן מאפשרות ההדמיה של קומפלקסי חלבונים בקנה מידת אורך של ננומטרים ספורים, כך שstoichiometry ניתן ללמוד בהקשר של תאים בודדים, שלמים 4-7. זה לא אפשרי עם (רזולוציה סופר) מיקרוסקופ אור 23 כי החלטתה אינה מספיקה כדי להבחין מולקולות העוסקות בחלבון מורכב. העברת פורסטר תהודת אנרגיה (סריג) היא טכניקת מיצוע הרכב &lt;sup&gt; 24, ולא בהכרח לזהות את הדימרים ואשכולות מסדר גבוהים יותר כתוצאה מהטווח הקצר של העברת אנרגיית 25. מבחני קשירת קרבה 26 לא באמת למדוד מרחקים ולכן אינם מסוגל להבחין בין אזור סלולארי עם צפיפות גבוהה של חלבון, באופן בלתי נמנע מוביל למספר קרבה זוהתה במקרה אקראי, מאזור סלולארי עם צפיפות חלבון דומה אבל מכילים חלבון מתחמים מציגים מרחקים שונים בין התוויות. הרזולוציה הגבוהה הנדרשת כדי להמחיש את המרכיבים של קומפלקסי חלבונים מושגת על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים הילוכים (TEM). עם זאת, TEM הקונבנציונלי של כל תאים מוגבלים על ידי הדרישה של דגימות / חלקים דקים חותכים את קרום הפלזמה 27, או קריעת קרום פלזמה או ניתוק 28,29 וכתוצאה מכך נוצרו באופן אקראי חתיכות קטנות של קרום. קרום הפלזמה ובכך לא הוא צילם בכללותו, שהוביל לחוסרמידע הקשר סלולארי של אולי מכריע. אתגרים ניסיוניים אחרים ללימוד stoichiometry חלבון בתאים נובעים מתיוג החלבון שימושי. בדרך כלל immunolabeling משמש נושא את הקושי שstoichiometry אחד-על-אחד בין קולט ותווית יכול להיות מושגת רק עם בדיקה חד ערכי; זה לא המקרה כאשר נוגדנים ראשוניים ומשניים נדרשים. כדי לקבל מידע על stoichiometry החלבון, נדרש כי בדיקה נקשר באופן ייחודי לאפיטופ אחד על קולט ויש אתר קישור אחד לבדיקת ניאון או ננו-חלקיקי מספר אטומיים גבוהים בצד השני. שנית, דיוק השגה עם נוגדן תיוג מוגבל על חשבון הגודל הגדול שלהם 30-30 ננומטר, כך שאפליה בין חלבונים השכנים יחידים, homodimers, או אשכולות גדולים היא לא ריאלי, לפחות לא לקולטנים של משפחת EGFR. תוויות ספציפיות הרבה יותר קטנות ידועות בספרות ובCAn להיות מיושם גם לתיוג תאיים 31 אבל אלה אינם נפוצים. אורכו של כל התווית (EGF ביוטין-streptavidin-QD) הוא מממד דומה כמו EGFR, וקטן מספיק כדי להיות מסוגל לזהות את דימר. יתר על כן, הליך תיוג שני שלבים המתוארים ימנע אשכולות קולט תיוג מושרה. השיטה שלנו היא לא מאוד קשה, לא הרבה יותר ממיקרוסקופ פלואורסצנטי של חלבונים שכותרתו. עם זאת, ניסוי צריכה להתבצע בזהירות רבה, שכן את מספר הצעדים מוסיף ושגיאה באחד מהשלבים עלולה להוביל לכישלון מוחלט בניסוי. טיפול השבבים הוא לא יותר מאשר מייגע הטיפול ברשתות TEM אבל כמה שבבים ריקים אימון מומלץ. ESEM-גזע של תאי התייבשות כל הוא כנראה ההיבט הקשה ביותר, ודורש לפחות מפעיל מיומן וכמה ימים של תרגול כדי להגיע להחלטה סביב 3 ננומטר לפי צורך כדי להמחיש את QDs. סכר קרינהגיל של הדגימה תחת החקירה מציג סיכון. הלחץ והטמפרטורה צריכים להיות במעקב בזהירות כדי לשמור על שכבת מים. יתר על כן, עובי שכבת המים עשוי להשתנות בין תאים. מומלץ לעקוב אחר הנוכחות של שכבת המים באמצעות גלאי אלקטרונים גזים מעל הדגימה, כפי שתואר במקום אחר 6. אזורים סלולריים רק צריכים להיות צילמו פעם או פעמיים, כדי למנוע נזק. מגבלה העיקרית של השיטה היא שהמידע ברזולוציה גבוהה על ultrastructure נעדר. טכניקות אחרות, למשל, TEM cryo, יש צורך ללמוד את מבנה החלבון, וultrastructure הסלולרי 15. שנית, לומדים את יחסי הגומלין הדינמיים של מספר רב של חלבונים בתא חי במיקרוסקופ הזמן לשגות הוא לא ריאלי על חשבון נזקי קרינה, ודורש מדינה של האמנות מיקרוסקופ אור 23. נכון לעכשיו, השיטה שלנו היא לא מסוגלת לקבוע את הרמה המוחלטת של הדימרים מאז lיעילות abeling אינה ידועה, אך אנו מצפים להוסיף נתונים כאלה בעתיד. זה בכל זאת אפשרי לדעת אם הדימרים נמצאים או לא. מהספרות ידועה זה, שגם יעילות תיוג כ -15% היא מספיק כדי לזהות הדימרים עם מובהקות סטטיסטיות מספקות 32. אפשר בקלות ללמוד קולטני קרום הנכנס אחרים באמצעות יגנד, באמצעות שברי Fab biotinylated של נוגדנים ספציפיים, או באמצעות linkers הקטן האחר 7 באמצעות פרוטוקול תיוג שני שלבים שתואר. מאז יש לנו כבר הוכחנו ששני צבעים שונים (גדלים) של QDs יכולים לשמש, ותיוג ננו-חלקיקי הזהב שימש בעבודה לפני 6, נראה ריאלי לתייג מיני חלבון מרובים באותו הניסוי. האתגר המרכזי לחקר ההרכב של מיני חלבון מרובים הוא להבטיח יעילות תיוג דומה בשני המינים או לפחות נורמליזציה של stoichiometry היחסי שהושג בכבודive יעילות תיוג. עם זאת, לא נראה שני QDs שונה ששמש במחקר זה לשונה בהרבה ביעילות תיוג (ראה איורים 2 ו -4). השיטה המתוארת מעורבת תיוג שני שלבים עם QDs, ומיקרוסקופ פלואורסצנטי הגומל וESEM גזע מציגה שיטת קיימא ללמוד את יחסי הגומלין המורכבים של חלבוני קרום בקרום הפלזמה שלם של כל תאים.

גישה חדשה הוצגה לאחרונה, לכל תאי תמונה עם חלבונים שכותרתו במצב נוזלי באמצעות גזע 1-3, או מיקרוסקופ פלואורסצנטי הגומל וגזע 4-7. מתודולוגיה זו היא מסוגלת ללמוד את הפריסה המרחבית של חלבונים בממברנה וקומפלקסי חלבונים כוללים stoichiometry ברמת המולקולה בודדת בממברנות הפלזמה שלמות של כל תאים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מעורב תיוג ספציפי שני שלבים של חלבוני הקולטן עם נקודות קוונטיות ניאון (QDs) 8, ומיקרוסקופ אור הגומלת וESEM-גזע. כדוגמא, למדנו EGFR, חלבון קרום ששייך לsuperfamily קינאז החלבון. על יגנד מחייב, קולט מפעיל ולאחר מכן יוצר דימר עם עוד EGFR הופעל; מפל האות הבא מניע תא התפשטות 9. מוטציות שמובילות לביטוי EGFR החריג או פעילות לשחק תפקיד מרכזי בסוגים רבים של סרטן 10. ת&#39;מחקרז הסידור המרחבי של הקולטן קרום זה בכל תאים מספק מידע חשוב על הקשר תפקודו ושינויים האפשריים 11-14. אבל הוא נשאר מאתגר לחקור את ההפצה של מונומרים EGFR, הדימרים, ואשכולות ישירות ברמה תאית (משנה) עם שיטות מיקרוסקופיה biochemical- או קונבנציונליות 15. השיטה שלנו מסוגלת לדמיין EGFRs עם רזולוציה מרחבית של כמה ננומטרים כך שמיקומם של חלבונים במתחם ניתן לקבוע. והכי חשוב, המידע שהושג על חלוקת stoichiometric מתייחס למצב המקורי של החלבון בתא ללא פגע. על מנת להשיג מרחק קצר בין התווית והקולט, EGFR תויג ישירות דרך EGF ליגנד, באמצעות אג&quot;ח ביוטין-streptavidin לQD. תווית זו יכולה להיות מזוהה גם עם מיקרוסקופ אלקטרונים וfluorescence-. יש לנו בשימוש בתווית זו להדמיה מתאם של תאי COS7 בהנוזל הסגור בתא microfluidic 1,16,17 בעבר. עם זאת, על חשבון מספר רב של מולקולות streptavidin לQD, תווית זו עשויה לגרום לאשכולות קולט, שמוביל ליעילות תיוג נמוכה או ניסויים יקרים למדי, ולא ניתן להסיק על ההרכב של החלבון הנחקר. ניתן להימנע מאשכולות קולט מושרה תווית לגמרי על ידי שימוש בהליך תיוג שני שלבים שהוצג כאן, וכתוצאה מכך בדיקה הכוללת EGF biotinylated שרק אחד נקודת streptavidin-קוונטים (STR-QD) בשילוב. התאים מודגרת ראשון עם EGF biotinylated, ולאחר מכן קבוע. צעד הקיבעון קובע את נקודת הזמן שבה תהליכי החלבון הם עצרו (בהתאם למהירות של קיבעון). STR-QD מיושם לאחר מכן כצעד שני של פרוטוקול התיוג. אשכולות אינם מתקיימים מאז תנועת קרום הדינמית של החלבונים היא הפריעה פעם החלבונים קבועות. יתר על כן, פתרון STR-QD, המהווה אתרוב הרכיב היקר של הניסוי, יכול להיות מיושם בריכוז נמוך מותאם, וצעד שני זה של תיוג הוא לא בזמן קריטי, כלומר, QD יכול להיות יחד בכמה דקות. כדי לחקור את ההרכב של EGFR כמופץ בכל תאים, דגימות סלולריות הוכנו על השבבים סיליקון 18. לאחר החלת תיוג שני שלבי QD, וההקלטה של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, התאים היו שטופים במים טהורים, וצלמו במדינת התייבשות באמצעות ESEM-גזע 19. תמונות גומלות וכתוצאה מלספק מידע על ההפצה הסלולרית EGFR, וstoichiometry בהקשר הטבעי שלהם של תאי התייבשות. שיטה דומה שימשה ללמוד חלבוני HER2 בתאי סרטן השד במחקר שנערך לאחרונה 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>AF6000 + DMI6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESEM</td>
			<td>FEI Company</td>
			<td>Quanta 400 FEG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x) + GlutaMax + glucose + pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1x) - Calcium chloride - Magnesium chlorid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum, Performance Plus (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstripper</td>
			<td>Mediatech, Inc.</td>
			<td>25-056 Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, chromasolv Plus for HPLC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34877-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Roti-Stock 10x PBS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>1058.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Rotisolv HPLC grade</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P076.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V, biotin-free (BSA)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>O163.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin, from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7041-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T873.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shoul</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>E3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium teraborate decahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9640-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qdot 655 streptavidin conjugate</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>Q10121MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qdot 800 streptavidin conjugate</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>Q10173MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon microchips with silicon nitride membranes</td>
			<td>DENS Solutions</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>of 50 nm thickness and dimensions of 50 &#181;m x 0.40 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the stoichiometry of epidermal growth factor receptor in intact cells using correlative microscopy

פרוטוקול זה מתאר את התיוג של הקולטן לגורם הגדילה באפידרמיס (EGFR) בתאי פיברובלסטים COS7, ומיקרוסקופ פלואורסצנטי הגומל לאחר מיקרוסקופית סריקה סביבתית אלקטרון (ESEM) של תאים בכל מדינת התייבשות. נקודות פלורסנט קוונטים (QDs) היו מצמידים את EGFR באמצעות פרוטוקול תיוג שני שלבים, מתן תיוג חלבון יעיל וספציפי, תוך הימנעות אשכולות מושרה תווית של קולט. מיקרוסקופ פלואורסצנטי סיפק תמונות סקירה של המקומות הסלולריים של EGFR. הגלאים מיקרוסקופי אלקטרונים הילוכים סריקה (STEM) שימש כדי לזהות את תוויות QD עם רזולוציה של ננו. תמונות גומלות וכתוצאה מלספק נתונים של ההפצה הסלולרית EGFR, וstoichiometry ברמה המולקולרית היחידה בהקשר הטבעי של התא שלם התייבשות. תמונות ESEM הגזע חשפו את קולט להיות נוכח כמונומר, כhomodimer, ובקבוצות קטנות. תיוג עם שני QDs שונה,כלומר, אחד פולט ב655 ננומטר וב 800 חשף תוצאות אופייניות דומות.

איור 1 ו -2 להראות תמונות של נציג QD655 EGFR שכותרתו, קרום הנכנס דמיינו ב, COS-7 התייבשות מלאה תאים שלמים. תמונת DIC באיור 1 נותנת רושם של הטופוגרפיה הקרום של התאים, ותמונת הקרינה המקבילה באיור 1b מתארת ​​את חלוקת EGFR לאחר 3 דקות של הדגירה. איור 1 א EGF-ביוטין ו- B כל מאוחה משני תמונות שתועדו במטרת אוויר 40X. EGFR מופעל EGF מופץ על פני כל הסלולרי. ברוב תאי שיפור קל של הקרינה (איור 1) ניתן לראות בקצות התא, המצביע על שכיחות מוגברת באופן מקומי של EGFR 20. ניסויים שנערכו בקרה באמצעות פרוטוקול דומה מאומתים תיוג EGFR ספציפי (מידע לא מוצג). בקרות אלה כללו: 1) תיוג שליטה ללא דגירה קודמת של ceLLS עם EGF ביוטין, כלומר, דגירה רק עם STR-QDs, ו -2) דגירה עם EGF שאינה biotinylated וSTR-QDs. שלושה התאים מסומנים במלבנים נחקרו נוסף עם ESEM-גזע. תמונות ESEM הגזע מתוארות בתרשים 1C - E להראות סקירות הגדלה נמוכות של תאים אלה. תמונות אלה משקפים שידור תאים שלמים במדינת התייבשות בשכבה דקה של מים המתגוררים מעל לתא ממוקם על שבב סיליקון עם סיליקון ניטריד חלון (חטא) צפייה. תא הוואקום באדי המים מיקרוסקופ הכיל, והאיזון בין טמפרטורה ולחץ מדגם הותאם כדי לשמור על שכבה דקה של נוזל על פני התאים. יכולים להיות מוכרים התאים הבודדים בקלות על חשבון צורתם והמיקום על חלון קרום החטא. תמונות ESEM הגזע נמוכה ההגדלה לחשוף מבנים עדינים, כגון filopodia, המשתרעות מקצה התא לתאים שכנים, וכמה מבניםבתוך אזורי התא דקים יותר. אזורים סלולריים מרכזיים עבים כוללים הגרעין מופיעים לבנים כי שידור דרך המדגם לא ניתן לאלקטרונים של האנרגיה המשמשת (30 אנרגיה של keV). תמונות ESEM גזע ברזולוציה גבוהה נרשמו באזורים דקים יותר, ההיקפיים. הרזולוציה מרחבית לESEM-גזע של חלקיקים באזורים הדקים של תאים בשכבת נוזל דקה נקבעה במחקר קודם 6 להסתכם 3 ננומטר. ארבע תמונות ברזולוציה גבוהה המוצגות באיור 2 א - ד נרשמו במיקומים של המלבנים הקטנים באיור 1 ג - א משמש הגדלה הייתה מספיק כדי להבחין QDs הבודד, המופיע מוטות בהירות כ, בצורת כדור, כל אחד מחויב ליחיד EGFR. יש QD655 ממדים אופייניים של 6 x 14 ננומטר 2. איור 2 א (המקביל לאזור המלבני הצביע על התא בFiguמחדש 1C) מראה תוויות QD על קרום לקפל באלכסון חוצות את התמונה. יש מבנה קרום זה צפיפות EGFR גבוהה מאזורי הקרום שמסביב. בכמה מקומות, שתי תוויות היו בקרבת מקום. שתי דוגמאות עם מרחקים של 20 ו -24 ננומטר מצוינים עם ראשי חץ. זוגות אלה של תוויות מתפרשים כשייכים להדימרים EGFR. איור 2 נותן דוגמא מקצה תא (איור 1D, מלבן משמאל), ניתן לראות מונומרים EGFR והדימרים גם כן. איור 2C (איור 1 ג, מלבן מימין) נרשם באזור עם אות נמוכה הקרינה, כלומר, צפיפות נמוכה EGFR. עם זאת, EGFR נמצא גם כאן בהדימרים גם כן. בנוסף, שני אשכולות של 10 או 11 EGFRs נכחו (ראה אליפסות). איור 2 ד מציג דוגמא נוספת לקיפול קרום (איור 1E) עם אשכולות קטנים יותר, כולל 5-6 EGFRs, בנוסף לכמה מונומריםוהדימרים. כדוגמא לסוג של מידע שניתן להשיג מהנתונים אלה, גרם פונקצית 21 מתאם זוג (x) נקבע לכל עמדות התווית באיור 2. שימו לב שניתוח זה אינו חלק מפרוטוקול זה וההליך שתואר במקום אחר 6,7. g (x) הוא מדד של הסיכוי של חלקיק להימצא בתוך x מרחק רדיאלי מסוים מחלקיקי התייחסות. g (x) = 1 מייצג הפצה אקראית, וערך גדול יותר הוא ראיות לאשכולות. העמדות של כולל של 210 תוויות היו מזוהות באופן אוטומטי בארבע תמונות של איור 2 א-ד, ו-ז &#39;(x) חושב באמצעות סל גודל של 5 ננומטר ומסנן החלקה עם רוחב פס של 10 ננומטר. עקומת g (x) (איור 3) מראה מרחק QD מועדף מרכז למרכז של 25 ננומטר. EGFRs בכך לא באופן אקראי בכיוון אבל חלק ניכר מהם מתגורר במרחק מועדף זה. מapproximatמודל מולקולרי דואר 6 (איור הבלעה 3) אנו מעריכים כי מרחק מרכז למרכז בין הכיס מחייב EGF QD ומסתכם ~ מרחק 14 ננומטר, ומרכז למרכז בין שני QDs מחובר לדימר EGFR ל להיות ~ 27 ננומטר (ערך זה עשוי להשתנות לפי ננומטרים ספורים בשל הגמישות של מקשר). מרחק התווית המועדפת הוא בקנה אחד עם כך שמרחק התווית הצפוי לדימר EGFR בתוך הדיוק של השיטה. ז העקומה (x) היא גדולה יותר מאשר אחדות למרחק של עד 300 ננומטר, המעידה על הנוכחות של אשכולות, עולה בקנה אחד עם הנתונים. ניתוח זה מראה כי ההרכב של EGFR ניתן ללמוד עם השיטה שלנו. איור 4 מראה תוצאה דומה כמו איור 2, פרט לכך שהתיוג בוצע עם EGF-QD800, ומטרת טבילת 63X שמן שימשה לתמונת הקרינה. הנתונים אלה מאשרים כי תוצאות טיפוסיות אלה נמצאים גם כאשרתיוג EGFR נעשה עם QDs, אשר פולט בספקטרום האדום ליד. איור 4 א הוא תמונת הקרינה של תא נציג, איור 4 מציגה את אותו התא במצב סקירת ESEM גזע ואיור 4C הוא תמונה בהגדלת 150,000 x, נרשמה בגבול העליון של קרום התא (ראה מלבן באיור 4). בדומה לאיור 2 א ו- D, התמונות ללכוד EGFR כותרת QD על פי קרום ומראה קולטנים monomeric, dimeric, והתקבצו. שים לב שליבת QD הצפוף האלקטרון מופיעה מעט קטן יותר ועגולה יותר הליבות של QDs פולטות ב655 ננומטר, עולה בקנה אחד עם הגודל שלהם קטן יותר הליבה של 22 ~ 5 ננומטר. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53186/53186fig1.jpg" /> איור 1. המתאם דסק&quot;ש, הקרינה וESEM-גזע של EGF-QD655 כותרת EGFR על COS-7 התייבשות מלאה תאים </stRong&gt;. תמונה () דסק&quot;ש של התאים שגודל באזור חלון קרום החטא, נותנים רושם טופוגרפי של קרום הפלזמה. תמונת פלואורסצנטי (B) מראה תאים בחלון קרום SiN במיקום המרכזי (מסומנת במלבן המקווקו). (C - E) שלוש תמונות בהגדלה נמוכה ESEM-גזע מהתאים המסומנים במלבנים בA ו- B. תמונות סקירת תא אלו משמשות כדי לקבוע את המיקום המדויק של תמונות ברזולוציה גבוהה שנרשמו לאחר מכן. המיקום של ארבע תמונות ברזולוציה גבוהה (שמוצגים באיור 2 א-ד) מסומנים במלבנים לבנים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53186/53186fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53186/53186fig2.jpg" /> <strong&gt; 2. תמונות ESEM גזע ברזולוציה גבוהה איור המתארים EGFRs קרום מחויב. מיקרוסקופ () בהגדלה 75,000X של האזור המסומן באיור 1. מונומרים רבים גלויים. כמה הדימרים מצוינים עם ראשי החץ. (ב) ותמונות (ג) שנרכשו בהגדלה 50,000X של השמאל, אזורי בהתאמה הנכונים, קרום מסומן בתרשים 1C. אשכולות של EGFRs מפורטים. תמונה (ד) נרשמה עם הגדלה 50,000X במיקום המסומן באיור 1D. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53186/53186fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53186/53186fig3.jpg" /> איור 3. g פונקצית מתאם הזוג (x) כפונקציה של המרחק הרדיאלי x נקבע לבין-Parti<html> מרחקי CLE של כל 210 התוויות זוהו באיור 2 א-ד. השיא של 25 ננומטר מצביע על כך שיש מרחק QD מרכז למרכז סיכוי הרבה יותר גבוה של המתרחש מ אקראי, לפי AG (x) = 1 מציינת סיכוי אקראי. הקו המקווקו הוא מדריך לז העין מייצגת (x) של הפצה אקראית. הבלעה מציגה מודל מולקולרי משוער של דימר EGFR עם EGF הכפות וQDs streptavidin המצופה המחובר באמצעות ביוטין. המודלים של streptavidin, EGF וEGFR התקבלו ממודלים של CPK 1stp (streptavidin), 1EGF (EGF), 1NQL, 2JWA, 1M17, 1IVO ו2GS6 (EGFR) מבנים בחלבון חלבון RCSB מאגר, שנוצר על ידי Jmol גרסה 12.2.15. מודל ביוטין הוא כפי שצייר בRCSB יגנד Explorer גרסת 1.0. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53186/53186fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> /53186/53186fig4.jpg &quot;/&gt; איור 4. תא מופת COS-7 שכותרתו עם EGF-QD800 וצלם עם הקרינה גומלת וESEM-גזע. (א) תמונת הקרינה, (ב) תמונת ESEM גזע סקירת הגדלה נמוכה. תמונה ברזולוציה גבוהה שנרשמה במיקום של המלבן בב ב150,000X הגדלה (C). EGFRs monomeric, dimeric, והתקבץ מזוהים דומה לתיוג עם EGF-QD655. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53186/53186fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy at JoVE.com

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

לומד את ההרכב של עוריות Growth Factor Receptor בתאים השלמים באמצעות מתאם מיקרוסקופית

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

studying-stoichiometry-epidermal-growth-factor-receptor-intact-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.3K Views.  INM-Leibniz Institute for New Materials. This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level. 

Video: Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new devices for label-free separation and analysis of cells1. Such devices may use lateral displacement for continuous-flow separation, or receptor patterns that modulate adhesion to distinguish between different cell phenotypes or levels of receptor expression. Understanding the nature of cell rolling trajectories on receptor-patterned substrates is necessary for engineering of the substrates and design of such devices.
Here, we demonstrate a protocol for studying cell rolling trajectories on asymmetric receptor patterns that support cell rolling adhesion2. Well-defined, &mu;m-scale patterns of P-selectin receptors were fabricated using microcontact printing on gold-coated slides that were incorporated in a flow chamber. HL60 cells expressing the PSGL-1 ligand 3were flowed across a field of patterned lines and visualized on an inverted bright field microscope. The cells rolled and tracked along the inclined edges of the patterns, resulting in lateral deflection1. Each cell typically rolled for a certain distance along the pattern edges (defined as the edge tracking length), detached from the edge, and reattached to a downstream pattern. Although this detachment makes it difficult to track the entire trajectory of a cell from entrance to exit in the flow chamber, particle-tracking software was used to analyze and yield the rolling trajectories of the cells during the time when they were moving on a single receptor-patterned line. The trajectories were then examined to obtain distributions of cell rolling velocities and the edge tracking lengths for each cell for different patterns.
This protocol is useful for quantifying cell rolling trajectories on receptor patterns and relating these to engineering parameters such as pattern angle and shear stress. Such data will be useful for design of microfluidic devices for label-free cell separation and analysis.

We describe a protocol to observe and analyze cell rolling trajectories on asymmetric receptor-patterned substrates. The resulting data are useful for engineering of receptor-patterned substrates for label-free cell separation and analysis.

מסלולי לימוד Cell רולינג על דפוסי קולטן אסימטרית

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new ...

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata are separated from their axon terminals due to skeletal growth of the enlarging organism (Weiss 1941; Gray, Hukkanen et al. 1992). This mechanotransduction induces a secondary mode of neuronal growth capable of accommodating continual elongation of the axon (Bray 1984; Heidemann and Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al. 1995; Pfister, Iwata et al. 2004).
Axon Stretch Growth (ASG) is conceivably a central factor in the maturation of short embryonic processes into the long nerves and white matter tracts characteristic of the adult nervous system. To study ASG in vitro, we engineered bioreactors to apply tension to the short axonal processes of neuronal cultures (Loverde, Ozoka et al. 2011). Here, we detail the methods we use to prepare bioreactors and conduct ASG. First, within each stretching lane of the bioreactor, neurons are plated upon a micro-manipulated towing substrate. Next, neurons regenerate their axonal processes, via growth cone extension, onto a stationary substrate. Finally, stretch growth is performed by towing the plated cell bodies away from the axon terminals adhered to the stationary substrate; recapitulating skeletal growth after growth cone extension.
Previous work has shown that ASG of embryonic rat dorsal root ganglia neurons are capable of unprecedented growth rates up to 10mm/day, reaching lengths of up to 10cm; while concurrently resulting in increased axonal diameters (Smith, Wolf et al. 2001; Pfister, Iwata et al. 2004; Pfister, Bonislawski et al. 2006; Pfister, Iwata et al. 2006; Smith 2009). This is in dramatic contrast to regenerative growth cone extension (in absence of mechanical stimuli) where growth rates average 1mm/day with successful regeneration limited to lengths of less than 3cm (Fu and Gordon 1997; Pfister, Gordon et al. 2011). Accordingly, further study of ASG may help to reveal dysregulated growth mechanisms that limit regeneration in the absence of mechanical stimuli.

A unique tissue engineering method was developed to elongate numerous nerve fibers in culture by recapitulating axon stretch growth; a form of nervous system growth whereby nerves elongate in conjunction with growth of the enlarging body.

אקסון צמיחה מתיחה: Mechanotransduction הצמיחה העצבית

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. Urgent need exists to develop novel clinically-translatable therapeutic strategies that can improve on the dismal survival statistics of pancreatic cancer patients. Although gene therapy in cancer has shown a tremendous promise, the major challenge is in the development of safe and effective delivery system, which can lead to sustained transgene expression. 
Gelatin is one of the most versatile natural biopolymer, widely used in food and pharmaceutical products. Previous studies from our laboratory have shown that type B gelatin could physical encapsulate DNA, which preserved the supercoiled structure of the plasmid and improved transfection efficiency upon intracellular delivery. By thiolation of gelatin, the sulfhydryl groups could be introduced into the polymer and would form disulfide bond within nanoparticles, which stabilizes the whole complex and once disulfide bond is broken due to the presence of glutathione in cytosol, payload would be released 2-5. Poly(ethylene glycol) (PEG)-modified GENS, when administered into the systemic circulation, provides long-circulation times and preferentially targets to the tumor mass due to the hyper-permeability of the neovasculature by the enhanced permeability and retention effect 6. Studies have shown over-expression of the epidermal growth factor receptor (EGFR) on Panc-1 human pancreatic adenocarcinoma cells 7. In order to actively target pancreatic cancer cell line, EGFR specific peptide was conjugated on the particle surface through a PEG spacer.8
Most anti-tumor gene therapies are focused on administration of the tumor suppressor genes, such as wild-type p53 (wt-p53), to restore the pro-apoptotic function in the cells 9. The p53 mechanism functions as a critical signaling pathway in cell growth, which regulates apoptosis, cell cycle arrest, metabolism and other processes 10. In pancreatic cancer, most cells have mutations in p53 protein, causing the loss of apoptotic activity. With the introduction of wt-p53, the apoptosis could be repaired and further triggers cell death in cancer cells 11. 
Based on the above rationale, we have designed EGFR targeting peptide-modified thiolated gelatin nanoparticles for wt-p53 gene delivery and evaluated delivery efficiency and transfection in Panc-1 cells.

Type B gelatin-based engineered nanovectors system (GENS) was developed for systemic gene delivery and transfection in the treatment of pancreatic cancer. By modification with epidermal growth factor receptor (EGFR) specific peptide on the surface of nanparticles, they could target on EGFR receptor and release plasmid under reducing environment, such as high intracellular glutathione concentrations.

משלוח ין transfection ב אדם בתאי סרטן הלבלב באמצעות גורם גדילה עוריות קולטן במיקוד לטין מבוסס Nanovectors מתוכנן

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

מיקרוסקופית גומלת לניתוח מבני 3D של אינטראקציות דינמיות

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

מדידת התכונות המכאניות של תאי חיים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to maintain cellular homeostasis. Puncture injury with glass needles provides a direct method to trigger a rapid epidermal wound response that activates wound transcriptional reporters, which can be visualized by a localized reporter signal in living embryos or larvae. Puncture or laser injury also provides signals that promote the recruitment of hemocytes to the wound site. Surprisingly, severe (through and through) puncture injury in late stage embryos only rarely disrupts normal embryonic development, as greater than 90% of such wounded embryos survive to adulthood when embryos are injected in an oil medium that minimizes immediate leakage of hemolymph from puncture sites. The wound procedure does require micromanipulation of the Drosophila embryos, including manual alignment of the embryos on agar plates and transfer of the aligned embryos to microscope slides. The Drosophila epidermal wound response assay provides a quick system to test the genetic requirements of a variety of biological functions that promote wound healing, as well as a way to screen for potential chemical compounds that promote wound healing. The short life cycle and easy culturing routine make Drosophila a powerful model organism. Drosophila clean wound healing appears to coordinate the epidermal regenerative response, with the innate immune response, in ways that are still under investigation, which provides an excellent system to find conserved regulatory mechanisms common to Drosophila and mammalian epidermal wounding.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The embryonic epidermis of very late stage Drosophila embryos provides an in vivo system for rapid puncture wound response analysis and can be combined with genetic manipulations or chemical microinjection treatments to advance studies in wound healing for translation into mammalian models.

Assay וMicroinjection פצע<em&gt; בvivo</em&gt; לוקליזציה של עוריות פצע הכתבים תגובה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating&#160;poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.

This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

גורם הגדילה Electrospinning שחרור מיקרוסכמות לתוך סיביים פיגומים

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone fusion. Large doses of highly potent biological agents are required due to growth factor instability as a result of rapid enzymatic degradation as well as carrier inefficiencies in localizing sufficient amounts of growth factor at implant sites. Hence, strategies that prolong the stability of growth factors such as BMP-2/NELL-1, and control their release could actually lower their efficacious dose and thus reduce the need for larger doses during future bone regeneration surgeries. This in turn will reduce side effects and growth factor costs. Self-assembled PECs have been fabricated to provide better control of BMP-2/NELL-1 delivery via heparin binding and further potentiate growth factor bioactivity by enhancing in vivo stability. Here we illustrate the simplicity of PEC fabrication which aids in the delivery of a variety of growth factors during reconstructive bone surgeries.

Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.

קומפלקס polyelectrolyte למשלוח גורם הגדילה osteogenic דומיין כריכה הפרין

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

מיקרוסקופי אלקטרונים בהירי-עור גומל באמצעות חלקיקי נקודה קוונטית

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein (HDL)-mimicking nanoparticles (NPs). HDLs are endogenous NPs and have been explored as vehicles for the delivery of therapeutic agents. Various methods have been developed to prepare HDL-mimicking NPs. However, they are generally complicated, time consuming, and difficult for industrial scale-up. In this study, one-step homogenization was used to mix the excipients and form the prototype NPs. NGF is a water-soluble protein of 26 kDa. To facilitate the encapsulation of NGF into the lipid environment of HDL-mimicking NPs, protamine USP was used to form an ion-pair complex with NGF to neutralize the charges on the NGF surface. The NGF/protamine complex was then introduced into the prototype NPs. Apolipoprotein A-I was finally coated on the surface of the NPs. NGF HDL-mimicking NPs showed preferable properties in terms of particle size, size distribution, entrapment efficiency, in vitro release, bioactivity, and biodistribution. With the careful design and exploration of homogenization in HDL-mimicking NPs, the procedure was greatly simplified, and the NPs were made scalable. Moreover, various challenges, such as separating unloaded NGF from the NPs, conducting reliable in vitro release studies, and measuring the bioactivity of the NPs, were overcome.

Simple homogenization was used to prepare novel, high-density, lipoprotein-mimicking nanoparticles to encapsulate nerve growth factor. Challenges, detailed protocols for nanoparticle preparation, in vitro characterization, and in vivo studies are described in this article.

הכנה ואפיון של נוזל HDL מחקה ננו-חלקיקים עבור אנקפסולציה גורם העצב הגדילה

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein ...