ההרכבה היעילה של מבנים supramolecular עבור עיצוב תאים מינימלי משלוח סמים נשאר מאתגר. כאן אנו מדגימים פרוטוקולים יעילים המניבים מבנים על-תאיים המבוססים על חלבונים אמפיפיליים דמויי אלסטין. פרוטוקולי ההרכבה המוצגים יוצרים מבנים על-תאיים רב-תכליתיים בעלי תכונות פיזיוכימיות הניתנות להתאמה, כגון וקסיקלים, סיבים וקוארבטים.
תאים מבוססי קרום חלבון מדגימים התנהגות של הפרדת פאזה ומאפשרים אנקפסולציה של מולקולות מטען פלואורסצנטיות מגוונות מבחינה כימית. לביטוי של F20E20-mEGFP ו- F20E20-mCherry, חסן את תרבות הביטוי העיקרית מקדם התרבות בן הלילה ל- OD600 של 0.3. דגירה זה 400 מיליליטר של בינוני LB סטרילי בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה ב 37 מעלות צלזיוס ו 200 סל"ד.
כאשר תרבות הביטוי מגיעה ל- OD600 של 0.5 עד 0.8, הוסף IPTG לריכוז סופי של מילימולר אחד, והקטן את טמפרטורת הדגירה ל - 20 מעלות צלזיוס. לביטוי של ELP אמפיפילי עם חומצת אמינו לא טבעית, לחסן את תרבות הביטוי העיקרית מן הלילה E.coli טרום תרבות המכילה את הפלסמידים המתאימים OD של 0.3. דגירה זה 400 מיליליטר של בינוני LB סטרילי בתוספת קאנאמיצין וכלוראמפניקול ב 37 מעלות צלזיוס ו 200 סל"ד.
כדי להכין את מלאי חומצות האמינו הלא טבעיות 100 מילימולרית, להוסיף 206.2 מיליגרם של חומצת אמינו לא טבעית לשמונה מיליליטר של מים אולטרה-פלור. העלה את רמת ה- pH של הפתרון עם נתרן הידרוקסיד תלת-גוחן, ומערבבים במרץ. כאשר חומצת האמינו הלא טבעית מומסת, מנמיכים את ה- pH לכ- 10.5 ומוסיפים מים אולטרה-חמים לנפח של 10 מיליליטר.
סנן את הפתרון באמצעות מסנן סטרילי של 0.22 מיקרומטר, ולחץ עליו בצינורות תגובה של שני מיליליטר. כאשר תרבות הביטוי מגיעה OD600 של 0.5 כדי 0.8, להוסיף את חומצת האמינו הלא טבעית לריכוז הסופי של שני מילימולרים. דגירה זה במשך 10 דקות נוספות.
לאחר מכן לגרום לביטוי של חלבון היעד ואת הסינתטאז tRNA הדרוש באמצעות תוספת בו זמנית של IPTG ו arabinose. להפחית את טמפרטורת הדגירה ל 20 מעלות צלזיוס, ולאפשר ביטוי להמשיך במשך כ 20 שעות. לאחר הדגירה, לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס ו 4, 000 פעמים גרם במשך 40 דקות.
תן שימוש חוזר לכדור התא במאגר תיזה עם lysozyme ו- PMSF. דגירה הפתרון במשך 30 דקות על קרח. ואז להקפיא ולהפשיר אותו פעמיים על ידי טביעה בחנקן נוזלי.
Sonicate ההשעיה, ולנקה את lysate על ידי צנטריפוגה ב 10, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 40 דקות. לאחר מכן לטהר את החלבון באמצעות כרומטוגרפיה זיקה. לאחר אלוטיון החלבון, יש לאחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
הוסיפו מיקרוליטר אחד של צבע פלואורסצנטי ל-500 מיקרוליטרים של תמיסת ELP, ודאגו להגן עליו מפני אור במשך כ-10 שעות ב-15 מעלות צלזיוס תוך כדי טלטול בתרמומיקסר, תוך הקפדה להגן עליו מפני אור. כדי להסיר צבע פלואורסצנטי מוגזם, יש לצייד קרום דיאליזה במים אולטרה-חמים למשך 10 דקות. חותכים את הממברנה לגודל הנכון כדי להיות ממוקם על גבי הפתיחה של צינור התגובה עם פתרון ELP לחץ.
ואז לתקן את הממברנה לפתיחה על ידי סגירת הצינור עם מכסה שאין לו ליבה. מלאו את החלל בין המכסה לממברנה במאגר כדי למנוע השמנה של אוויר. לאחר מכן מניחים את צינור התגובה במאגר הנבחר, דוחפים אותו מתחת לפני השטח, ולהפוך אותו במהופך.
בצע דיאליזה במשך שלוש שעות לפחות בארבע מעלות צלזיוס, מה שמאפשר לדיאליזה להימשך לפחות שלוש שעות נוספות לאחר כל שינוי חיץ. עבור נפיחות THF, דיאליזה פתרון ELP הומוגני נגד חיץ פוספט או טריס עם pH יציב 7.5. מכינים את lyophilizer, ומצננים אותו לטמפרטורה ההתחלה לייבוש הקפאה.
עליות פתרון חלבון דיאליזה בצינורות תגובה 1.5 מיליליטר, ולאטום עם כובעים עם חור קטן, כדי למנוע לאבד את המדגם מוצק עקב שינויים בלחץ במהלך הקפאה ייבוש. להקפיא את הדגימות בחנקן נוזלי. מוציאים את דגימות החלבון הקפואות מהחנקן הנוזלי, ומיד מניחים אותן בליופילייזר כדי להתחיל לייבוש הקפאה.
לאחר שהדגימה יבשה לחלוטין, יש לאוורר אותה בחנקן יבש, ולסגור מיד את מכסי צינור התגובה כדי להימנע ממגע עם לחות האוויר. מוסיפים THF טהור לדגימות ליופילית, ומ מניחים את הפתרון בסוניקטור אמבט מים עם מי קרח במשך 15 דקות. מחממים תרמוצ'ילר ל-30 עד 60 מעלות צלזיוס להיווצרות ווסקל או עד 90 מעלות צלזיוס להיווצרות סיבים, ומכינים צינורות תגובה חדשים עם מים אולטרה-חמים או חוצץ.
לאחר sonication, מניחים את פתרון ELP / THF ואת המים המוכנים או חיץ בתרמוציקלר במשך חמש דקות. לאחר מכן מרפדים את תטביט ELP על גבי המים או המאגר, מוודאים כי ההפרדה בין שני השלבים והאינטרפאזה המובהק נראית לעין, וממקמים את התערובת בחזרה בתרמוציקלר. תן את המדגם להתקרר בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות, ולהמשיך עם דיאליזה נגד מים או חיץ או עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטי.
הכן פתרון ELP של 1 עד 50 מיקרומולרים והוסף 10 עד 20%1-butanol. מיד לערבב את הפתרון על ידי צינור למעלה ולמטה. מערבולת של הפתרון צריך להגדיל במהלך ערבוב, המציין היווצרות גדילה.
כדי להשיג התפלגות גודל צר, להחדיר שלפוחיות עם extruder מיני דרך קרום עם גודל נקבובית של מיקרומטר אחד. עבור אנקפסולציה צבע, לערבב כ 40 microliters של פתרון ELP ב 10-מילימולר טריס-HCl עם מיקרוליטר אחד של פתרון מניות Dextran טקסס אדום ב- DMSO. הוסף 10 microliters של 1-butanol, ולהבליט חמש עד 10 פעמים דרך מזרק מצויד מחט 0.25 על ידי 25 מילימטר.
שיטת הנפיחות THF מורכבת משלושה שלבים רצופים ותוצאות הרכבות supramolecular שונים של ELP בהתאם לטמפרטורה. תמונות מיקרוסקופיה epifluorescence להראות וקסיקים שנאספו מ BDP-R20F20 ומבנים fibrillary שנאספו מ BDP-R40F20. שיטת ההבלטה 1-butanol מוביל אך ורק להיווצרות של וריונים ELP.
על שני סדרי גודל יותר נוי מיוצרים בהשוואה לשיטת הנפיחות THF. BDP-R40F20 היה מעורבב עם 10 עד 15% butanol, ו vesicles הוכנו באמצעות שבלט של התערובת. מבנים שונים supramolecular הורכבו מ BDP-R40F20 באמצעות פרוטוקול נפיחות THF.
ה- pH של המאגר והטמפרטורה של תהליך ההרכבה הותאמו לצורת coacervates, fibrils או גרים. טעויות קטנות בפרוטוקול ההרכבה יכולות להוביל להיווצרות אגרגטים. צבע טעון חיובית ATTO Rho 13 ו פוליסכריד דקסטרן אדום 3000 היו עכוסים לתוך לומן של ורידים שנאספו מ F20R20-mEGFP באמצעות שיטת שולט 1-butanol.
תמונות מיקרוסקופיות קונפוקלים מראות את הווסיקים בתעלה הירוקה, את המטען בתעלה האדומה ואת הערוץ הממוזג המוצלח בערוץ הממוזג שנוצר. ההפרדה פאזה והתנהגות היתוך של אמפיפילים ELP על ערבוב של אבני בניין PMBC יחיד לעומת אוכלוסיות PMBC התאספו הוכח גם. ערבוב לפני הרכבת PMBC מוביל למולקולות מבוזרות הומוגנית בתוך קרום PMBC שנאסף, בעוד ערבוב אוכלוסיות ורירית מורכבות מוביל כתמי קרום של פלואורסצנטיות אדומה או ירוקה גלויים לפחות 20 דקות.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לשים לב לסדר הצעד הנכון ועל ההבדלים בין שיטת הנפיחות THF לבין שיטת שולט butanol. בעקבות פרוטוקול זה, גדילי ELP יכולים לשמש הסעות משלוח סמים, כפלטפורמה לתגובות אנזימטיות, כגון תמלול ותרגום במבחנה, או בהיווצרות של תאים מינימליים סינתטיים.
