פרוטוקול זה מאפשר בידוד חלק, culturing, וחקירה של תגובות שעתוק בשושלת תאים ספציפית מ C.elegans. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא הרמה הגבוהה של הסתגלות לשלבי חיים שונים של תולעים או סוגי תאים ספציפיים שיש לבודד. להדגים את ההליך יהיו אני ונטליה זאהיקו, טכנאית מהמעבדה שלנו.
לאחר איסוף בעלי החיים, צנטריפוגה אותם ב 1600 פעמים g במשך חמש דקות. הסר את כל supernatant ו resuspend התולעים במיליליטר אחד של מדיה M9. העבר את ההשעיה לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר.
צנטריפוגה ב 1600 פעמים g במשך חמש דקות כדי גלולה התולעים. לאחר מכן הוסיפו 200 מיקרוליטרים של חיץ SDS-DTT ודגירה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. התולעים אמורות להיראות כעת מקומטות לאורך הגוף אם רואים אותן תחת מיקרוסקופ אור.
לאחר מכן, הוסיפו 800 מיקרוליטרים של חיץ בידוד קר כקרח וערבבו על ידי החלקה עדין של הצינור. צנטריפוגה ב 13, 000 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס לדקה אחת כדי גלולה התולעים. הסר את העל-טבעי ושטף עם מיליליטר אחד של חיץ בידוד.
חזור על תהליך הצנטריפוגה והכביסה בסך הכל חמש פעמים, הקפד להסיר בזהירות את מאגר הבידוד בכל פעם. לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של תערובת פרוטאז מ Streptomyces griseus, מומס במאגר בידוד, לכדור. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 עד 15 דקות, הקפד להחיל שיבושים מכניים על ידי צינור למעלה ולמטה 60 עד 70 פעמים עם קצה micropipette 200 מיקרוליטר נגד החלק התחתון של הצינור.
כדי לקבוע את שלב העיכול, הסר אחד עד חמישה microliters של תערובת העיכול, להפיל אותו על מגלשת זכוכית, ולבדוק אותו באמצעות מיקרוסקופ תרבות רקמות. לאחר חמש עד שבע דקות, שברי תולעת צריכים להיות קוטיקל מופחת בעליל ותרסיס של תאים יהיה גלוי בקלות. עצרו את התגובה על ידי הוספת 900 מיקרוליטרים של מדיום L-15 של ליבוביץ' הזמין מסחרית, בתוספת 10% FBS ופניצילין-סטרפטומיצין.
צנטריפוגה ב 10, 000 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי גלולה שברים ותאים מבודדים. לשטוף את התאים גלולה פעמיים יותר עם מדיה קרה L-15 בתוספת באמצעות מיליליטר אחד של מדיה לכל לשטוף. תן שימוש חוזר בתאים גלולה במיליליטר אחד של L-15 בתוספת מדיה, ולהשאיר על הקרח במשך 30 דקות.
לאחר מכן קחו את השכבה העליונה, שהיא כ-700 עד 800 מיקרוליטרים, והעבירו אותה לצינור מיקרוצנטריפוגה. השתמש מונה תאים אוטומטי או hemacytometer כדי למדוד את צפיפות התא של 10 עד 25 microliters של תאים מבודדים. תאי צנטריפוגה מהתלייה התא המבודדת ב 10, 000 פעמים g ו בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את התאים המוגלתיים ב-L-15 בתוספת בינונית לצפיפות תאים של לא יותר משישה מיליון תאים למיליליטר כדי למנוע עומס יתר על ציטרומטר הזרימה. לאחר מכן, מיין תאים לפי ביטוי GFP חיובי באמצעות ציטומטר זרימה המסוגל למיין דגימות. תאים שליליים מסוג GFP יכולים לשמש כפקד לניתוח שאינו ספציפי לסוג התא.
לאחר מכן, צלחת התאים המבודדים לתוך בארות של צלחת סטרילית שש באר, למקם את הצלחת לתוך מיכל פלסטיק, להוסיף לנגב לח או נייר רקמה רכה כדי להוסיף לחות לתאים, דגירה ב 20 מעלות צלזיוס. תאי צנטריפוגה מהשעיית התא המבודד בצינור מיקרוצנטריפוגה נטול RNase ב-10,000 פעמים גר' וב-4 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. באמצעות micropipette, להסיר את supernatant ולהוסיף 100 microliters של מדיום M9 לשטוף את המדיום בתוספת L-15.
לאחר מכן, צנטריפוגה התאים ב 10, 000 פעמים g ו ב 4 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ולהסיר את supernatant. חזור על תהליך שטיפה וצנטריפוגה זה שלוש פעמים בסך הכל כדי להבטיח כי כל המדיה מוסרת, הקפד להסיר בזהירות את supernatant בכל פעם. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של פנול וגואנידין isothiocyanate פתרון לתאים פיפטה ההשעיה למעלה ולמטה בזהירות.
להחגירה את התערובת בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן, להוסיף 250 microliters של כלורופורם בעדינות להפוך את הצינור 15 עד 20 פעמים. דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.
צנטריפוגה ב 10, 000 פעמים g וב 25 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השתמש micropipette כדי להסיר בזהירות כמה שיותר של השכבה המים העליון ככל האפשר, הקפדה לא להפריע את השכבות האורגניות התחתונות. מעבירים את השכבה התחתונה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש ללא RNase באורך 1.5 מיליליטר.
לצינור החדש, מוסיפים 500 מיקרוליטרים של isopropanol ומערבבים על ידי היפוך הצינור. הדגירה פתרון זה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. ואז צנטריפוגה הצינור ב 14, 000 פעמים גרם וב 25 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
מניחים את הדגימות על קרח ולהשתמש micropipette כדי להסיר כמה שיותר isopropanol ככל האפשר. הוסיפו בעדינות מיליליטר אחד של 70% אתנול במים מזוקקים כפולים נטולי RNase לצינור על ידי החלתו על צד הצינור. צנטריפוגה ב 10, 000 פעמים g וב 25 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
מוציאים את רוב האתנול ותנו לצינור להתייבש על הקרח למשך שלוש עד חמש דקות. לאחר מכן, הוסיפו 15 עד 20 מיקרוליטרים של מים מזוקקים כפולים ללא RNase. השתמש ספקטרופוטומטר ב 260 ננומטר כדי למדוד את ריכוז RNA וטוהר.
במחקר זה, unc-17:GFP חיובי נוירונים כולין מופקים ומבודדים מן התולעת העגולה C.elegans למחקרים לשעבר vivo הבאים. הגן unc-17 בא לידי ביטוי בכל הגוף C.elegans, וקודים עבור טרנספורטר transmembrane אצטילכולין כלי דם. הביטוי של גן זה ניתן לראות בראש, midbody, נוירונים זנב, תחזיות נוירון.
מיקרוגרפים פלואורסצנטיים מייצגים של נוירונים לא חיוביים של UNC-17:GFP לאחר הבידוד, כמו גם שליטה שלילית בהתאמה מבעלי חיים מסוג N2 ללא שינוי, מוצגים כאן. תאים מבודדים יכולים להישאר בחיים עד שלושה ימים כאשר בתוספת L-15 בינוני של ליבוביץ ו 10%FBS. נתונים מייצגים של qPCR מ GFP-ביטוי נוירונים כולין, כמו גם GFP-ביטוי תאי שריר, מוצג כאן.
לאחר מיון מוצלח של תאים, RNA מבודד באמצעות שיטת פנול וגואנידין איזותיוצ'יאנט, שלאחריה יוצרה cDNA באמצעות ערכת סינתזה. ביטוי של גנים ספציפיים נוירון כולין, tph-1, hydroxylase טריפטופן, ו snb-1, טרנספורטר וקסילי סינפטי, מוגבה בתאים מבודדים unc-17:GFP. עם זאת, ביטוי זה אינו קיים בתאים מבודדים myo-3:GFP.
ההופכי נכון עם הביטוי של תעתיק שרשרת מיוסין-כבד ספציפי לשריר של myo-2, כמו הביטוי של גן זה מוגבל לתאי שריר מבודדים, אבל לא תאים כולין מבודדים. חשוב לה הדגירה את התולעים באופן מלא. עם זאת, דגירה ממושכת של קוטיקל התולעת עלולה לגרום למוות של תולעת או ללחץ נוסף על החיה.
לאחר הבידוד, התאים יכולים להיות מתורבתים לתקופה של זמן, או לשמש לבידוד RNA וניתוח qRT-PCR. נוירונים מתורבתים ניתן לנתח עוד יותר על ידי מדידות אלקטרופורזה מהדק תיקון. טכניקה זו עשויה להקל על ניתוח אקס ויוו של קבוצות ספציפיות של תאים, ובכך לסייע בשיפור ההבנה שלנו של תגובות ספציפיות לתא בהקשר של אורגניזמים רב תאיים בשלבים שונים של מחזור החיים שלה.
כמו כימיקלים כגון SDS ו DTT משמשים במהלך ניסוי זה, נהלי בטיחות מעבדה כללית יש לבצע בעת ביצוע ושימוש מאגרים.
