הפרוטוקול שלנו מספק גישה קלה ומהירה לבידוד פיברובלסט ראשוני עם דגש ברור על הימנעות מזיהום חיידקים, אשר יכול להיות בעיה ענקית. במיוחד למתחילים. היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו הוא הפשטות שלה.
כפי שהוא אינו דורש מיומנויות ידניות נרחבות או ניסיון וזה יכול בקלות ללמוד על ידי כולם בתוך תקופת אימון קצרה. מציג את הטכניקה יהיה Manja Newe, טכנאי ממעבדה החוצה. לפני תחילת הניתוח, לשים על שני זוגות של כפפות חד פעמיות, אחד על גבי השני.
ולתקן את העכבר ל כרית פוליסטירן. לחטא את הפרווה עם 70% אתנול, לוודא כי החיה ספוגה. ולהשתמש ממטרים כירורגיים מעוכל אתנול ומספריים אטראומטיים כדי העור ממש מעל מערכת urogenital.
חותכים שלושה עד ארבעה סנטימטרים לאורך קו האמצע מהחתך הראשוני לצוואר, ומוסיפים חתכי הקלה בגפיים. ולהצמיד את העור על כרית כדי להשיג גישה אופטימלית השרירים המכסים את חלל הבטן. לאחר מכן, לחטא את שרירי הבטן פעמיים עם טרי 70% אתנול.
כאשר האתנול התייבש, להסיר את זוג הכפפות הראשון. ולהשתמש קבוצה סטרילית חדשה של מדפים ומספריים כדי להסית את שכבת השריר כדי לפתוח את חלל הבטן ואת בית החזה. כדי להסיר את האיברים של עניין, בעדינות לתפוס כל איבר עם מלקחיים כירורגיים מבלי ל פירסינג הרקמה.
ולהשתמש במספריים כדי לחתוך בזהירות את כלי הדם המספקים ליד נקודת הכניסה של האיבר. מניחים כל איבר לתוך צינור של PBS סטרילי, קר ולסגור את הצינור בחוזקה. מניחים כל צינור על קרח רטוב בזמן איסוף האיברים.
כאשר כל האיברים נקצרו, לרסס את הצינורות עם 70% אתנול לפני הצבתם במכסה המנוע של תאים סטריליים. לובשים זוג כפפות טריות, משתמשים במטחנים סטריליים כדי להעביר כל איבר לחצי מנה סטרילית של פטרי ב-6 ס"מ. ולשטוף בקצרה את האיברים עם PBS טרי כדי להסיר את הדם העודף.
מעבירים את האיברים שטוף למחצית השנייה של כל צלחת פטרי ולהסיר את PBS עודף. באמצעות שני אזמלים סטריליים, טחון את האיברים לרסיס אחד עד שני מילימטר. ולהשתמש מרית סטרילית להעביר את חתיכות הרקמה לתוך חדש, בודד, סטרילי, 15 צינורות מיליליטר.
הוסף שני מיליליטר של 0.25%פתרון טריפסין לכל צינור. ומ מניחים את הצינורות באינקובטור של תרבות התאים ב-37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. בסוף הדגירה, מערבולת הצינורות בערך 1400 סיבובים לדקה במשך עשר שניות.
ולעצור את תגובת טריפסין עם ארבעה מיליליטר של מדיום תרבות מתאים בתוספת סרום עגל עוברי לכל צינור. לאחר מכן, מוסיפים את הנפח המתאים של פתרון תערובת קולגן לכל צינור. ולמקום את הצינורות באמבט מים קולי 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
בסוף sonication, בעדינות מערבולת הצינורות במשך 10 שניות. לפני הצבת הצינורות בחזרה לאמבט המים הקולי במשך 10 דקות נוספות. בסוף sonication השני, מערבולת הצינורות במשך 10 שניות נוספות.
ולחטא את הצינורות עם 70% אתנול. במכסה המנוע של תא התרבות, לסנן את מתלי התא דרך מסנני 40 מיקרומטר בודדים לתוך צינור חדש, סטרילי, 15 מיליליטר. ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה.
להשעות מחדש את כדורי במיליליטר אחד של מדיום טרי לכל צינור. ולראות את התאים בכלי תרבות תאים מתאימים בצפיפות ציפוי מתאימה. לאחר מכן, מניחים את התאים באינקובטור תרבות התאים בן לילה.
למחרת בבוקר, לשטוף כל תרבות שלוש פעמים עם PBS לפני הוספת מדיום טרי והחזרת התאים לחממה. באמצעות פרוטוקול זה, fibroblasts קיימא ניתן להשיג לשימוש בניסויים הבאים. כגון ניסויי כתם אמינו-פלואורסצנטי או התפשטות.
פיברובלסטים בוגרים הם תאים שטוחים בצורת ציר עם תהליכים תאיים מרובים הגדלים בדרך כלל במונוטלים. הבדלים מורפולוגיים ברורים באוכלוסיות פיברובלסט מאיברים שונים ניתן לראות, עם זאת. לדוגמה, פיברובלסטים כליות קטנים יותר וגדלים בצפיפויות גבוהות יותר מאשר פיברובלסטים לבביים, ריאתי או בהפטיים.
הפיברובלסטים המבודדים מציגים שיעורי התפשטות גבוהים, ומגיעים להתכנסות אופטית של יותר מ-90% לאחר כשישה ימים. כאן, myofibroblast מובחן עם מיקרופילמנטים ייחודיים של שרירי אלפא חלקים. תאים אלה נמצאים בשפע בתרבויות הלב, הכליות, הכבד ותאי הריאות.
בעוד שרק כ -20 עד 30 אחוזים מהתאים המבודדים והמתרבתים מבטאים מיקרופילמנטים מסודרים, מסודרים וחלקים של השרירים, כמעט כל התאים חיוביים עבור קולטן דומיין וימנטין ודיסקודין 2 לאחר שבעה ימים בתרבות. הדבר החשוב ביותר לזכור הוא להשתמש בטכניקה הנכונה לאורך כל ההליך כמו זיהום חיידקים יש להימנע. לאחר בידוד פיברובלסט ראשוני, התאים יכולים לשמש עבור כל מיני ניסויים פסיכיאטריים ואפיון.
כגון התפשטות כימיה אימונוציטית או מאמרי ריפוי פצעים, או הערכות ביולוגיות מולקולריות.
