This work was supported by National Institute of Health (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) and the Institute for Translational Sciences at the University of Texas Medical Branch, and a Clinical and Translational Science Award (8UL1TR000071).

הפרוטוקול לקבלת רקמה אנושית שהושלכה מחולים כירורגי והקמת התרבויות העיקריות אושר על ידי אוניברסיטת טקסס רפואית הסניף ואוניברסיטת ניו מקסיקו לוחות סקירה מוסדית. הדרישות הכלליות לרכש של דגימות רקמה אנושיות מתוארת להלן. שים לב כי מאז MFS עשוי להיות מבודד מהרקמה קפוא, biobanks וספקים מסחריים גם אפשרויות קיימא. 1. השג רקמה אנושית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס פרוטוקול להשיג רקמת מעי גס אנושית למועצה לביקורת המוסדית לאישור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסס שיתופי פעולה עם מנתחים כלליים ו / או מנתחי מעי גס על מנת לקבל רקמות אנושיות למחקר. שיתוף פעולה עם המחלקה לפתולוגיה היא גם חובה כפי שהם יהיו קביעת הרקמה שאינו נדרשת לאבחון ויכול להיות מיועדת למחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייעץ פתולוג לספק רקמה מneoplasm ולאחר מכן grosslרירית נורמלית y לפחות 5 סנטימטרים מהגידול. מייד למקם את הדגימות בתקשורת לשטוף קר כקרח ומניח על קרח. פתולוג יקבע את כמות הרקמה שיכול להינתן בבטחה למחקר. הרקמה המינימלית הנדרשת לבידוד MF היא 1.5 מ&quot;מ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ברקמות שהושגו או מייד להקים תרבויות העיקריות או הקפאה והמקום ב -80 ° C עבור בידוד עתיד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הקפאה לבידוד מאוחר יותר, לחתוך את הרקמה לתוך כ 1 - 2 מ&quot;מ 2 חתיכות, מקום לתוך צינור קירור עם 1 מיליליטר של תקשורת הקפאה (ראה להלן), וחנות ב -80 ° C. הערה: ניצול פרוטוקול זה, בידוד מוצלח של MFS מהרקמה קפואה במשך 4 שנים נצפה. </li></ol></li></ol> 2. הכן ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתרון Collagenase: הכן 100 U collagenase מיליליטר / I, II ו- IV בתמיסת מלח המאוזן של האנק (HBSS) עם Ca 2 + / 2 + Mg (ראה לוח חומרים </stronז&gt;). זהירות: ריכוז יחידה פעיל Collagenase וטוהר רשאי משתנים מהספק כדי ספק, שעלולה לעכב את היעילות של מערכת עיכול הרקמה ו / או שימור epitope על פני השטח של תאי רירית. כדי למנוע בעיות פוטנציאליות אלה, להשתמש collagenase עם התואר הגבוה ביותר של טוהר (≥95%) ולהכין את פתרון המניות המבוסס על ריכוז יחידות הפעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות DNase על בסיס מים ב 10 מיליליטר / מ&quot;ג (3.55 UA / מ&quot;ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת לשטוף: (ממ: 89 מיליליטר, אנטיביוטיקת antimycotic, 100x: 1 מיליליטר; FCS מומת חום: 10 מיליליטר) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פיברובלסטים צמיחת מדיה: ממ: 500 מיליליטר בקבוק; L- גלוטמין (200 מ&quot;מ): 5 מיליליטר; חומצות ממ שאינה חיונית אמינו, 100x פתרון: 5 מיליליטר; ציפרופלוקסצין HCl (10 מ&quot;ג / מיליליטר): 570 μl; אנטיביוטיקה antimycotic, פתרון 100x: 10 מיליליטר; פירובט נתרן (100 מ&quot;מ): 5 מיליליטר; FCS מומת חום: 50 מיליליטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת הקפאה: תקשורת צמיחת פיברובלסטים (מגיב 2.4) עם התוספת של 10% דימתיל sulfoxide (DMSO), ואז לסנן-sterilize עם מסנן 0.22 מיקרומטר. </li></ol> רקמות 3. אנזימים Digest אדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הרקמה הוקפאה בתקשורת הקפאה, cryovial מקום ב( ~ 37 מעלות צלזיוס) מים חמים עד רקמה ותקשורת מופשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל4 - 5 של 2 מ&quot;מ 2 חתיכות של רקמות, רקמות לשטוף פעמיים עם 10 מיליליטר של HBSS ללא Ca 2 + / Mg 2 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהרקמה יש התיישבה על ידי כוח הכבידה, להשליך בזהירות supernatant מבלי מסתובב מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מיליליטר של תמיסת collagenase לדוגמא ולהעביר את תערובת רקמות פתרון ל, צינור DNase / RNase ללא סטרילי עם המובנה הרוטורים לניתוק מדגם. השתמש collagenase לנתק את מטריקס המקיף את ההיבט הבסיסי של תאי האפיתל ומהווה את החלק בלתי תאי של propria lamina הרירי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חוזקה קרוב צינור ולצרף אותו במהופך על השרוול של Dissociator (למשל, gentleMACS). אם אין לו את המעבדה הגישה לtהוא האמור לעיל ציוד, להגדיל את הזמן של כל שלב עיכול כדי להשיג תוצאות דומות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את h_tumor_01 התכנית, פרופיל שנקבע מראש כלול עם המכשיר (משך הזמן הכולל של 36 שניות, עם קטניות לסירוגין החל 1,000 - 4,000 סל&quot;ד, עם 268 כדורים לריצה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר סיומה של התכנית, לנתק את הצינור מDissociator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה לדוגמה עבור 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס מתחת סיבוב רציף על שייקר ב 140 סל&quot;ד. הערה: כמויות משתנות של דגימות רקמה, זמן של עיכול יכול להיות מופחת או מוגבר באופן יחסי (כלומר, כמויות גדולות יותר של רקמה עשויות לדרוש זמן נוסף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף צינור הפוך על השרוול של Dissociator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ולהפעיל את התכנית h_tumor_02 (משך זמן כולל של 37 שניות, עם קטניות לסירוגין החל 1,000 - 4,000 סל&quot;ד, עם 235 כדורים לריצה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר סיומה של התכנית, לנתק את הצינור מDissociator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של פתרון מניות DNase. השתמש DNAse לנתק / להסיר תאים מתים וחלק DNA של פסולת הסלולר שמוביל לתא בצעדים כבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה מדגם למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס מתחת סיבוב רציף על שייקר ב 60 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף צינור הפוך על השרוול של Dissociator שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ולהפעיל את התכנית h_tumor_03 (משך זמן כולל של 37 שניות, עם קטניות לסירוגין החל 1,000 - 4,000 סל&quot;ד, עם 168 כדורים לריצה). הערה: אם הרקמה אינה מתעכל לגמרי, צנטריפוגות ב × גרם 250 עבור 10 דקות ב 20 מעלות צלזיוס, להשליך supernatant, resuspend ב 2 מיליליטר של תמיסת תא דיסוציאציה ולדגור על RT במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את ההשעיה התא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעיה תא צנטריפוגה ב g × 250 במשך 10 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. לשאוב supernatant לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה לשטוף תא פעמיים עם 25 מיליליטר של HBSS ללא Ca 2 + / 2 + Mg וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שעבר היהh, לספור את המספר הסלולרי באמצעות מערכת ספירת תאים אוטומטית זמינה במעבדה או באמצעות hemocytometer ידני. עבור דור התרבות העיקרית MF להמשיך לצעד 3.19.1, לניתוח או מיון של MFS באמצעות cytometry זרימה להמשיך לצעד 3.19.2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבידוד וצמיחה של תרבות MF הטהורה (איור 1), לבטל את supernatant מצנטריפוגה האחרונה, תא גלולה גלול בכמות המתאימה של תקשורת בידוד פיברובלסטים צריך זרע עד 4 x 10 6 תאים ב 3 מיליליטר של התקשורת לכל גם ב 6 צלחות גם, שטופלה תרבית תאים. המשך לשלב 3.20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח או מיון של MFS באמצעות cytometry זרימה, למקם עד 2 x 10 6 ב 2 מיליליטר של תקשורת בידוד פיברובלסטים ב 24 גם, צלחת נמוכה מחייבת ודגירת O / N ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. זה הוא להחזיר את epitopes פני תא שעשוי להיות מושפע מההליך האנזימטית. לאחר מכן לאסוף השעיה תא ולספור תאים התאוששו ולהמשיךלimmunostaining וניתוח תזרים cytometry 8. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. לשנות תקשורת כל 2 - 3 ימים עד היווצרות ~ monolayer MF מחוברות 80% (איור 1D-E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי מעבר בצלוחיות T25 עם מ 6 צלחת גם ביחס 1: 1 ולגדול ל~ 10 - 14 ימים בתקשורת צמיחה פיברובלסטים להשיג 80 - confluency 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרחיב תרבות על ידי passaging תאים מT25 לתאי T75 ביחס 1: 2. ברגע שתאים מגיעים confluency, להשתמש בקבוק אחד לניתוח של טוהר MF המבודד באמצעות ידי cytometry זרימה כפי שתואר לעיל 5. להקפיא או מעבר אחר בקבוק T75 תרבות MF ביחס 1: 3. הערה: כאשר נותחו על ידי cytometry זרימה, צפוי כי במערכת העיכול רירית סטרומה MF ממוצא mesenchymal כאשר גדלו בתרבות יהיה פנוטיפ הבא: EpCAM-, CD31-, CD45-, + vimentin, α-SMA +, CD90 +. </li></ol>

<ol>
	<li>Yamaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+Fibroblasts+Mediate+Extracellular+Matrix+Remodeling+and+Invasion+of+Scirrhous+Gastric+Carcinoma+Cells.">Stromal Fibroblasts Mediate Extracellular Matrix Remodeling and Invasion of Scirrhous Gastric Carcinoma Cells.</a> PLoS ONE. 9, e85485 (2014).</li><li>Mullan, N., Hughes, K. R., Mahida, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Human+Colonic+Myofibroblasts+Are+Resistant+to+Clostridium+difficile+Toxin+A-Induced,+but+Not+Toxin+B-Induced,+Cell+Death.">Primary Human Colonic Myofibroblasts Are Resistant to Clostridium difficile Toxin A-Induced, but Not Toxin B-Induced, Cell Death.</a> Infect Immun. 79, 1623-1630 (2011).</li><li>Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Cells+of+the+Intestinal+Lamina+Propria.+Annu+Rev+Physiol.">Mesenchymal Cells of the Intestinal Lamina Propria. Annu Rev Physiol.</a> Annu Rev Physiol . 73, 213-237 (2011).</li><li>Latella, G., Sferra, R., Speca, S., Vetuschi, A., Gaudio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+we+prevent,+reduce+or+reverse+intestinal+fibrosis+in+IBD?.">Can we prevent, reduce or reverse intestinal fibrosis in IBD?.</a> Eur Rev Med Pharmacol Sci. 17, 1283-1304 (2013).</li><li>Saada, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepithelial+myofibroblasts+are+novel+nonprofessional+APCs+in+the+human+colonic+mucosa.">Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa.</a> J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).</li><li>Mahida, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+human+colonic+subepithelial+myofibroblasts+express+extracellular+matrix+proteins+and+cyclooxygenase-1+and+-2.">Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2.</a> Am J Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).</li><li>Roncoroni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+fibroblasts+from+endoscopic+duodenal+biopsies+of+celiac+patients.">Isolation and culture of fibroblasts from endoscopic duodenal biopsies of celiac patients.</a> J Transl Med. 7 (40), (2009).</li><li>Pinchuk, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+Cells+Induce+Th17+during+Helicobacter+pylori+Infection+and+in+the+Gastric+Tumor+Microenvironment.">Stromal Cells Induce Th17 during Helicobacter pylori Infection and in the Gastric Tumor Microenvironment.</a> PLoS ONE. 8, e53798 (2013).</li><li>Pinchuk, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+chemoattractant+protein-1+production+by+intestinal+myofibroblasts+in+response+to+staphylococcal+enterotoxin+a:+relevance+to+staphylococcal+enterotoxigenic+disease.">Monocyte chemoattractant protein-1 production by intestinal myofibroblasts in response to staphylococcal enterotoxin a: relevance to staphylococcal enterotoxigenic disease.</a> J. Immunol. 178, 8097-8106 (2007).</li><li>Paulsson, J., Micke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+relevance+of+cancer-associated+fibroblasts+in+human+cancer.">Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer.</a> Sem Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).</li><li>Valcz, G., Sipos, F., Tulassay, Z., Molnar, B., Yagi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+carcinoma-associated+fibroblast-derived+proteins+in+clinical+oncology.">Importance of carcinoma-associated fibroblast-derived proteins in clinical oncology.</a> J. Clin. Pathol. 67, 1026-1031 (2014).</li><li>Minonzio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+maintain+high+capability+to+grow+and+differentiate.">Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate.</a> Cryobiology. 69, 211-216 (2014).</li><li>Gargus, M., Niu, C., Shaker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Myofibroblasts+from+Mouse+and+Human+Esophagus.">Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus.</a> J. Vis. Exp. (95), e52215 (2015).</li><li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue.">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> J. Vis. Exp. (80), e50611 (2013).</li><li>Schiller, J. H., Bittner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+Tumorigenic+Phenotype+with+in+Vitro,+but+not+in+Vivo,+Passaging+of+a+Novel+Series+of+Human+Bronchial+Epithelial+Cell+Lines:+Possible+Role+of+an+&#945;5/&#946;1-Integrin-Fibronectin+Interaction.">Loss of the Tumorigenic Phenotype with in Vitro, but not in Vivo, Passaging of a Novel Series of Human Bronchial Epithelial Cell Lines: Possible Role of an &#945;5/&#946;1-Integrin-Fibronectin Interaction.</a> Cancer Res. 55, 6215-6221 (1995).</li><li>Augello, A., Kurth, T. B., De Bari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells:+a+perspective+from+in+vitro+cultures+to+in+vivo+migration+and+niches.">Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches.</a> Eur Cell Mater. 20, 121-133 (2010).</li><li>Meller, D., Pires, R. T. F., Tseng, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+preservation+and+expansion+of+human+limbal+epithelial+stem+cells+on+amniotic+membrane+cultures.">Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures.</a> Br J Ophthalmol. 86, 463-471 (2002).</li><li>Kuhlmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prophylactic+use+of+antibiotics+in+cell+culture.">The prophylactic use of antibiotics in cell culture.</a> Cytotechnology. 19, 95-105 (1995).</li><li>Morris, K. T., Nofchissey, R. A., Pinchuk, I. V., Beswick, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Macrophage+Migration+Inhibitory+Factor+Exposure+Induces+Mesenchymal+Epithelial+Transition+and+Promotes+Gastric+and+Colon+Cancers.">Chronic Macrophage Migration Inhibitory Factor Exposure Induces Mesenchymal Epithelial Transition and Promotes Gastric and Colon Cancers.</a> PLoS ONE. 9, e98656 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

בעוד פרוטוקול זה פותח ליישום המחקר בלבד, לאור גדל חשיבות קריטית של תאי סטרומה כסמנים ביולוגיים פוטנציאליים סרטן פרוגנוסטיים ויעד טיפולי, היכולת להקפיא biospecimens &quot;פונקציונלי&quot; לשימוש מאוחר יותר מציעה יתרון משמעותי. זה מייצג יתרון ייחודי ליצירת biorepository הקליני, העשויים לשמש כלים נוספים כמו משרת כדי לקדם את הפיתוח של רפואה אישית 10, 11. בדומה לממצאים שדווחו בעבר לתאי גזע שמקורם בשומן mesenchymal המבודדים מחלק של כלי דם סטרומה הקפואה, שעשינו לא נצפה שינויים משמעותיים בסמנים ותגובות שגשוג / חיסון / דלקתיות ופעילות המטבולית של MFS מבודד מדגימות רירית קפוא. 12 עם זאת, אנחנו לא שוללים כי חלק מתגובות שנבדקו לא כמו בתצהיר סמן תאי, וכו &#39;עשוי להשתנות . לפיכך, במקרים של עבודה עם לא ידוע / unreאירועים מועבר, חוקרים יכולים להגדיר ניסוי השוואה שבפונקציה המסוימת תיבחן צד על ידי הצד בMFS מבודד מהרקמה קפוא וטריה של אותו האדם. רוב הטכניקות לשיטות בידוד myofibroblast מבוססים גם על השימוש במתייפייף מכאני של הרקמה בשילוב עם טיפול או עם סוכני chelating [חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) DL-dithiothreitol (DTT),] אנזימי מפרקי חלבונים או collagenolytic ו13-14 . דווח בעבר כי דור של MF מקיבה, המעי דק ומעי גס היה יעיל על ידי שימוש בשיטה שתוארה על ידי תולדה תחילה Mahida et al, המבוסס על מתייפייף ויישום של סוכני chelating 5, 6 מכאניים. הנה, האנזימטית נוסף שיטה שמאפשרת את הדור של תרבויות העיקריות של MFS מדגימות רקמה קפוא מדווחת. בעוד שני טכניקות-תולדה והאנזימטית עיכול-הםיעיל באותה מידה בבידוד של myofibroblasts העיקרי מקיבה, מעי דק, מעי הגס ורקמות, יש עדיין ויכוח בקהילה מדעית בשאלה אם תאים בתרבית לשמר הפנוטיפ שלהם in vivo. הטכניקה דיווחה בכתב היד הזה מאפשרת לדור לא רק של תרבות MF העיקרית, אלא גם מאפשרת ניתוח vivo לשעבר של אוכלוסיות תאים שונות המוצגות במערכת עיכול רירית 15-17. זה כולל קביעת השפע היחסי שלהם עם הרקמה והסמנים הם מבטאים, אלא גם לשימוש במבחנים פונקציונליים (למשל, פעילות אנזימטית או ייצור ציטוקינים). שפע יחסי של MFS בתוך הרקמה ניתן להעריך באמצעות FACS ידי מיון התאים המבוססים על סמנים ייחודיים לMFS (כלומר, EpCAM-, CD31-, CD45-, + vimentin, α-SMA +, CD90 +) וכימות נוכחותם בהשוואה ל סך כל תאים מבודדים טרי או, אם תהיה בכך צורך, על ידי עושה יחס השוואתי עם סוגים שונים של תאים. למרות היעילותשל בידוד תא קיימא, הגבלה ראויה לציון של זה ופרוטוקולים אחרים המבוססת על עיכול אנזימטי היא שפעילות מפרקי החלבונים של האנזים המועסק עשויים לשנות epitopes פני תא. כדי להתגבר על זה, אנו מאפשרים לתאים להתאושש O / N כדי epitopes להיות מחדש הביעה באופן דומה למצב predigested. אנחנו כבר מסוגלים לייצר באופן עקבי תרבות MF מהרקמה קפוא עם הפסד מינימאלי של כדאיות תא. היכולת לשחזר תרבויות אלה מדגימה קפוא מאפשרת לחוקרים כדי לתפעל וטובים יותר לשמר דגימות רקמה כירורגית ו / או אנדוסקופית שהושגו במהלך הלילה או מחוץ לשעתי עבודה רגילות. יתר על כן, הירידה באובדן רקמת רכש, שמישה עקב זיהום החיידקים ו / או פטרייתי במהלך תהליך ההקפאה משמשת כיתרון נוסף. בעקבות בידוד, שימוש באנטיביוטיקה צריך להיות מוגבל ל-2 הראשונים בלבד - 3 קטעים, לאחר שculturing צריך להמשיך להשתמש asepti הסטנדרטיטכניקת ג ואנטי-פַּטַרתִי / ללא מדיה סוכן אנטי-mycoplasma. שימוש שיגרתי של סוכנים אלה בתרבות התאית הוכח להפעיל אפקטי cytoxic, כלומר צמיחת תאים, ניוון סלולארי, ובהזדמנות, מות 18. עיכול אנזימתי יניב אוכלוסיות תאים מרובות הנוכחיות בpropria lamina GI כולל: תאי מערכת חיסון, תאי אפיתל, וMFS. לאחר המעבר הראשון, רק MFS יישאר וניתן לזהות על ידי פנוטיפ הייחודי שלהם (איור 1), וכן באמצעות פנל תא ספציפי של ניתוח סמן (CD90,-SMA, וvimentin חיובי, אך שלילי לאפיתל וhematopoietic סמנים) 3, 5, 9. למרות שזה מקובל שmyofibroblasts נובע מתאי גזע mesenchymal במארח הרגיל, במצבי מחלה כגון דלקת וסרטן כרוניים, תת-אוכלוסייה של MFS הוכחה אפיתל המפורש או סמני 3 hematopoietic. ממצאים אלה כבר הציעו להיות אוליתוצאה של מעבר אפיתל- mesenchymal (EMT) או גיוס של fibrocytes נגזר משושלת hematopoietic 3, 19. יתר על כן, יש להשתמש בזהירות נוספת אם תאי immunostained ונותחו על ידי cytometry זרימה עבור הסמנים שנדונו לעיל. בזמן שאנחנו לא מצאנו את אובדן epitope להיות בעיה לאחר מאפשר לתאים להתאושש O / N מהרקמה טרי מתעכל מודגרות בלוחות שאינם חסיד, אובדן epitopes יכול מתרחש בעת שימוש טריפסין או כל אנזים פרוטאוליטים אחר בניתוק של תאים מהצלחת. לכן, כדי להימנע מבעיה זו, אנו ממליצים להשתמש בפתרון תא דיסוציאציה עם סוכני chelating כגון EDTA כאשר תרבויות MF חסיד מיועדות לimmunostaining אחרי ניתוח cytometry זרימה. אחרי תרבות העיקרית של myofibroblasts הוא הוקם, אז יכולים להיות קפוא התאים בתקשורת הקפאה ומאוחסנים בחנקן נוזלי. תאים אלה יכולים לשמש במגוון של ניסויים במבחנה עד כ 14-15מעברים, אחרי שזמן התאים להזדקן וצריכים להיות מושלכים.

Myofibroblasts / fibroblasts (MFS) מייצג אוכלוסיית שפע של תאים במערכת עיכול רירית (GI). תאי סטרומה אלה ממוקמים ממש מתחת האפיתל ויוצרים רשת ביניהם בתוך propria lamina הרירי במעיים. MFS הוא לא רק אחראי על התצהיר של מטריקס, אבל באמצעות רגולציה אוטוקריני עשויים להשפיע תחבורת אלקטרוליט, השבת, ותפקוד מחסום של האפיתל הסמוך 1, 2. יתר על כן, MFS הוכח לשחק תפקיד מפתח בדלקת ורקמה שיפוץ 3, 4. myofibroblasts הוא חלק קריטי של מייקרו-הסביבה של הגידול, שבו הם ידועים גם בשם fibroblasts הסרטן הקשורים, ולתרום לצמיחת התאים הסרטני ולשמש כנישה לתאי גזע סרטני 3. נתונים חדשים מצביעים על כך שMFS יכול גם לשמש תאי הצגת אנטיגן מקומיים. בנוסף, פונקצית MFS רגולטורים חשובים של תגובה חיסונית מולדת ובעלי כושר הסתגלות, producing מגוון של ציטוקינים וגורמי גדילה 5. באנשים בריאים, הם האמינו תאי MFS להבדיל מתאי גזע mesenchymal ולהביע על פני השטח שלהם התא, סמן mesenchymal, 3 CD90, 5. תאים אלה הם גם חיוביים עבור vimentin, אבל שלילי לאפיתל וסמן תא דם, EpCAM וCD45 , בהתאמה. Myofibroblasts הם הציעו להיות צורה פעילה של fibroblasts וניתן להבחין בין fibroblasts מופעל לא על ידי הביטוי של α-SMA 5. במהלך העשור האחרון, גישות רבות לבידוד של myofibroblasts מרירית מעי הגס אנושית פורסמו-מבוססת בעיקר על השיטה המתוארת במקור על ידי et al Mahida. 5-8. בעוד שמחקרים בודדים לדווח נהלי בידוד מרירית מעי שונים, אין פרוטוקול אוניוורסלי לבידוד של MFS מאזורים מרובים של מערכת העיכול (כלומר, קיבה, קטן וlרירית מעי arge) כבר פורסמה. הפרוטוקול שהוצג במסמך זה נבדק ומשמש בהצלחה לכל שלושת הסוג של רקמה שהוזכר לעיל. . יתר על כן, נהלים לבידוד MFS מרירית מערכת העיכול קפוא לא דווחו. כאן, אנו מציגים שיטה מותאמת, המבוססת על עיכול אנזימטי, ובמקביל מאפשר לבידודה של רירית מעי אדם MFS לתרבות וcytometry זרימת הניתוח בתא בודד, הכנות טריות מתעכלים, רירית. טכניקה זו באופן מהימן מניבה תרבויות עיקריות עם פנוטיפ MF. יתר על כן, ניתן להשתמש באותן השיטות כדי לבודד MFS מדגימות קפואות של רקמות מעי קיבה וקטנות גם כן. בידוד של myofibroblasts מרקמת GI טרי כבר תואר לעיל; עם זאת, השימוש בדגימות קפואות מציג יתרונות רבים. כלומר, חוקרים יוכלו לאסוף ורקמות חנות מכל מספר של משתפי פעולה ברחבי העולם שיש להם capability ספינה דגימות רקמה קפוא. יתר על כן, חוקרים עשויים למצוא את האוסף של רקמות שהושלכו מחדר הניתוח ו / או צמוד אנדוסקופיה והמיידי עיבוד הרקמות לבידוד לסכסוך עם לוח הזמנים של הניסויים הנוכחיים שלהם. כמו כן, בשל האופי הבלתי צפוי של ניתוח, רכש רקמה עלול להתרחש מאוחר מאוד ביום, אשר יגביל את הזמן שנותר לרקמת עיבוד. הקפאת רקמה לעיבוד מאוחר יותר יהיה לשפר באתגרים אלה. לבסוף, שיטות אלה כבר נוצלו בהצלחה בבידוד של myofibroblasts מעי הגס, קיבה וקטנה במצבי מחלה כגון קרצינומה של המעי הגס ומחלות מעי דלקתיות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="719">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">MEM, 1X</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MT-10-010-CV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Antibiotic-Antimycotic, 100X</td>
			<td style="width:111px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Ciprofloxacin HCl</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">61-277-RF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">L-Glutamine, 100x</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-005-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">MEM Nonessential Amino Acids</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-025-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">DL-Dithiothreitol solution (DTT)</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td style="width:111px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">DNAse</td>
			<td style="width:111px;">Worthington</td>
			<td style="width:119px;">LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Collagenase from&#160;Clostridium histolyticum, Type I</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C1639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Collagenase from&#160;Clostridium histolyticum, Type II</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C1764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Accumax cell dissociation solution</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">gentleMACS C Tubes</td>
			<td style="width:111px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">gentleMACS Dissociator</td>
			<td style="width:111px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Countess Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C10227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Cell Strainer (70&#181;m)</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">PE Mouse Anti-Human Vimentin</td>
			<td style="width:111px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">562337</td>
			<td>Clone RV202</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">FITC Monoclonal Anti-Actin, &#945;-Smooth Muscle</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F3777</td>
			<td>Clone 1A4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">APC Mouse Anti-Human CD90</td>
			<td style="width:111px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">559869</td>
			<td>Clone 5E10</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cd 90+ fibroblast/myofibroblasts from human frozen gastrointestinal specimens

Fibroblasts / myofibroblasts (MFS) כבר צובר תשומת לב הולכת וגובר לתפקידם בפתוגנזה ותרומתם לשני ריפוי הפצע והקידום של מייקרו-הסביבה של הגידול. אמנם יש כיום טכניקות רבות לבידוד של MFS מרקמות של מערכת העיכול (GI), פרוטוקול זה מציג אלמנט רומן של בידוד של תאי סטרומה אלה מהרקמה קפוא. הקפאת דגימות רקמה במערכת העיכול לא רק מאפשרת לחוקר לרכוש דגימות ממשתפי פעולה ברחבי העולם, biobanks, וספקים מסחריים, זה גם מאפשר עיבוד המאוחר של דגימות טריות. הפרוטוקול המתואר באופן עקבי יניב תאים דמויי כישור אופייניים עם פנוטיפ MF המבטא את הסמנים CD90, α-SMA וvimentin. כאשר התאים אלה נגזרים מדגימות מטופל, השימוש בתאים ראשוניים גם מקנים היתרון של MFS מחקה באופן הדוק ממדינות-כלומר מחלה סרטן ומחלות מעי דלקתיות. טכניקה זו יש דבורהn תוקף בקיבה, מעי דק, ודור התרבות העיקרית הגס MF. תרבויות MF עיקריות ניתן להשתמש במגוון רחב של ניסויים על פני מספר המעבר וטוהר שלהם הוערכו על ידי שני immunocytochemistry וcytometry זרימת הניתוח.

השימוש בפרוטוקול עיכול אנזימטי זה, יש לנו כבר הצליח לבודד ולגדל תאי סטרומה בטן אוכלוסיית MF CD90 + רירית מדגימות כירורגית במערכת העיכול וביופסיות (איור 1) באופן עקבי. התפשטות המושבה MF גלויה יכולה להיבחן ביום 2 - 5 לאחר זריעת השעיות תא mononuclear לתוך 6 צלחות היטב (איור 1 א-ב). התרבויות העיקריות MF להגיע ~ 50 - מפגש 70% ביום 7 - 11 (איור 1 ג-ד). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53691/53691fig1.jpg" /> איור 1. היסודי myofibroblasts (MFS) מבודדים מהרקמה קפואה במערכת העיכול. הגדלת 20X של MFS אדם מבודד מדגימה קפוא של רירית מעי אדם. יום (א &#39;) 2. אשכולות חסיד של תאי סטרומה נמצאים. (ב) ימים 4. גפרורים האופייניים או stellate-מורפולוגיה של תאים פיתחה וגלוי לעין. הצפיפות של פיברובלסטים תמשיך להגדיל ביום 7 (ג) ו- (ד) יום 10. (ה) על ידי 14 יום, יש monolayer ומחוברות לגמרי של MFS. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53691/53691fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> יש ירידה קלה ביכולת קיום של הכנת תא בודד ברירית על הקפאת דגימות כירורגית (~ 10%, טבלת 1). עם זאת, עם הקפאה, יש גם ירידה בזיהום פטרייתי / החיידקים של הרקמה נצפתה וכתוצאה מכך, עלייה ביעילות של דור תרבות MF. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="698" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מקור של myofibroblasts הרירי במערכת העיכול </td><td> * כדאיות של הכנת הרירית יחידה השעיה תא (n = 11) &lt;/ Td&gt; <td> יעילות בידוד MF (n = 11) </td></tr><tr><td> טָרִי </td><td> 88.32 ± 2.369 </td><td> 8 מתוך 11 (82%) </td></tr><tr><td> קָפוּא </td><td> 78.64 ± 4.174 </td><td> 11 מתוך 11 (100%) </td></tr><tr height="20"><td colspan="3" height="20" style="height:20px;"> * יכולת הקיום, כפי שנקבע על ידי מונה תא אוטומטי הבא מכתים פתרון trypan הכחול 0.4%. </td></tr></tbody></table> שולחן הכדאיות 1. ויעיל של שחזור Myofibroblast. טרי לעומת רקמות קפואות. טוהר תרבות MF נוצרה נותח לאחר התאים היו מופצים לפחות לשני קטעים, כדי להבטיח שאין זיהום על ידי תאים ריריים אחרים. באמצעות מיקרוסקופ confocal, שהוכיח כי MFS היה חיובי עבור הסמן של CD90 שושלת תא mesenchymal וvimentin, ו also α-SMA, סמן של תאי mesenchymal הבדיל (איור 2). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53691/53691fig2.jpg" /> תאי איור 2. מבודדות יש לי צורת פיברובלסטים ועטים MF Express. Immunostaining של monolayer MF המבודד, passaged לפחות שתי פעמים בתרבות תוקנו עם paraformaldehyde 1%, immunostained ונותחו על ידי מיקרוסקופיה confocal כפי שתוארו לעיל 9. תאים מבודדים הביעו סמן של myofibroblast,-SMA (בירוק, כפי שזוהה על ידי עכברי שיבוט מב 1A4), וסמני mesenchymal: vimentin (באדום, כפי שזוהה על ידי מב, RV202 שיבוט) וCD90 (בכחול, כפי שזוהה על ידי עכברי מב, שיבוט 5E10). בתמונה הממוזגת, כתומים / צהובים תאים מייצגים שיתוף לוקליזציה של-SMA וvimentin; סגול מייצג שיתוף לוקליזציה של vimentin וCD90. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53691/53691fig2large.jpg" target="_blank">תחנונים</a><html> דואר לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. מידע זה אושר על ידי ניתוח תזרים cytometry (איור 3). כפי שדווח בעבר, MFS הנורמלי מבודד מרירית מערכת העיכול גם היו שליליים למקבלי hematopoietic CD45 וCD31, כמו גם סמן אפיתל, EpCAM 3, 5, 9. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53691/53691fig3.jpg" /> איור 3. אפיון פנוטיפי הראשי Myofibroblast (MF) תרבויות. המחקרים בוצעו על MFS העיקרי מבודד מרירית מעי הגס וpassaged לפחות שני זמן בתרבות. Immunostaining, ואחרי ניתוח תזרים cytometry, אישר כי יש לי התאים המבודדים פנוטיפ MF הם אחיד חיוביים עבור vimentin, α-SMA, וCD90. בקרות אלוטיפ מתאימות נכללו במחקר.&quot;Target =&quot; _ arge.jpg blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens at JoVE.com

Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, &#945;-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.

בידוד של פיברובלסטים / myofibroblasts 90 + CD מאדם דוגמאות במערכת העיכול קפוא


Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and ...

isolation-cd-90-fibroblastmyofibroblasts-from-human-frozen

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.5K Views.  University of Texas Medical Branch. Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, α-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production. 

Video: Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

בידוד וכמוני Immunocytochemical אפיון של תאים ראשוניים myogenic וFibroblasts משרירי שלד אדם

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of multipotent, self-renewing, and expandable neural stem cells. In serum conditions, these multipotent NSPCs will differentiate, generating neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. The harvested tissue is enzymatically dissociated in a papain-EDTA solution and then mechanically dissociated and separated through a discontinuous density gradient to yield a single cell suspension which is plated in neurobasal medium supplemented with epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), and heparin. Adult rat spinal cord NSPCs are cultured as free-floating neurospheres and adult human spinal cord NSPCs are grown as adherent cultures. Under these conditions, adult spinal cord NSPCs proliferate, express markers of precursor cells, and can be continuously expanded upon passage. These cells can be studied in vitro in response to various stimuli, and exogenous factors may be used to promote lineage restriction to examine neural stem cell differentiation. Multipotent NSPCs or their progeny can also be transplanted into various animal models to assess regenerative repair.

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

בידוד של תאי גזע / עצביים מהאזור סביב חדרי המוח של העכברוש למבוגרים וחוט השדרה אנושי

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-Myc), typically expressed by human embryonic stem cells (hESCs). Due to their similarity with hESCs, iPSCs have become an important tool for potential patient-specific regenerative medicine, avoiding ethical issues associated with hESCs. In order to obtain cells suitable for clinical application, transgene-free iPSCs need to be generated to avoid transgene reactivation, altered gene expression and misguided differentiation. Moreover, a highly efficient and inexpensive reprogramming method is necessary to derive sufficient iPSCs for therapeutic purposes. Given this need, an efficient non-integrating episomal plasmid approach is the preferable choice for iPSC derivation. Currently the most common cell type used for reprogramming purposes are fibroblasts, the isolation of which requires tissue biopsy, an invasive surgical procedure for the patient. Therefore, human peripheral blood represents the most accessible and least invasive tissue for iPSC generation.
In this study, a cost-effective and viral-free protocol using non-integrating episomal plasmids is reported for the generation of iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats after whole blood centrifugation and without density gradient separation.

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) represent a source of patient-specific tissues for clinical applications and basic research. Here, we present a detailed protocol to reprogram human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats into viral-free iPSCs using non-integrating episomal plasmids.

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מקפוא באפי מעילים באמצעות Episomal פלסמידים ללא שילוב

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

כימות תלת ממדיות של קוצים הדנדריטים מפירמידת נוירונים שמקורם בתאי גזע האנושי המושרה pluripotent

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human development and investigate the pathophysiology of disease. By employing site-specific nucleases (SSNs) for genome editing, the rapid derivation of new hPSC lines harboring specific genetic alterations in an otherwise isogenic setting becomes possible. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 are the most commonly used SSNs. All of these nucleases function by introducing a double stranded DNA break at a specified site, thereby promoting precise gene editing at a genomic locus. SSN-meditated genome editing exploits two of the cell&#39;s endogenous DNA repair mechanisms, non-homologous end joining (NHEJ) and homology directed repair (HDR), to either introduce insertion/deletion mutations or alter the genome using a homologous repair template at the site of the double stranded break. Electroporation of hPSCs is an efficient means of transfecting SSNs and repair templates that incorporate transgenes such as fluorescent reporters and antibiotic resistance cassettes. After electroporation, it is possible to isolate only those hPSCs that incorporated the repair construct by selecting for antibiotic resistance. Mechanically separating hPSC colonies and confirming proper integration at the target site through genotyping allows for the isolation of correctly targeted and genetically homogeneous cell lines. The validity of this protocol is demonstrated here by using all three SSN platforms to incorporate EGFP and a puromycin resistance construct into the AAVS1 safe harbor locus in human pluripotent&#160;stem cells.

Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.

הקמת שורות תאי גזע pluripotent האדם בעריכה-הגנום: ממיקוד לבידוד

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

בידוד הרחבת גזע mesenchymal / תאי סטרומה נגזרו רקמה אנושית שליה

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34- pericytes and vascular CD34+CD146- adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

Human cardiac tissue harbours multipotent perivascular precursor cell populations that may be suitable for myocardial regeneration. The technique described here allows for the simultaneous isolation and purification of two multipotent stromal cell populations associated with native blood vessels, i.e. CD146+CD34- pericytes and CD34+CD146- adventitial cells, from the human myocardium.

בידוד של אוכלוסיות תאי perivascular מולטיפוטנטיים המבשרים מרקמות אדם לב

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

בידוד ואפיון של תאי סטרומה mesenchymal מן טבורי אדם העובר שליה

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and colleagues1. Later, others documented the existence of similar types of EPCs originating from bone marrow2,3. More recently, Yoder and Ingram showed that EPCs derived from umbilical cord blood had a higher proliferative potential compared to ones isolated from adult peripheral blood4,5,6. Apart from being involved in postnatal vasculogenesis, EPCs have also shown promise as a cell source for creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs7,8. Various isolation protocols exist, some of which involve the cell sorting of mononuclear cells (MNCs) derived from the sources mentioned earlier with the help of endothelial and hematopoietic markers, or culturing these MNCs with specialized endothelial growth medium, or a combination of these techniques9. Here, we present a protocol for the isolation and culture of EPCs using specialized endothelial medium supplemented with growth factors, without the use of immunosorting, followed by the characterization of the isolated cells using Western blotting and immunostaining.

The goal of this protocol is to isolate endothelial progenitor cells from umbilical cord blood. Some of the applications include using these cells as a biomarker for identifying patients with cardiovascular risk, treating ischemic diseases, and creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs.

בידוד של אנדותל ובתאים של דם טבורי אנושי

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

הבידוד והתרבות של תאי Epicardial הראשית נגזר מן הלב האנושי למבוגרים ו עוברית דגימות

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...