השיטה היא שיטה יעילה מאוד לבודד תאי אנדותל מחזיר מיניאטורי. ואת התאים ניתן להרחיב מדי, לחקור את התגובה החיסונית ואת קרישה ב xenotransplantation. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא שזה לא רק קל, יעיל מאוד לבודד תאי אנדותל מטוהרים מאוד מחזיר, אלא גם טוב יותר לשמירה על pAECs אחרים כאשר מעבר.
לאחר אישור חוסר תגובה רפלקס כאב חזיר הרדמה, לשטוף את דופן הבטן חזיר שלוש פעמים עם 75% אלכוהול רפואי, ותמיסת אחת של יוד. לאחר הכביסה האחרונה, השתמש באזמל כדי לבצע חתך בבטן כדי לחשוף את הנבוב הנבוב הנחות, ולהשתמש מזרק חמישה מיליליטר להזריק 5000 יחידות של נתרן הפרין לתוך וריד ורידים נחותים. לאחר חמש דקות, להכניס קטטר לתוך ביתן הבטן, ולהשתמש אזמל כדי להסית את הסרעפת.
בעזרת חוקר שני, להסיר את החדר השמאלי ולהשתמש מלקחים עצם כדי לסלק את הצלעות כדי לחשוף את הלב והריאות. אתר את העורקים האחוריים ללב ולריאות, ומהדק את הקצוות. השתמש במספריים כדי למלמל את בית ההנשמה, ולשטוף אותו פעם אחת עם חיץ כביסה מקורר מראש.
הסר כל רקמה עודפת סביב העורקים עם ממטרים סטריליים ומספריים, והצב את הכלי לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר המכיל מאגר כביסה מקורר מראש טרי להעברה למעבדה. לבידוד תאי אנדותל בחזירים, מעבירים את בית הישבן של החזיר לצלחת פטרי של 150 מילימטר בתנאים אספטיים, ומסירים בעדינות את שני קצות הכלי. לקצץ כל רקמה עודפת נוספת שבו הכלי היה מהודק, עם מלקחיים סטריליים ומספריים, ולהשתמש 20 עד 50 מיליליטר של חיץ כביסה טרי לשטוף את החלק החיצוני והתוך של בית הישוריים.
לאחר מכן, להעביר תפר כירורגי דרך בית הדם, ולקשור באופן רופף קצה אחד של הכלי, שמירה על התפר בתוך לומן. בעדינות לתקן את העורקים ליד הקצה קשור עם מדפים ולאחר מכן למשוך את התפר הכירורגי לאט, כדי להפוך את העורקים, עד פני השטח אנדותל של העורקים נחשפים. לשטוף את פני השטח אנדותל של aorta שלוש פעמים עם 10 מיליליטר של חיץ כביסה טרי לכל לשטוף, ולמקום את העורקים לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר.
מכסים את המדגם עם 10 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס מחומם 0.005% קולגן IV פתרון העיכול, ודגירה את הרקמה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. בסוף הדגירה, להעביר את כל תכולת הצינור לתוך צלחת תרבות 100 מילימטר, ולעצור את העיכול עם 10 עד 15 מיליליטר של חיץ עצירה מקורר מראש. באמצעות מגרד תאים, להסיר בעדינות את תאי אנדותל האאורטיק מפני השטח הפנימיים של הכלי, ולשטוף את הכלי שלוש פעמים עם חמישה מיליליטר של חיץ כביסה לכל לשטוף.
לאחר הכביסה האחרונה, להעביר את supernatant לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר, ולשטוף את החלק התחתון של צלחת התרבות פעמיים עם חמישה מיליליטר של חיץ כביסה טרי, לכל לשטוף, מושך את הכביסה בצינור 50 מיליליטר. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, ולהשליך את כל אבל האחרון 10 מיליליטר של על טבעי. הוסף 20 מיליליטר של חיץ כביסה כדי resuspend את גלולה, דואג להימנע בועות, ולאסוף את התאים עם צנטריפוגה אחרת.
תן את גלולה במיליליטר אחד של מדיום תרבות התא לספירה, צלחת התאים ב 1-10 לשישה תאים לכל 25 ס"מ בריבוע ריכוז הבקבוק. לאחר מכן מניחים את התאים באינקובטור תרבות התאים ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו-חמצני, ומרעננים את המדיום כל יומיים-שלושה. לאחר הבידוד, תאי ה אנדותל נבדקים ביום אפס, אחד ושניים, ולאחר מעברים אחד ושתיים לזיהום והערכה מורפולוגית שלהם.
ניתוח ציטומטרי זרימה באמצעות נוגדן נגד CD31-FITC מציין בדרך כלל יותר מ 97% סמן תא אנדותל אוכלוסייה חיובית ביום השלישי של התרבות, זה נשמר על מעל 90% טוהר גם לאחר שני קטעים. המשטח ה אנדותל של aorta היה גירד רק בכיוון אחד, עם מגרד תא, במשך פחות מ 10 פעמים, וזה לא נדחס במהלך תהליך של גירוד. התשובה הטובה ביותר, שיטה ממוטבת של בידוד pAECs, אנו יכולים להשתמש pAECs מטוהרים לבצע ניסויים בודדים ולחקור את הדחייה החיסונית ואת תגובת קרישה ב xenotransplantation.
