הפרוטוקול משמש עבור מוטגנטיזה רוויה של אתר מחייב חלבון. אם האתר מחייב החלבון שלך אינו ידוע, ניתן לזהות אותו באמצעות פרוטוקול זה. הטכניקה רלוונטית לאבחון וטיפול במחלות.
אני מאמין שהפוטנציאל המלא שלו במדעי הביו-רפואה נותר מנוצל במלואו. שיטה זו יכולה להיות מיושמת באופן נרחב על כל חלבון או תגובה שבהם מולקולות רצויות ניתן להפריד ממולקולות לא רצויות. ודא כי הספרייה היא אקראית כראוי, ולוודא כי במהלך כל שלב כריכה והפרדה לקפל העשרה של מולקולות הרצוי הוא גבוה.
זה כרוך בכמה צעדים ופרטים רבים כי הם הפגינו טוב יותר, ולא הסביר במילים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך להרגיש בנוח עם איך להכין ספרייה אקראית, לסנתז בריכת RNA מתחיל, ולבצע תגובה מחייבת מולקולות רצויות ולא רצויות נפרדות כדי להשיג זיקה גבוהה קלסרים ספציפיים. ראשית, לסנתז את פריימר קדימה ואת פריימר הפוך על ידי סינתזה כימית על סינתיסייזר DNA.
כמו כן, לסנתז תבנית אוליגונוקלאוטיד ספריה אקראית עם 31 עמדות אקראיות. בצינור PCR, מערבבים תבנית ספריה אקראית של דנ"א מיקרומולרית אחת, פריימר קדמי מיקרומולארי המכיל מקדם פולימראז T7 RNA ו פריימר הפוך, טריס 20 מילימולר ב pH שמונה, 1.5 מילימולאר מגנזיום כלוריד, 50 מילימולר אשלגן כלורי, 1 מיקרוגרם למיליליטר אצטיליטר אצטילייטד סרום אלבומין, שתי יחידות של תאק פולימראז, ו 200 micromolar כל אחד dNTPs. הגדר את מכונת PCR עם חמישה מחזורים של denaturation, חישול, שלבי הרחבה, ואחריו מחזור אחד של הרחבה כדי לצרף את האמרגן לספריית ה- DNA.
הגדר תגובת שעתוק 100 מיקרוליטר המכילה מאגר שעתוק T7, דנ"א של מאגר ספריות אקראי של מיקרומולר אחד, DTT חמישה מילימולרים, GTP שני מילימולרים, מילימולרית אחת לכל ATP, CTP ו- UTP, ושתי יחידות למיקרוליטר T7 RNA פולימראז. עכשיו לשים על מגן זכוכית אקריליק וכפפות. הצג רדיואקטיביות על-ידי הוספת 5 מיקרוליטרים או פחות של אלפא-32P UTP לתגובת התמלול לאוטוביוגרפיה.
דגירה תערובת התגובה בצינור microcentrifuge במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס. לטיהור ג'ל RNA, הכינו ג'ל פוליאקרילמיד 10%. טען דגימות לתוך בארות הג'ל.
חשוף את הג'ל לסרט רנטגן, וזהה את מיקום התמלילים על הג'ל וגזור את פרוסת הג'ל. מניחים את פרוסת הג'ל בצינור צנטריפוגה ולשבור לחתיכות קטנות יותר עם קצה homogenizer. מוסיפים חיץ חלבון K כדי לטבול את חתיכות הג'ל.
השאירו את הצינור על מטור במשך שעתיים לפחות בטמפרטורת החדר. ואז לסובב מיקרוצנטריפוגה במהירות גבוהה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את פסולת ג'ל לשחזר את פתרון החיץ. הוסיפו נפח שווה של פנול-כלורופורם לצינור עם העל-טבעי, המערבולת והצנטריפוגה.
חזור על החילוץ עם פנול-כלורופורם עוד פעם אחת ולאחר מכן עם כלורופורם עוד פעם אחת. לאחר מכן, מערבבים את השלב המימי של חיץ proteinase K עם נפח של 1/10 של אצטט נתרן שלוש טוחנות ב pH 5.2, 10 מיקרוגרם של tRNA או 20 מיקרוגרם של גליקוגן, ושניים עד שלושה כרכים של אתנול מאוחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס. השאירו את הצינור במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך שעה.
לסובב את הצינור המכיל את הפתרון במשך חמש עד 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס במיקרוצנטריפוגה. השליכו את העל-טבעי בזהירות, והוסיפו 70% אתנול כדי לשטוף את גלולת ה-RNA. תסתובב במשך שתיים עד חמש דקות.
שאף את האתנול בזהירות, וייבש את גלולת ה-RNA. לאחר מכן, להוסיף 50 microliters של מים שטופלו DEPC כדי לבודד את גלולת RNA. השאירו את הדגימה במינוס 20 מעלות צלזיוס לאחסון.
כדי לאגד חלבון ורנ"א בנפח תגובה של 100 מיקרוליטר, הכינו תחילה טריס הידרוכלוריד 10 מילימולארי ב-pH 7.5 המכיל אשלגן כלורי 50 מ"ל, DTT מילימולר אחד, 09 מיקרוגרם למיקרוליטר סרום בסרום אלבומין, 5 יחידות למיקרוליטר RNAsin, 15 מיקרוגרם למיקרוליטר tRNA, ו EDTA מילימילאר אחד. לאחר מכן הוסיפו 30 מיקרוליטרים של חלבון רקומביננטי PTB ו-10 מיקרוליטרים של רנ"א מהבריכה המתאימה. מניחים את הצינורות המכילים את התגובות מחייב בלוק טמפרטורה במשך כ 30 דקות ב 25 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, חלק את ה- RNA המאוגד מה- RNA הלא מאוגד באמצעות ארבעה סבבים של בחירה והגברה. ראשית, לסנן את מדגם 100 מיקרוליטר בטמפרטורת החדר באמצעות מסנן nitrocellulose מחובר סעפת ואקום. תסביך חלבון ה-RNA נשאר על המסנן.
בעזרת סכין גילוח סטרילי, קוצצים את המסנן לרסיסים, ומכניסים אותם לצינור צנטריפוגה. טובלים את חתיכות המסנן במאגר proteinase K, ומ מניחים אותו על למשך שלוש שעות לפחות או לילה כדי לשחזר את ה- RNA. כדי להפוך את דגימת ה-RNA לדה-פרוטאין, הוסיפו נפח שווה של פנול-כלורופורם, מערבולת ולאחר מכן צנטריפוגה במהירות גבוהה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
להשיג את השלב הממיקי, ולחלץ עם כלורופורם שוב. לאחר מכן, מערבבים את supernatant עם 1/10 נפח של אצטט נתרן שלוש טוחנות ב pH 5.2 ושניים עד שלושה כרכים של אתנול מוחלט. השאירו את הצינור במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה אותו במהירות גבוהה במשך 10 דקות.
חזרו על שלבי הכביסה והביבוש עם 70% אתנול, ובודדו את ה-RNA במים שטופלו ב-DEPC. לאחר הסיבוב הראשון של מבחן איגוד המסנן, לבצע שלושה סיבובים נוספים. לאחר מכן, בצעו שני סבבים של שעתוק, כריכה והגברה כדי להפריד את שברי ה-RNA הקשורים לחלבון מהשברים הלא מאוגדים.
שידנו מראש ג'ל פוליאקרילמיד מקורי של 5% עם יחס אקרילאמיד-ביס-אקרילאמיד של 60 ל-1 במאגר TBE 5x. לאחר מכן הגדר את תגובת קשירה חלבון RNA. מניחים את הג'ל במכשיר אלקטרופורזה מלא חיץ TBE 5x בחדר קר בארבע מעלות צלזיוס.
החל 250 וולט במשך 15 דקות, ואת פיפטה התגובה מחייב לתוך בארות שונות. לאחר מכן לשבר נוסף את RNA מאוגד מן RNA מאוגד על ידי הפעלת אלקטרופורזה ב 250 וולט במשך שעה עד שעתיים. לאחר מכן, לחשוף את הג'ל לסרט רנטגן, ולזהות את המיקום של RNA כבול באמצעות אוטוביוגרפיה.
חותכים את פרוסת הג'ל עם RNA כרוך, ולהכניס אותו לתוך צינור. מרסקים את פרוסת הג'ל, וגורר במאגר proteinase K במשך שלוש שעות או לילה. חזור על החילוץ עם פנול-כלורופורם וכלורופורם כפי שתואר קודם לכן.
לסנתז cDNA מן RNA מומס. הכינו 20 מיקרוליטרים של תגובה, כולל שני מיקרוליטרים של חיץ RT 10x, שני מיקרוליטרים של תעתיק הפוך AMV, מיקרוליטר אחד של פריימר הפוך, חמישה מיקרוליטרים של מים, ו -10 מיקרוליטרים של ה- RNA המומס. דגירה ב 42 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות.
להגביר את cDNA באמצעות 20 עד 25 מחזורי PCR כפי שתואר קודם לכן. חזור על תהליך סינתזת RNA, כריכת חלבון והפרדת שברים הקשורים לחלבון ובלתי מאוגדים. כדי לנתח את כריכת החלבון, השתמשו בהסטת הג'ל או בהסטת כריכת המסנן כדי לקבוע זיקה מחייבת וספניות לבריכות נבחרות או רצפים בודדים בתוך כל בריכה.
השתמש באוטוביוגרפיה או בתמונה של זרחן כדי לזהות ולכרות רצועות בשבר המאוגד ובשבר הלא מאוגד. המשך את הפרוטוקול עם שכפול ויישור רצף. במחקר זה הושגה הגברה מוצלחת של הבחירה.
חלבון מחייב בדרכי פוליפרימידין של יונקים עם ריכוז חלבון גבוה פי 300 מראה בקושי קשירה לבריכה אפס רצף אבל זיקה גבוהה עבור מאגר הרצף שנבחר. הגברה-בחירה זוהתה בהצלחה על חלבונים מחייבי RNA עם אתר מועדף או מחייב קונצנזוס. תוספת של PTB רקומביננטי, אשר נקשר לאתר במעלה הזרם שלושה פריים splice, מוביל להפעלה של אתר splice חלופי או במורד הזרם שלוש פריים.
לעומת זאת, תוספת של hnRNP C רקומביננטי מוביל לדיכוי של שני אתרי splice שלושה ראשים. תוספת של גורם שיפוש כללי רקומביננטי U2AF65 הפך את hnRNP C-מתווך שלושה ראשים באתר דיכוי אתר splice. חשוב לזכור כי ספרייה אקראית טובה ותנאים מחייבים נאותים ה שמעניקים העשרה גבוהה בכל שלב מחייב נחוצים להצלחה.
ניתן להשתמש בבדיקות תפקודיות מתאימות ובבדיקות in vivo כדי לאמת את תוצאת גישה זו. בתחום ביטוי הגנים, פונקציות של חלבונים רבים נחקרו באמצעות טכניקה זו. חשוב להשתמש בכפפות וחותם רדיואקטיבי להגנה תוך כדי עבודה עם פוליאקרילמיד ורדיואקטיביות.
