טכניקה זו מאפשרת כימות מדויק ומדויק של מיקרואורגניזמים מאוכלוסייה מעורבת של זנים דומים מאוד באמצעות טכניקות מהירות וגבוהות המבוססות על תפוקה מולקולרית. בסופו של דבר, המאפשר השוואות של כושר להיעשות בין זנים. היכולת להעריך בו זמנית זנים רבים בבריכה אחת מפחיתה באופן משמעותי את השונות בין אורגניזם לאורגניזם היטב או אורגניזם, מכיוון שכל הזנים נחשפים בדיוק לאותם תנאים.
יכולת ההסתגלות של טכניקה זו מאפשרת להשתמש בה כמעט עבור כל אורגניזם גנטי וכמעט כל תכנון ניסיוני הדורש כימות מדויק של מיקרואורגניזמים. התחל הליך זה עם הנדסה של סמנים גנטיים על כרומוזומים חיידקיים, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. צור מאגר של דנ"א גנומי המכיל כל ברקוד פרט לאחד.
השתמש בבריכה זו כדי לבצע סדרת דילול עם DNA גנומי המכיל את הברקוד היחיד שנותר. הכינו את התגובות ל-PCR דיגיטלי בכפילות בהתאם להמלצות היצרן לשימוש ב-PCR דיגיטלי supermix המיועד לכימיה מבוססת בדיקה. השתמש בדנ"א הגנומי המפולג כדנ"א של תבנית.
כמו כן, הוסף את 20 X פריימר בדיקה מאסטר לערבב כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הכן שכפול תגובות בקרה עבור PCR דיגיטלי בהתאם להמלצות היצרן. תגובות בקרה עבור כל תערובת בדיקה חייבות להיות מורכבות מפקדי תבנית, פקדים שליליים ופקדים חיוביים.
חזור על שלבים אלה כדי ליצור תגובות PCR דיגיטליות עבור כל דגימת DNA גנומי ברקוד. צור טיפות עבור כל מצב תגובה באמצעות גנרטור טיפה, על פי הוראות היצרן. העבר טיפות שנוצרו לאחרונה לתוך צלחת 96 באר המתאים.
השתמש ב-200 טיפים לפיפיות מיקרוליטר על פיפסה מרובת ערוצים של 5 עד 50 מיקרוליטר. לאחר שכל טיפות נוצרו והועברו, לאטום את הצלחת עם איטום צלחת נייר כסף. השתמש ברכיב האופניים התרמי המומלץ על-ידי היצרן כדי לבצע את תנאי הרכיבה.
בעת ביצוע התרמוצ'ילי, תכנת את תוכנת ניתוח הנתונים עם מידע הגדרת הלוח, כגון שם לדוגמה, סוג ניסוי ו- Supermix בשימוש. כלול גם שם יעד 1 וסוג יעד 1, כמו גם שם יעד 2 וסוג יעד 2. לאחר השלמת התרמוצ'ילי, העבר את התגובות שהושלמו לקורא טיפות והתחל את תהליך הקריאה, בהתאם להוראות היצרן.
לאחר שכל בארות נקראו וההפעלה הושלמה, פתח את קובץ הנתונים של QLP באמצעות תוכנת ניתוח הנתונים. בחר את כל הבארים לנצל את אותו גשוש פריימר Mastermix. בכרטיסיה Droplets, בדוק את מספר טיפות המנותחות בכל באר, כולל טיפות חיוביות ושליליות.
אל תכלול בניתוח באר שהיא פחות מ- 10,000 טיפות סה"כ. עבור ללשונית משרעת 1D ולבחון את משרעת של טיפות חיוביות ושליליות. ודא שהם מהווים 2 אוכלוסיות נפרדות.
בתוך התוכנה, השתמש בתכונת הסף כדי לבצע ניתוק בין טיפות חיוביות ושליליות עבור כל בדיקה שנוצלה. לאחר החלת הסף המתאים על כל בארות, התוכנה תחשב את מספר עותקי ה- DNA בכל תגובה. יצא נתונים לגיליון אלקטרוני כדי להקל על ניתוח נוסף.
באמצעות ערכים אלה, חשב את מספר העותק ההתחלתי של כל ברקוד גנומי ייחודי בדגימה. קבע את שיעור החיובי הכוזב הממוצע מתגובות הבקרה השלילית והחסיר ערך זה מהערכים המתקבלים בתגובות ניסיוניות. הכפל את הערכים לפי הצורך, בהתבסס על הדילולים שבוצעו בעת הגדרת כל ניסוי.
עכשיו, לקבוע את הכושר היחסי של אורגניזם על ידי חישוב המדד התחרותי או בוטל מדד תחרותי מתוך כימות מבוסס PCR דיגיטלי של הזן ברקוד. בצע שלב זה עבור כל זן מקודד בכל נקודות הזמן. דנ"א גנומי המכיל את הברקוד של AA היה מדולל ברקע של כל הדנ"א הגנומי הברקודי האחר.
ערוץ 1 מייצג את בדיקה FAM עבור ברקוד AA, בעוד ערוץ 2 מייצג את החללית HEX עבור ברקוד AO. התוצאות של כל בדיקה מוצגות הן משרעת פלואורסצנטי טיפה בודדת היסטוגרמה המייצגת את התדירות של עוצמת פלואורסצנטי של כל טיפות בארות שנבחרו. עבור כל תנאי, טיפות חיוביות ושליליות צריכות ליצור 2 אוכלוסיות נפרדות.
יש להפריד בין האוכלוסיות באמצעות תכונת הסף כדי להגדיר טיפות חיוביות ושליליות. ערכי הסף ישתנו בהתאם לבדיקות ששימשו, אבל כל בארות לנצל את אותו תערובת בדיקה צריך להיות סף זהה. במקרה של AA כי היה מדולל, ההיסטוגרמה נראה רק לתאר את האוכלוסייה הבודדת כי טיפות חיוביות הם בנחיתות מספרית באופן משמעותי על ידי טיפות שליליות.
עם זאת, 2 אוכלוסיות נפרדות עדיין נראות לעין על ידי בחינת משרעת פלואורסצנטי טיפה בלוחות השמאליים. כמו DNA גנומי ברקוד AA היה מדולל, חלה ירידה טיפות חיוביות, בעוד מספר טיפות AO חיובי נשאר קבוע. לאחר החלת סף מתאים על כל בארות התוכנה תחשב את מספר עותקי ה- DNA בכל תגובה.
אם אתה מבצע PCR באופן שגרתי כחלק מהמחקר שלך, אתה יכול לבצע טכניקה זו כדי להעריך את הכושר של האורגניזם המודל שלך. הליך זה ישמש בדרך כלל כדי לקבוע את התוצאות הסופיות של ניסויים במעלה הזרם. התועלת האמיתית שלה היא לקדם קלות ורבגוניות עבור כל ניסויים המסתמכים על כימות חיידקים.
אנו משתמשים בטכניקה זו כדי להעריך את כושר סלמונלה במודל מורין של זיהום. בנוסף, טכניקה זו מותאמת לשימוש עם מיקרואורגניזמים פתוגניים אחרים במעבדה שלנו.
