כפי שאנו כבר יודעים, microenvironment הגידול הוא חלק חיוני של צמיחת סרטן פלישה. כדי לחקות התקדמות קרצינומה, אנחנו צריכים מטריצת גידול אנושית רלוונטית ביולוגית. זוהי מטריצת הגידול האנושית היחידה המבוססת על תצהירים של פלישת ויטרו.
בהשוואה להנחיה הכדורית הקלאסית, שיטה זו אינה רגישה לטמפרטורה ולא דורשת העברה כדורית. טכניקה זו מתאימה לדגימות סרטן מוצקות שמקורן בחולה כגון קרצינומה של הראש והצוואר והוא יכול להאריך לכיוון רפואה מותאמת אישית כולל טיפולים chemoradiation. מטריצה אנושית זו המבוססת על גידולים כבר שימשה עבור מספר יישומים, כולל בדיקות סמים בתפוקה גבוהה, ניתוח תאים חיים, ריפוי פצעים ומסיונות העברה.
השלב הרגיש ביותר מבחינה טכנית הוא הטיפול של השיטה של פיברינוגן מתווסף אז ייתכן שתרצה תחילה לתרגל שלב זה עם בארות ריקות. חשוב להראות את הטיפול הנכון של המטריצה וזה קל לנתח על ידי הצגת השיטה חזותית. עבור ייצור כדורית גידול רב תאי, לוותר פעם אחת 10 לתאים השלישיים משורה התא של עניין 50 microliters של מדיום שלם לתוך כל באר של 96 גם אולטרה נמוך מצורף עגול למטה צלחת.
לאחר מכן מניחים את הצלחת לתוך 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני תא תרבות החממה במשך ארבעה ימים לפני חזותית אישור היווצרות כדורית הגידול עם מיקרוסקופ הפוך. כדי להקים מוצנת פלישה תלת מימדית לספרואידים, הפשיר מטריצה אנושית שמקורה במיומה על קרח והפשרת תווי פיברינוגן באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. כאשר בריאגנטים התחממו, מערבבים יחד את הכרכים המתאימים של מטריצה בינונית, אנושית שמקורה במיומה, טרומבין, אפרוטינין ופיברינוגן, ומוסיפים את הפיברינוגן רגע לפני חלוקת תערובת המטריצה לתאים.
מיד להוסיף 50 microliters של הג'ל וכתוצאה מכך לתוך כל באר של צלחת התרבות ספרואיד, מכוון את הקצה לכיוון הקיר הפנימי של כל באר צינור האטה מבלי להזיז את הכדורית ממרכז הבירה. מאז פיברינוגן מתחיל ג'ל לאחר כמה דקות, זה דורש צינורות הפוכים חזקים אך מדויקים ואת הטיפול של רק כמה בארות בכל פעם. מחזירים את הצלחת לאנקובטור תרבות התאים למשך 30 דקות כדי לאפשר לג'ל פיברין המטריצה האנושי המופק ממיומה להתגבש לפני הוספת עדין של 100 מיקרוליטרים של מדיום שלם לראש כל ג'ל.
אז תדמיין את הפלישה הכדורית מדי יום. לפילוח תמונות עם ilastik, פתחו את תוכנת סיווג התמונות והפילוח של התמונה בקוד פתוח ובחרו 'סיווג פיקסלים'. שמור את פרויקט אילסטיק למחשב.
הפיקסלים יסווגו בהתבסס על ביאורים שנעשו על ידי המשתמש. לחץ על נתוני קלט והוסף חדש כדי לבחור תמונות לניתוח. עבור בחירת תכונות, לחץ על בחירת תכונות ובחר תכונות.
לחץ על התיבות המתאימות כדי לבחור את התכונות המעניין. התיבות שנבחרו יהפכו לירוקות. לצורך אימון, לחץ על הדרכה.
במקטע הדרכה, צריכות להיות שתי תוויות, תווית 1 ותווית 2. סמן את הרקע באמצעות אחת התוויות וסמן את התאים בתווית האחרת. לאחר שסומנו כל התאים והרקע בתמונה הראשונה, בחר את התמונה הבאה מהתצוגה הנוכחית כדי להמשיך לסמן את התאים והרקע עד לסימן 10% מהתמונות.
לאחר מכן בחרו 'עדכון חי' כדי לנתח את כל התמונות. לאחר השלמת האימון ו ilastik ניתח את כל התמונות, לחץ על חיזוי ייצוא ובחר פילוח פשוט מהמקור. לאחר מכן בחרו בתבנית קובץ הפלט הרצויה מתוך 'בחר 'ייצוא קביעות תמונה' ולחצו על 'יצא הכל' לייצוא תוצאות התיוג.
הקבצים ייוצאו לאותה תיקיה עם התמונות המקוריות. לניתוח אזור, פתחו תחילה את התמונה המקורית עם סרגל קנה מידה בפיג'י ImageJ, ודאגו שהגודל והממד של התמונה יהיה זהים לגודלם וממדם של התמונות שנותחו. השתמש בכלי בחירת הקו כדי לצייר קו באורך ידוע ולחץ על נתח והגדר קנה מידה.
לאחר מכן הגדר את המרחק הידוע בשדה מרחק ידוע. הגדר את היחידה המתאימה ולחץ על כללי. כדי להתקין את התוסף ilastik, לחץ על עזרה ועדכון ולחץ על נהל אתרי עדכון בחלון מעדכן ImageJ.
לחץ ליד ilastik, סגור והחל שינויים. לאחר מספר דקות, יופיע חלון מידע המעודכן בהצלחה. לחץ על אישור והפעל מחדש את ImageJ.
לאחר מכן, לחץ על תוספים, פקודות מאקרו והתקנה ובחר את המונה. קובץ ijm. לאחר מכן לחץ על פתח.
כדי להשלים את ניתוח האזור, לחץ על תוספים וגלול כדי לבחור ilastik. בחרו 'ייבוא HDF5' ובחרו את הקובץ בתבנית h5. לחץ על פתח וטען והחל טבלת בדיקת מידע.
לאחר מכן לחץ על לחצן A בלוח המקשים והמ אזור יופיע בחלון הסיכום כאזור הכולל. בניסוי מייצג זה, ארבעה ימים לאחר זריעת קו קרצינומה של תאים קשקשיים גרורתיים, מטריצה נוספה על כדוריות נוצר כפי שהוכח הפלישה היה במעקב יומי על מיקרוסקופ הפוך. לאחר שהוטמעו, תאים במטריצת הפיברין האנושית שמקורה במומה החלו לפלוש במהירות לאחר יום אחד והתרחבו למטריצה ביומיים הבאים.
תאים במטריצה המופקת מסרקומה של העכבר לא פלשו למטריצה שמסביב, אלא יוצרים מבנה א-סימטרי. תאים בקולגן פלשו מעט אך בשל התכווצות מטריצה הניתוח נעשה קשה. בכמה בארות, הכדורים אפילו נעלמו אחרי שלושה ימים.
כאן, כימות הפלישה של תא ראשוני גרורתי גרורתי קרצינומה של תאים קשקשיים במטריצת פיברין שמקורה במומה האנושית מוצגת. ניתוח תאי חי של פלישת כדורית מטריצת פיברין שמקורה במיומה אנושית חושף תנועת תאים בגדילים לאורך המטריצה ואחריה תאים אחרים לאורך זמן. זכור להיזהר לא להזיז את הכדוריד מהמיקום המרכזי בעת הוספת המטריצה לבאנות.
הליך זה יכול לשמש כדי ללמוד כיצד הקרנה ומולקולות ספציפיות כגון תרופות לסרטן להשפיע על הפלישה. התאים יכולים להיות קבועים מוכתמים למחקרים הבאים. במודל הסרקומה של העכבר הקלאסי, התאים מתרבים בעיקר וההיבט של הפלישה הוא מינימלי.
מטריצה אנושית זו המבוססת על גידול גורמת לפלישה, מה שהופך את מחקרי העיכוב ליעילים יותר.
